We assessed the effects of combination therapy with LPD and EX. We also assessed the effects of a combination of these therapies and the angiotensin U

原 著

5/6腎 摘 除 慢 性 腎 不 全 モ デ ル ラ ッ トの 血 圧,腎

機 能

お よ び 腎病 変 に対 す る長 期 的 運 動,低

タ ンパ ク食,

ア ン ジ オ テ ン シ ン Ⅱ受 容 体 拮 抗 薬 の 併 用 効 果

佐々木裕子 

金 澤 雅 之 

伊 藤

修 

上 月 正 博

Renoprotective and antihypertensive effect of combination therapy with a low protein diet, long-term exercise and angiotensin ‡U receptor antagonist in rats with renal ablation

Yuko SASAKI, Masayuki KANAZAWA, Osamu ITO, and Masahiro KOHZUKI

Department of Internal Medicine and Rehabilitation Science, Tohoku University Graduate School of Medicine, Miyagi, Japan

要 旨 目 的:低 タ ンパ ク 食(LPD)は 尿 毒 症 症 状 を軽 減 させ る が,栄 養 状 態 の 悪 化 や 筋 力 低 下 を 招 く可 能 性 も あ る。 一 方_{,長 期 的 運 動(EX)は 栄 養 状 態,筋 力 を改 善 さ せ,腎 保 護 効 果 を 有 す る可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る 。 そ こ で,} 慢 性 腎 不 全 モ デ ル ラ ッ トでLPDとEXと の 併 用 効 果 を検 討 し,さ ら に,腎 保 護 効 果 を 有 す る ア ン ジ オ テ ン シ ン Ⅱ 受 容 体 拮 抗 薬(OLS)併 用 に よ る 増 強 効 果 を検 討 し た 。 方 法:WKYラ ッ ト に5/6腎 摘 を 行 い,5/6腎 摘 除 腎 不 全 モ デ ル を 作 製 し,A)普 通 食(NPD)群,B) NPD＋EX群,C)LPD群,D)LPD＋EX群,E)LPD＋EX＋OLS群,F)Sham群 の6群 に 分 け,12週 間 治 療 し た 。2週 間 毎 に収 縮 期 血 圧(SBP),尿 蛋 白 排 泄 量(UP)を 測 定 し,最 終 日 に 断 頭 採 血 し,血 清 ク レ ア チ ニ ン(Scr),血 液 尿 素 窒 素(BUN)を 測 定 した 。 ま た,残 存 腎 のPAS染 色,EM染 色,免 疫 染 色 を行 い,糸 球 体 硬 化 指 数(IGS),相 対 的 間 質 容 積(RIV),糸 球 体 内ED-1発 現 細 胞 数 を 算 出 し た 。

結 果:NPD群 に比 較 して,LPD群 のUP,Scr,BUN,IGS,RIV,さ ら にNPD＋EX群 のSBP,BUN,IGS,RIV は 有 意 に低 値 を示 し た 。NPD群 に比 較 し て,LPD＋EX群 の 糸 球 体ED-1発 現 細 胞 数 は有 意 に 低 値 を 示 し た 。 NPD＋EX群 に比 較 して,LPD＋EX群 のUP,BUN,IGS,RIVは 各 々 有 意 に 低 値 を示 し た 。 さ ら に,LPD＋ EX＋OLS群 のUPは 他 の 腎 摘 群 に比 較 し て 有 意 に 低 値 を 示 し,SBPは 他 の 全 群 に比 較 し て も 最 も 低 値 で あ っ た 。

結 論:LPDとEX単 独 の 腎 保 護 効 果 と,LPD,EX併 用 に よ る 腎 保 護 効 果 の 増 強 作 用 が 示 唆 さ れ た 。 特 に, LPD＋EXへ のOLSの 併 用 はUP減 少 効 果,間 質 増 殖 抑 制 効 果 を 増 強 し,腎 機 能 の 指 標 で あ るScr,BUNを 増 悪 さ せ る こ とな く慢 性 腎 不 全 モ デ ル ラ ッ トの 高 血 圧 を改 善 さ せ た 。

A low-protein diet (LPD) has been prescribed to alleviate uremic symptoms, and to delay the

aggravation of chronic renal failure (CRF). However, it has been suggested that LPD treatment causes

malnutrition and attenuation of muscle power. On the other hand, it also has been suggested that

appropriate long-term exercise training (EX) may lead to improvement of the physical fitness and quality of life (QOL) in patients with CRF. However, there is no definitive conclusion as to whether EX has any renal protective effect or not.

佐 々 木 裕 子  他3名  5

We assessed the effects of combination therapy with LPD and EX. We also assessed the effects of a combination of these therapies and the angiotensin ‡U receptor antagonist, olmesartan (OLS).

Male Wistar-Kyoto rats that were five-sixth-nephrectomized were divided into 6 groups;1) normalprotein diet (NPD);2) NPD and EX with treadmill running (1 h/day, 5 days/week for 12 weeks) (NPD+EX);3) LPD;4) LPD+EX;5) LPD+EX with OLS (10 mg/kg/day for 12 weeks) (LPD+EX+OLS); and6) Sham-operated(S).

Systolic blood pressure(SBP) in the NPD+EX, LPD+EX, LPD+EX+OLS, and S groups was significantly lower than in the NPD group. Moreover, SBP in the LPD+EX+OLS was significantly lower than in all the other groups. LPD, LPD+EX, and LPD+EX+OLS induced a significant decrease in UP, Scr and BUN compared with the NPD group. UP in the LPD+EX, LPD+EX+OLS, and S groups was significantly lower than in the LPD group. The index of glomerular sclerosis (IGS) and relative interstitial volume(RIV) in the NPD+EX, LPD, LPD+EX, LPD+EX+OLS, and S groups were significantly lower than the values in the NPD group. IGS and RIV in the LPD, LPD+EX, LPD+EX+OLS, and S groups were significantly lower than the values in the NPD+EX and LPD groups. Glomerular ED-1 positive cells in the LPD+EX, LPD+EX+OLS, and S groups was significantly fewer than in the NPD groups.

