関 す 研究 鉱 質 チ イド産生 層 遊離細胞 高 圧 ト副腎球状 く ト 食塩

金沢大学 十 全医 学 会 雑 誌 第93巻 第2号 3 9 9−414 く19 8 射

D e o x y ^{c o r}tic o ste r o n e く^{D O C} ト食 塩高^血圧ラ ッ ト 副 腎球 状層遊 離 細 胞^の鉱質^{コ ル} チ ^コイ ド

産 生 ^に関す^る研 究

金 沢大 学 大学 院 医 学研究科 内 科学 第^二講座 く主任^二竹田亮 祐 教 授1

本 定 晃

僻和^{5 9}年³ 月^{2 7}日受 付1

3 9 9

デ オ キシコルチコステ^{ロ ン}くde o xyc o rtic o ste r o rl e 以下 D O C と略 卜 食 塩高 血 圧ラット で み ら れ る ア

ルド^ステ^ロ ンくaldo ste r o n el 分 泌 抑 制^の機 序は不 明である^． 本論 文は， この点を明ら かにす る為， D O C ^一食

塩 高 血圧 ラッ ト， 普 通 食 投 与ラッ ト， 食 塩 負 荷ラットか ら得た副 腎 遊 離 細 胞を 用^い， a ^{ト 2 4}adr e n o c⁻ o rtic otr opic ho r m o n e く以下A C T H と略l，is ole u cin e−^{5Na n}gi ote n sin II く以 下A II と略1， K 等^に対す る鉱 質^{コ ル}チ^コイ ドの反 応 性^{を 比}較 検 討し た． 体重 5 0g 前 後のウイ スタ^ー 系 雄 性ラット を普 通 食 群 く0^．2 3％Na，0^．9 5％K 含有食と水l，食 塩 負荷 群く同 食と1 ％食塩 水1，D O C 高 血 圧群く同 食と 1 ％食 塩 水な ら び に D O C 投