These results indicate that LPD and EX have renoprotective effects, and suggest that the combination therapy with LPD and EX provides greater renoprotective effects than LPD alone. Moreover simultaneous treatment of OLS and LPD+EX provides greater antihypertensive and antiproteinuric effects than treatment with LPD+EX.

Jpn J Nephrol 2006; 48:4-13. Key words: renoprotective and antihypertensive effects, low-protein diet, exercise, angiotensin ‡U

rece-ptor antagonist, rat

緒 言

低 タ ンパ ク食(low protein diet: LPD)は 慢 性 腎 不 全 の 進 行 を 抑 制 し,腎 保 護 作 用 を 有 す る こ と が 報 告 さ れ て い る1,2)。し か し そ の一 方 で,LPDは 栄 養 状 態 を低 下 させ, 筋 量 の減 少 や 筋 機 能 の 減 弱 を引 き起 こす 危 険 性 が 指 摘 され て い る3,4)。ま た,腎 機 能 障 害 者 で は,体 液 異 常,貧 血, 血 行 動 態 異 常,心 機 能 低 下 な どが 生 じ,長 期 間 の 安 静 に よ る廃 用 と相俟 っ て 運 動 耐 容 能 や 生 活 の 質(quality of life: QOL)の 低 下 が み られ る よ う に な る こ とが 少 な くな い5)。 一 方_{,近 年 にな り,適 度 な運 動 は 腎機 能 障 害 者 に お い て} 体 力 やQOLの 向上,糖 や 脂 質 代 謝 の 改 善 な ど の メ リ ッ ト を もた ら す可 能 性 が あ る た め,活 動 を過 度 に制 限 す べ きで はな い こ とが 示 唆 さ れ て い る6)。す な わ ち,運 動 に よ り筋 量,筋 機 能,栄 養 状 態 が 改 善 した り腎 が 保 護 さ れ る可 能 性 が 示 唆 され て い る3)。しか しな が ら,運 動 中 に 腎 血 流 量 や 糸 球 体 濾 過 量 が 減 少 し7,8),そ れ に よ っ て 腎 機 能 障 害 が 増 悪 す る危 険 性 が 示 唆 さ れ て い る。 した が っ て,腎 機 能 障 害 者 に お い て は運 動 が 腎 に及 ぼ す 影 響 を考 慮 しな けれ ば な ら な い が,腎 機 能 障 害 者 の体 力 を増 強 し,腎 を保 護 す る至 適 運 動 に関 す る定 説 は まだ な い 。 ま た 腎 不 全 モ デ ル 動 物 に お い て も,運 動 が 腎 保 護 効 果 を有 す る か 否 か に つ い て 検 討 し た成 績 は少 な く,現 時 点 にお い て,運 動 に よ る腎 保 護 作 用 の有 無 に つ い て は ま だ.__.定の 結 論 を み て い な い 。 と こ ろで,慢 性 腎 不 全 治 療 に お い て は血 圧 の コ ン トロー ル や レ ニ ン ・ア ン ジ オ テ ン シ ン系 の抑 制 も重 要 で あ る こ と が 示 唆 され て い る9∼11)。降 圧 薬 で は,ア ン ジ オ テ ン シ ン Ⅱ (Ang Ⅱ)受 容 体 拮 抗 薬(ARB)が 慢 性 腎 不 全 患 者 や 腎 不 全 モ デ ル 動 物 で 降 圧 お よび 腎 保 護 作 用 を 有 す る こ と が 示 さ れ12∼16),汎用 さ れ つ つ あ る 。 しか し,LPD, Ang Ⅱ作 用 の 抑 制,血 圧 コ ン トロ ー ル の い ず れ の単 独 療 法 にお い て も, そ の 腎保 護 効 果 は な お完 壁 な もの で は な く,よ り強 力 な 治 療 法 の確 立 が 急 務 とな っ て い る。 これ ら は,い ず れ も異 な る作 用 機 序 で 腎保 護 作 用 を 発 揮 す る可 能 性 が あ るた め,併 用 療 法 に よ る 腎保 護 作 用 の増 強 に期 待 が 持 た れ て い る が, これ らの併 用 に よ る腎 保 護 効 果 に 関 して は まだ十 分 な検 討 が な さ れ て い な い 。 そ こで,5/6腎 摘 除 慢 性 腎 不 全 モ デ ル ラ ッ トを 用 い て, そ の血 圧,腎 機 能 お よび 腎 病 変 に対 す るLPDと 長 期 的 運 動(EX)の 併 用 効 果 を検 討 し た。 さ ら に,LPDお よ びEX にARBを 併 用 す る こ との 有 用 性 に つ い て も検 討 し た 。 対 象 と 方 法 1. 5/6腎 摘 除 慢性 腎 不 全 モ デ ル ラ ッ トの 作 製 雄 性Wistar-Kyoto(WKY)ラ ッ ト(日 本 チ ャ ー ル ズ リ バ ー 株 式 会 社,横 浜)を 用 い た 。 8週 齢 の ラ ッ トを ジエ チ ル エ ー テ ル(和 光 純 薬 株 式 会 社,

仙 台)で 麻 酔 し,側 腹 切 開 に て 右 腎 を 露 出 し た 。 次 い で, 右 腎 の 上 極 側1/3お よ び 下 極 側1/3を 結 紮 し て 閉 腹 し た 。 9週 齢 に 再 び ジ エ チ ル エ ー テ ル で 麻 酔 し,左 腎 を 全 摘 し て 閉 腹 し た 。 偽 手 術(Sham)群 は 同 週 齢 に 両 腎 の 露 出 の み を 行 っ た 。 ラ ッ ト は す べ て 代 謝 ケ ー ジ(model-ST,杉 山 元, 東 京)で 飼 育 し,温 度(22±2℃),湿 度(55±10％)と 明 暗 時 間(12時 間 サ イ ク ル)を 一 定 に し た 。 ラ ッ ト に は 普 通 食 (normal protein diet: NPD)と し て ノ ー サ ン ラ ボMRス ト ッ ク(タ ン パ ク 質18.3w％,Na 0.18w％,K 1.13w％,日 本 農 産 工 業 株 式 会 社,横 浜)と 水 道 水 を 自 由 に 与 え た 。 左 腎 摘 出1週 間 後(10週 齢)に,体 重(BW),尾 動 脈 収 縮 期 血 圧(SBP),尿 量 お よ び24時 間 尿 蛋 白 排 泄 量(UP)を 測 定 し,LPD,EX,薬 剤 投 与 開 始 前 の 基 準 値 と し た 。 2.  方 法 10週 齢 の5/6腎 摘 ラ ッ ト を 無 作 為 に 以 下 の5群;A) NPD群(n＝9),B) NPDとEX併 用 群(NPD＋EX,n＝ g),C) LPD群(n＝13),D) LPDとEX併 用 群(LPD＋ EX,n＝12),E) LPDとEXとolmesartan併 用 群 (LPD＋EX＋OLS,n＝10)に 分 け た 。 こ れ ら5群 にNPD で 飼 育 しOLS投 与 お よ びEXを 行 わ な いSham群(n＝10) を 加 え た 計6群 に つ い て,以 後12週 間 に わ た る 治 療 を 行 っ た 。 ま た,2週 間 毎 にBW,SBP,UPを 測 定 し た 。 LPD治 療 群 の 飼 料 は,治 療 開 始 時 よ り ラ ボMRプ ロ テ イ ン12(タ ン パ ク 質12.6w％,Na 0.26w％,K 0.82w％,日 本 農 産 工 業 株 式 会 社,横 浜)に 変 更 し た 。 3.  EXと 薬 物 療 法 EXは,ラ ッ ト用 ト レ ッ ド ミル 装 置(KN-73,株 式 会 社 夏 目 製 作 所,東 京)を 用 い た 走 行 を,傾 斜 角0度,20m/ 分 の 速 度 で1日60分 間,週 に5日 問 の 頻 度 で,12週 間 に わ た っ て 行 っ た 。 OLS(10mg/kg/day)は,投 与 直 前 に0.5％ カ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス(carboxymethyl cellulose sodium salt,和 光 純 薬 株 式 会 社,仙 台)に 懸 濁 し,12週 問 に わ た っ て 連 日午 前9時 に ゾ ン デ に よ り 強 制 的 に 経 口 投 与 し た 。OLS非 投 与 群 に は 溶 媒 の み を 与 え た 。 4.  測 定 SBPは,ラ ッ ト 用 尾 動 脈 非 観 血 的 血 圧 測 定 装 置 (UR1000,株 式 会 社 エ ル ク エ ス ト,東 京)を 用 い て,無 麻 酔 下 で 覚 醒 中 の 一 定 時 刻(13∼15時)に 測 定 し た 。 こ の 方 法 を 用 い て 測 定 し たSBPは 直 接 法 を 用 い て 測 定 し た 値 と 良 好 な 相 関 関 係 に あ る17)。本 研 究 で はWKYラ ッ トを 使 用 し た が,Sham群 のSBPが 少 し 高 め に 測 定 さ れ た 。 そ の 点 に つ い て は 購 入 し た ラ ッ ト の 血 圧 が 元 々 高 め で あ っ た た め と 考 え ら れ,ま た,他 の 論 文18)で も こ の よ う な ラ ッ ト を 使 用 し て い た た め,計 測 者 の 統 一,計 測 時 間 の 一 定 化,計 測 機 器 な ど,検 査 の 仕 方 に 問 題 は な い と判 断 し た 。 治 療 開 始 よ り12週 間 後 に ラ ッ ト を 断 頭 に よ り 屠 殺 し, 血 液 を ポ リ エ チ レ ン チ ュ ー ブ に 採 取 し た 。4℃ で 遠 心 (3,000rpm,15分 間)し,そ の 上 清 を 自 動 分 析 器

(Synchron Clinical System CX7, Beckman Coulter Inc., USA)を 用 い て 測 定 し,血 清 ク レ ア チ ニ ン(Scr),血 液 尿 素 窒 素 濃 度(BUN)を 求 め た 。 ま た,同 測 定 器 を 用 い てUP を 測 定 し た 。 5.  腎 の 組 織 学 的 検 討 残 存 腎 を 摘 出 し,そ の 一 部 を10％ 中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン 液(和 光 純 薬 株 式 会 社,仙 台)で 固 定 後,パ ラ フ ィ ン 包 埋 し た 。 次 い で3μm厚 の 切 片 を 作 製 し,periodic acid-Schiff (PAS)染 色,Elastica-Masson(EM)染 色 を 行 っ た 。 PAS染 色 切 片 を200倍 の 光 学 顕 微 鏡(BX51,オ リ ン パ ス 光 学 工 業 株 式 会 社,東 京)で 観 察 し,以 下 の よ う に 定 性 的 に 糸 球 体 硬 化 指 数(index of glomerular sclerosis: IGS)を 算 出 し た19)。 す な わ ち,1切 片 当 た り100∼150個 の 糸 球 体 を 観 察 し,硬 化 病 変 を 認 め な い も の をGrade 0と し た 。 ま た,糸 球 体 全 体 の25％ 未 満 の 硬 化 巣 の 存 在,ま た は 毛 細 血 管 係 蹄 と ボ ー マ ン 嚢 に 明 ら か な 癒 着 が 存 在 す る も の を Grade 1,25％ 以 上50％ 未 満 の 硬 化 の も の をGrade 2, 50％ 以 上75％ 未 満 の 硬 化 の も の をGrade 3,75％ 以 上 の 硬 化 の も の をGrade 4と し た 。 次 い で,以 下 の 計 算 式 を 用 い てIGSを 算 出 し た 。 IGS＝(1×N1＋2×N2＋3×N3＋4×N4)/(N0＋N1＋N2＋N3＋N4) こ こ で,Nは 各Gradeを 呈 し た 糸 球 体 の 個 数 で あ る 。 次 に,EM染 色 切 片 を カ ラ ー イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー (SP500F,オ リ ン パ ス 光 学 工 業 株 式 会 社,東 京)で 解 析 し, 糸 球 体,血 管,尿 細 管 を 除 外 し た,皮 質 に お け る 間 質 の 割 合 を 計 測 し た 。 1切 片 当 た り20カ 所 に つ い て 計 測 し,そ の 平 均 値 を 相 対 的 間 質 容 積(relative interstitial volume: RIV)と し た 。

次 に,immunoperoxidase法20)に よ る 免 疫 染 色 を 行 い, 残 存 腎 を95％ エ タ ノ ー ル で 固 定 し た 。 パ ラ フ ィ ン 包 埋 し, 次 い で2μm厚 の 切 片 を 作 製 し,ス ラ イ ド グ ラ ス(シ ラ ン コ ー テ ィ ン グ ス ラ イ ド,DAKO・Japan株 式 会 社,京 都)に 固 定 し た 。 次 い で,100％ キ シ レ ン 中 で パ ラ フ ィ ン を 除 去 し た 後,純 エ タ ノ ー ル に 浸 し た 。 次 に,0.1mol/lリ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(phosphate-buffered saline: PBS)中 で 振 盪 し た 。 次 い で,Fluorescein Isothiocyanate Isomer 1 (FITC)-conjugated mousemonoclonal anti-ED-1

anti-佐 々 木 裕 子  他3名  7 body(ED-1,SerotecInc.,Oxford)を 一 次 抗 体 と し て37℃ で60分 間 反 応 さ せ た 。 抗 体 はPBSで200倍 に 希 釈 し,非 特 異 的 結 合 を 阻 止 す る た め に5％ ヒ ツ ジ 血 清 を 加 え た 。 切 片1枚 に つ き200μlの 一 次 抗 体 を 反 応 さ せ た 後,切 片 を PBSで 洗 浄 し,次 い で 二 次 抗 体 を37℃ で30分 間 反 応 さ せ た 。 二 次 抗 体 に は 抗 マ ウ スENVISION(DAKO

ENVISIONTM＋ System HRP Rabbit, DAKO, Carpinteria, USA)を 使 用 し た 。 次 い で,3,3-diaminobenobenzidine, tetrahydrochloride (DAB)液(和 光 純 薬 株 式 会 社,大 阪)で 発 色 さ せ た 後,水 洗 し ヘ マ ト キ シ リ ン に て 染 色 し た 。 染 色 切 片 を200倍 の 光 学 顕 微 鏡(BX51,オ リ ン パ ス 光 学 工 業 株 式 会 社,東 京)で 観 察 し,一 切 片 当 た り の 糸 球 体 内ED-1発 現 細 胞 数 の 平 均 値 を 求 め,糸 球 体 内 に 浸 潤 し た マ ク ロ フ ァ ー ジ の 指 標 と し た 。 6.  統 計 解 析 結 果 は す べ てmean±SEMで 示 し た 。BW,SBP,UPの 各 群 間 の 変 動 の 有 意 差 の 有 無 は,repeated measures

analy-sis of variance (ANOVA)で 評 価 し,差 異 を 認 め た 場 合 に は個 々 の 平 均 値 問 の 有 意 差 の 有 無 をBonferroni/Dunn test で 評 価 し た 。Scr,BUN,RIV,糸 球 体ED-1発 現 細 胞 数 の 各 群 間 の 変 動 の 有 意 差 の 有 無 はone way ANOVAで 評 価 し,差 異 を 認 め た 場 合 に は 個 々 の 平 均 値 問 の 有 意 差 の 有 無 をBonferroni/Dunn testで 評 価 し た 。IGSの 各 群 間 の 変 動 の 有 意 差 の 有 無 はKruskal-Wallis testで 評 価 し,差 異 を 認 め た 場 合 に は 個 々 の 平 均 値 問 の 有 意 差 の 有 無 をBonfer-roni/Dunn testで 評 価 し た 。p＜0.05を も っ て 統 計 学 的 に 有 意 の 差 異 と し た 。 統 計 計 算 に はSPSS ver. 11.5J(SPSS Japan Inc.,東 京)を 用 い た 。 本 研 究 の プ ロ ト コ ー ル は 医 学 生 理 学 的 研 究 に 関 す る 国 際 指 針 の 勧 告 の 趣 旨 に 沿 っ た も の で あ り,東 北 大 学 大 学 院 医 学 系 研 究 科 動 物 実 験 委 員 会 の 承 認 を 得 た 。 結 果 治 療 開 始 前 のBW,SBP,UPの 値 に は 各 腎 摘 群 間 に 有 意 差 を 認 め な か っ た 。 12週 間 の 実 験 期 間 に お け るBWの 変 化 をFig.1に 示 す 。 全 群 のBWは 経 時 的 に 増 加 し た 。 各 腎 摘 群 のBWに は 実 験 期 間 を 通 し て 有 意 差 を 認 め な か っ た 。 飼 料 の 摂 取 重 量 に お い て も 群 間 に 有 意 な 差 異 を 認 め な か っ た 。 12週 間 の 実 験 期 間 に お け るSBPの 経 時 的 変 化 をFig.2 に 示 す 。NPD群 のSBPは12週 間 に わ た っ て 上 昇 を 続 け, 最 終 週 に は204±8.2mmHgに 達 し た 。 一 方 ,NPD群 に 比 較 し てNPD＋EX群,LPD＋EX 群,LPD＋EX＋OLS群,Sham群 のSBPは 有 意 に 低 値 を

示 し た(repeated measures ANOVA, p＜0.05 vs. NPD＋ EX; p＜0.01 vs. LPD＋EX; p＜0.001 vs. LPD＋EX＋ OLS, Sham)。 ま た,LPD群 のSBPは12週 間 に わ た っ て

有 意 に 上 昇 し た 。NPD群 とLPD群 のSBPに は 差 異 を 認

め な か っ た 。LPD群 に 比 較 し てLPD＋EX群,LPD＋

EX＋OLS群,Sham群 のSBPは 有 意 に 低 値 を 示 し た

(repeated measures ANOVA, p＜0.05 vs. LPD＋EX, Sham; p＜0.01 vs. LPD＋EX＋OLS)。 一 方,LPD群 と

NPD＋EX群 のSBPに は 差 異 を 認 め な か っ た 。 ま た,

NPD＋EX群 に 比 較 し てLPD＋EX＋OLS群,Sham群 の

SBPは 有 意 に 低 値 を 示 し た(repeated measures ANOVA, p＜0.05 vs. Sham; p＜0.001 vs. LPD＋EX＋OLS)。

LPD＋EX＋OLS群 のSBPは す べ て の 腎 摘 群 の な か で 最 も 低 値 を 示 し た(repeated measures ANOVA, p＜0.01 vs. LPD, p＜0.001 vs. NPD, LPD＋EX)。

12週 間 に わ た るUPの 経 時 的 変 化 をFig.3に 示 す 。

NPD群,NPD＋EX群 のUPは12週 間 に わ た っ て 増 加 を

続 け た 。 一 方,NPD群 に 比 較 し てLPD群,LPD＋EX

Fig. 1. Body weight (BW) over the 12-week treatment in the Sham (•¢), NPD (normal protein diet) (• ), LPD (low protein diet) (•›), NPD+EX (normal pro-tein diet and exercise) (•¡), LPD+EX(low protein diet and exercise) (•œ), and LPD+EX+OLS (low

protein diet and exercise and olmesartan) (•£) groups

Fig. 2. Sequential for systolic blood pressure (SBP) in the Sham (•¢), NPD (normal protein diet) (• ), LPD (low pro-tein diet) (•›), NPD+EX (normal protein diet and exer-cise) (•¡), LPD+EX (low protein diet and exercise) (•œ), and LPD+EX+OLS (low protein diet and exercise and olmesartan) (•£) groups

Fig. 3. Urinary excretion of protein (UP) values in the Sham (•¢), NPD (normal protein diet) (• ), LPD (low protein diet) (•›), NPD+EX (normal protein diet and exercise) (•¡), LPD+EX (low protein diet and exercise)

(•œ), and LPD+EX+OLS (low protein diet and exer-cise and olmesartan) (•£) groups

群,LPD＋EX＋OLS群,Sham群 のUPは 有 意 に 低 値 を

示 し た(repeated measures ANOVA, p＜0.05 vs. LPD; p＜ 0.0001 vs. LPD＋EX, LPD-1-EX＋OLS, Sham)。 ま た, NPD＋EX群 に 比 較 し てLPD群,LPD＋EX群,LPD＋

EX＋OLS群,Sham群 のUPは 有 意 に 低 値 を 示 し た

(repeated measures ANOVA, p＜0.05 vs. LPD; p＜0.01 vs.

LPD＋EX, LPD＋EX＋OLS, Sham)。 さ ら に,LPD群 に

比 較 し てLPD＋EX＋OLS群,Sham群 のUPは 有 意 に 低

値 を 示 し た(repeated measures ANOVA, p＜0.0001)。

LPD＋EX群,LPD＋EX＋OLS群,Sham群 のUPに は

有 意 な 差 異 を 認 め な か っ た 。

各 群 のScrの 結 果 をFig.4aに 示 す 。 全6群 のScrに 有 意 差 を 認 め た(one way ANOVA, p＜0.001)。NPD群 に 比 較 し てLPD群,LPD＋EX群,LPD＋EX＋OLS群,

Sham群 のScrは 有 意 に 低 値 を 示 し た(Bonferroni/Dunn test,p＜0.01 vs. LPD,LPD＋EX,LPD＋EX＋OLS;p＜

0.001 vs. Sham)。LPD群,LPD＋EX群,LPD＋EX＋

OLS群,Sham群 のScrに は 有 意 な 差 異 を 認 め な か っ た 。

各 群 のBUNの 結 果 をFig.4bに 示 す 。 全6群 のBUN

に 有 意 差 を 認 め た(one way ANOVA, p＜0.01)。NPD群

に 比 較 し て 他 の す べ て の 群 のBUNは 有 意 に 低 値 を 示 し た (Bonferroni/Dunn test,p＜0.01)。 さ ら に,NPD＋EX群 に 比 較 し てLPD群,LPD＋EX群,LPD＋EX＋OLS群

のBUNは 有 意 に 低 値 を 示 し た(Bonferroni/Dunn test,p＜

0.05)。LPD＋EX群,LPD＋EX十OLS群,Sham群 の BUNに は 有 意 な 差 異 を 認 め な か っ た 。 NPD群 の 残 存 腎 組 織 に は 巣 状,分 節 状 の 糸 球 体 硬 化 お よ び 間 質 増 加 所 見 を 認 め た 。 各 群 のIGSをFig.5に 示 す 。 全6群 のIGSに 有 意 差 を 認 め た(Kruskal-Wallistest,p＜ 0.001)。NPD群 に 比 較 し て 他 の す べ て の 群 のIGSは 有 意 に 低 値 を 示 し た(Bonferroni/Dunn test,p＜0.05 vs. NPD＋ EX;p＜0.001 vs. LPD, LPD＋EX, LPD＋EX＋OLS _, Sham)。 ま た,NPD＋EX群 に 比 較 し てLPD＋EX群,

LPD＋EX＋OLS群,Sham群 のIGSは 有 意 に 低 値 を 示 し

た(Bonferroni/Dunn test,p＜0.01 vs. LPD;p＜0.001 vs.

LPD＋EX,LPD＋EX＋OLS, Sham)。 さ ら に,LPD群 に

比 較 し てLPD＋EX群,LPD＋EX＋OLS群,Sham群 の

佐 々木 裕 子  他3名  9

Fig. 4a. Serum creatinine (Scr) in the Sham, NPD

(normal protein diet), NPD+EX (normal protein diet and exercise), LPD (low protein diet), LPD+ EX(low protein diet and exercise), and LPD+ EX+OLS (low protein diet and exercise and ol-mesartan) groups at 12 weeks

Fig. 4b. Blood urea nitrogen (BUN) in the Sham,

NPD (normal protein diet), LPD (low protein diet), NPD+EX (normal protein diet and exer-cise), LPD+EX (low protein diet and exerexer-cise),

and LPD+EX+OLS (low protein diet and

exer-cise and olmesartan) groups at 12 weeks

Fig. 5. Index of glomerular sclerosis (IGS) of the renal

cortex in the Sham, NPD (normal protein diet), LPD (low protein diet), NPD+EX (normal protein diet and exercise), LPD+EX (low protein diet and

exer-cise), and LPD+EX+OLS (low protein diet and

exercise and olmesartan) groups at 12 weeks

vs. LPD＋EX;p＜0.001 vs. LPD＋EX＋OLS, Sham)。

LPD＋EX群,LPD＋EX＋OLS群,Sham群 のIGSに は

有 意 な 差 異 を 認 め な か っ た 。

各 群 のRIVをFig.6に 示 す 。 各 群 のRIVに は 有 意 差 を 認 め た(one way ANOVA, p＜0.001)。NPD群 に 比 較 し て 他 の す べ て の 群 のRIVは 有 意 に 低 値 を 示 し た(Bonfer-roni/Dunn test,p＜0.0001)。 ま た,NPD＋EX群 に 比 較 し てLPD群,LPD＋EX群,LPD＋EX＋OLS群,Sham

群 のRIVは 有 意 に 低 値 を 示 し た(Bonferroni/Dunn test, p＜0.0001)。 さ ら に,LPD群 に 比 較 し てLPD＋EX群,

LPD＋EX＋OLS群,Sham群 のRIVは 有 意 に 低 値 を 示 し

た(Bonferroni/Dunn test,p＜0.001 vs. LPD＋EX;p＜ 0.0001 vs. LPD＋EX＋OLS, Sham)。LPD＋EX群 に比 較

し てLPD＋EX＋OLS群,Sham群 のRIVは 有 意 に 低 値

を 示 し た(Bonferroni/Dunn test,p＜0.01 vs. LPD＋EX＋ OLS;p＜0.0001 vs. Sham)。LPD＋EX＋OLS群 に 比 較 し てSham群 のRIVは 有 意 に 低 値 を 示 し た(Bonferroni/ Dunn test,p＜0.0001)。 一 切 片 に つ い て100∼150個 の 糸 球 体 を 観 察 し て 算 出 し た 各 群 の 糸 球 体 内ED-1発 現 細 胞 数 をFig.7に 示 す 。 各 群 のED-1発 現 細 胞 数 に は 有 意 差 を 認 め た(oneway ANOVA,p＜0.001)。NPD群 に 比 較 し てLPD＋EX群, LPD＋EX＋OLS群,Sham群 のED-1発 現 細 胞 数 は 有 意

Fig. 6. Relative interstitial volume (RIV) of the renal cortex in the Sham, NPD (normal protein diet), NPD+EX (nor-mal protein diet and exercise), LPD (low protein diet),

LPD+EX(low protein diet and exercise), and LPD+

EX+OLS (low protein diet and exercise and olmesartan) groups at 12 weeks

Fig. 7. Glomerular infiltration of the macrophage of

the real cortex. NPD (normal protein diet), LPD (low protein diet), NPD+EX (normal protein diet and exercise), LPD+EX (low protein diet and

exercise), LPD+EX+OLS (low protein diet and

exercise and olmesartan) groups at 12 weeks

に 低 値 を 示 し た(Bonferroni/Dunn test,p＜0.05 vs. LPD＋ EX;p＜0.01 vs. LPD＋EX＋OLS;p＜0.001 vs. Sham)。

LPD＋EX群,LPD＋EX＋OLS群,Sham群 のED-1発 現 細 胞 数 に は 有 意 な 差 異 を 認 め な か っ た 。 考 察 ラ ッ ト の 腎 を 部 分 的 に 摘 除 し そ のmassを 減 少 さ せ る と,代 償 性 に 残 存 腎 の 糸 球 体 内 圧 の 上 昇,glomerular cap-illary flowの 増 加 が 生 じ,糸 球 体 が 傷 害 さ れ る 。 そ の 結 果,高 血 圧,腎 機 能 障 害,UPの 増 加 を 認 め る よ う に な り,残 存 腎 組 織 に は 慢 性 進 行 性 腎 疾 患 の 多 く に み ら れ る focal glomerulosclerosisに 類 似 し た 所 見 を 認 め る よ う に な る21)。本 研 究 に お い て も,5/6腎 摘 除 の み を 行 っ たNPD 群 に 高 血 圧,多 量 のUP,さ ら に 残 存 腎 組 織 に は 強 い 糸 球 体 硬 化 所 見 と 間 質 増 加 所 見 を 認 め た 。 本 研 究 に お い て,こ の よ う な 腎 不 全 モ デ ル ラ ッ ト に LPDを 摂 取 さ せ た と こ ろ,NPD群 に 比 較 し てUP,Scr, BUN,IGS,RIVが 低 値 を 示 し た こ と か ら,LPDは 単 独 に よ る 腎 保 護 作 用 を 有 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た, NPD＋EX群 で はNPD群 に 比 較 し てIGS,RIVが 低 値 を 示 し た こ とか ら,EXは 単 独 で 腎 保 護 作 用 を 有 す る こ とが 示 唆 さ れ た 。 さ ら に,LPD＋EX群 で はLPD群 に 比 較 し てIGSとRIVが 低 値 を 示 し,ま た,NPD＋EX群 に 比 較 し てLPD＋EX群 のUP,BUN,IGS,RIVが 低 値 を 示 し た こ と か ら,LPDとEXの 併 用 に よ る 腎 保 護 効 果 の 増 強 作 用 が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に,LPD＋EXへ のOLSの 併 用 は

LPD＋EX群 に 比 較 し てUPを 減 少 さ せ,Scr,BUNを 増

悪 さ せ る こ と な く血 圧 を 降 下 さ せ た 。 本 研 究 で は,Sham 群 とLPD＋EX＋OLS群 のUP,Scr,BUN,IGS,ED-1発 現 細 胞 数 に 有 意 な 差 異 を 認 め な か っ た 。 こ の こ と は,本 研 究 で 評 価 し た 項 目 お よ び 使 用 し た 動 物 モ デ ル に 限 定 さ れ る か も し れ な い が,LPD＋EX＋OLSに よ りShaml群 の レ ベ ル に 腎 が 保 護 さ れ た こ と を 示 唆 さ せ る 。 慢 性 腎 不 全 動 物 モ デ ル に お け るLPDの 効 果 に 関 す る 報 告 は 少 な い が,Schillerら22)は,5/6腎 摘Sprague-Dawley ラ ッ トに6％ ま た は24％ タ ン パ ク 食 を 与 え て7週 間 観 察 し た と こ ろ,6％ タ ン パ ク 食 群 の 糸 球 体 硬 化 が よ り 軽 度 で あ っ た と 報 告 し て い る 。 本 研 究 に お い て も,5/6腎 摘 除 WKYラ ッ ト にLPDま た はNPDを 与 え て12週 間 に わ

佐 々木 裕 子  他3名  11 た って 比 較 検 討 した が,同 様 に摂 取 タ ンパ ク制 限 に よ る腎 保 護 効 果 が 観 察 さ れ た 。LPDに よ る こ の よ う な 腎 保 護 効 果 の 機 序 に つ い て は,尿 細 管 ・糸 球 体 フ ィ ー ドバ ッ ク機 構 を介 し て 腎輸 入 細 動 脈 の 収 縮 が 生 じ,糸 球 体 高 血 圧 が 是 正 され る こ とな ど に よ り腎 が 保 護 され る可 能 性 が 考 え られ て い る23)。 本 研 究 で は,タ ンパ ク質 含 有 量 が18.3％ で あ る ラ ッ ト用 標 準 飼 料 を摂 取 させ た場 合 に比 較 して,そ れ よ り少 な い タ ンパ ク質 含 有 量 の 飼 料 を 摂 取 さ せ た 場 合 の 効 果 を 検 討 し た。 タ ンパ ク質 含 有 量12.6％ の飼 料 に よ る食 事 療 法 が い か な る原 因 に よ る腎 機 能 障 害 の い か な る病 期 に好 ま し い効 果 を発 揮 す るの か,ま た,ヒ トの 場 合 に どの程 度 の タ ンパ ク 質 制 限 に相 当 す る の か に つ い て は今 後 の詳 細 な検 討 が必 要 で あ る 。 一 方_{,LPDの デ メ リ ッ ト も指 摘 さ れ て い る 。Castaneda} ら24)は,高 齢 女 性 に0.45g/kgま た は0.92g/kgの タ ン パ ク質 含 有 量 の食 事 を9週 間摂 取 さ せ,握 力 お よ び下 肢 の 筋 力 を比 較 した と こ ろ,0.92g/kg群 に比 較 して0.45g/kg群 の そ れ は低 下 して い た 。 ま た,Cupistiら5)もLPD療 法 を 行 っ た 患 者 で は上 腕 の 筋 力 が 低 下 す る こ と を 報 告 し て い る。 さ らに,LPDに よ り下 肢 の 筋 量 が 減 少 す る危 険 性 も 示 唆 され て い る5)。す な わ ち,LPDに よ る熱 量 摂 取 不 足, 栄 養状 態 の低 下 は筋 量 を減 少 させ た り筋 機 能 を減 弱 させ, ひ い て は体 力 を低 下 さ せ5・25),結果 と し てQOLを 損 な う 可 能 性 が あ る こ とが 示 唆 され て い る。 Kouidiら26)は,血 液 透 析 患 者 が 歩 行,自 転 車 エ ル ゴ メー ター,ジ ョギ ン グ,水 泳 ま た はゲ ー ム ス ポ ー ツ を1週 間 に3回 の 頻 度 で90分 間 ず つ 計6カ 月 間 に わ た っ て行 っ た と ころ,大 腿 四 頭 筋 の 萎 縮 や 最 大 酸 素 摂 取 量,最 大 運 動 持 続 時 間 が 改 善 す る こ とを観 察 した 。Parsonsら27)は,血 液 透 析 患 者 が1週 間 に3回 の頻度 で 計8週 間 に わ た る 自転 車 エ ル ゴ メ ー タ ー に よ る 運 動 を行 い,QOLが 改 善 し た こ とを 報 告 し て い る。 以 上 よ り,EXに はLPDに よ る 筋, 体 力 お よびQOLに お け る デ メ リ ッ トを軽 減 す る効 果 が あ る可 能 性 が 示 唆 さ れ る。 EXが 腎 に及 ぼ す 影 響 に 関 す る報 告 で は,5/6腎 摘 モ デ ル ラ ッ トを用 い て検 討 され,UPの 減 少 や 糸 球 体 硬 化 病 変 の 軽 減 が 観 察 さ れ て い る28,29)。ま た,Bergamschiら7)は EXに よ る糸 球 体 高 血 圧 の 軽 減 を観 察 した 。 この こ とが 本 研 究 で 用 い た5/6腎 摘WKYラ ッ トに も あ て は ま る とす れ ぼ,EXに よ り腎 の輸 出 細 動 脈 が 拡 張 し,糸 球 体 高 血 圧 を是 正 させ た こ とな ど に よ り腎 が 保 護 され た の か も しれ な い。 本 研 究 に お い て はLPD群 とNPD群 のSBPに 差 異 を認 め な か っ た 。 こ の こ とか ら,LPDに よ る 腎 保 護 作 用 の 一 部 は,non-hemodynamicな 機 序 に よ る もの で あ る と考 え られ る 。 ま た,LPDとEXの 腎 保 護 作 用 の メ カ ニ ズ ム が 異 な って い る可 能 性 が あ る た め,両 者 の併 用 に よ る相 加 的 な 腎 保 護 効 果 が 期 待 で き る と考 え ら れ る。 す な わ ち, LPDは 血 圧 非 依 存 性 の 機 序 で 尿 蛋 白 を 減 少 さ せ 腎 保 護 効 果 を発 揮 し,EXは 血 圧 依 存 性 の 機 序 で 尿 蛋 白非 依 存 性 に 腎 保 護 効 果 を発 揮 す る可 能 性 が 考 え られ る。 現 時 点 ま で に,ラ ッ トを 用 い てLPDとEXの 併 用 に よ る 腎保 護 効 果 を検 討 した 成 績 は本 研 究 以 外 に は な され て い な い 。 臨 床 成 績 で はLPDとEXの 併 用 効 果 に関 す る報 告 が み ら れ,Castanedaら3)は,腎 機 能 障 害 者 に0.69/kg/ dayの タ ン パ ク制 限 食 を摂 取 さ せ,機 器 に よ る上 ・下 肢 筋 力 トレー ニ ン グ を12週 間 行 った と こ ろ,上 ・下 肢 筋 力 の 増 強,膝 屈 曲伸 展 筋 力 の 増 加,GFRの 増 加 を観 察 した 。 ARBは,ACE阻 害 薬 と同 様 に単 独 で 腎 保 護 効 果 を 示 す 成 績 が 報 告 され 汎 用 さ れ て い る。 今 回 用 い たOLSも 単 独 療 法 で,5/6腎 摘 除spontaneously hypertensive rat (SHR) に お い てUPを 減 少 させ,糸 球 体 硬 化 抑 制 作 用,間 質 増 殖 抑 制 作 用 を 示 した15,16)。 EXとARBの 併 用 に 関 す る報 告 は少 な い が,Kohzuki ら29)は5/6腎 摘 除SHRを 用 い て 検 討 した 。 そ の 結 果,併 用 に よ りUP減 少 効 果 と糸球 体 硬 化 軽 減 効 果,間 質 障 害 抑 制 が 増 強 し た 。 LPDとARBの 併 用 効 果 に関 し て はPetersら30)が 検 討 し て い る 。 特 異 的 抗Thy-1抗 体 を 投 与 したSDラ ッ トを 用 い て 腎 の免 疫 染 色 を行 った 結 果,6日 間 の エ ナ ラ プ リル ま た は ロ サ ル タ ン とLPDと の 併 用 は,単 独 療 法 に よ る糸 球 体TGF-β 発 現 抑 制 効 果 お よ びUP減 少 効 果 を 増 強 し た 。 す な わ ち,LPDとARBは そ れ ぞ れ 異 な る 機 序 で TGF-β の 発 現 を減 弱 さ せ る可 能 性 が 示 唆 され る 報 告 で あ る。 こ れ ら,ARB単 独 療 法,EXとARBの 併 用 療 法, LPDとARBの 併 用 療 法 の 効 果 に 関 す る成 績 は,実 験 条 件,投 薬 方 法,評 価 項 目 な どが 本 研 究 と異 な っ て い る た め,単 純 に本 研 究 の成 績 と比 較 す る こ とは で き な い が,い ず れ も本研 究 で 得 られ た 成 績 を支 持 す る もの で あ る と考 え られ る。 本 研 究 で は,LPD,EX,ARBの 併 用 に よ る 腎 保 護 効 果 に つ い て 糸 球 体 内ED-1発 現 細 胞 数 を 指 標 と し て 検 討 し た 。 この よ うなEX,LPD,ARB併 用 の 腎 保 護 効 果 に 関 し て 免 疫 染 色 を行 っ て検 討 した 成 績 は,今 回 の成 績 以 外 に は

報 告 さ れ て い な い 。 本 成 績 か ら は,LPD＋EX,LPD＋ EX＋OLSが 糸 球 体 内 マ ク ロ フ ァー ジ 浸 潤 を 抑 制 した こ と か ら,腎 保 護 効 果 の 一 部 は糸 球 体 内 マ ク ロ フ ァー ジ浸 潤 抑 制 効 果 に よ る もの で あ る可 能 性 が 示 唆 され た 。 現 時 点 に お い て,LPD,EX,ARBの 併 用 に よ る 腎保 護 効 果 の増 強 作 用 の機 序 に つ い て は明 らか で は な い が,以 下 の 可 能 性 を考 え る。 す な わ ち,LPDは 腎 の輸 入 細 動 脈 を 拡 張 させ23),EXは 輸 出細 動 脈 を拡 張 さ せ16),さ ら にARB は輸 出細 動 脈 を拡 張 さ せ る の み な らず,TGF-β に対 す る 作 用 を は じ め と す るAng Ⅱ の 作 用 を も抑 制 す る30)。した が っ て,LPD,EX,ARBを 併 用 す る こ とに よ り,輸 入 お よ び輸 出細 動 脈 の 両 者 は拡 張 し,そ れ ぞ れ の 単 独 療 法 の場 合 に比 較 し て よ り効 果 的 に糸 球 体 毛 細 血 管 圧 を降 下 させ, さ ら にAng Ⅱ作 用 の 抑 制 効 果 と相俟 っ て よ り強 い 腎 保 護 効 果 を もた ら す 可 能 性 が 考 え ら れ る 。LPD＋EXお よ び OLSが い か な る機 序 で 糸 球 体 内ED-1発 現 細 胞 数 に影 響 を及 ぼ した か 否 か につ い て は,今 後 の 詳 細 な検 討 が 必 要 で あ る。 結 論 5/6腎 摘 除 慢 性 腎 不 全 モ デ ル ラ ッ トに お い て,LPDと EXは 単独 で 腎 保 護 効 果 を有 す る こ とが 示 唆 さ れ た 。 さ ら に,LPDとEXの 併 用 に よ る 腎 保 護 効 果 の 増 強 効 果 が 示 唆 さ れ た 。 特 に,LPD＋EXへ のOLSの 併 用 はUP減 少 効 果,間 質 増 殖 抑 制 効 果 を増 強 し,ま た,腎 機 能 の指 標 で あ るScr,BUNを 増 悪 させ る こ と な く慢 性 腎 不 全 モ デ ル ラ ッ トの 高 血 圧 を 改 善 さ せ た 。 本 研 究 の一 部 は文 部 科 学 研 究 費 基 盤 研 究(B)(2)課 題 番号: 16300179に よって助成 された。 文 献

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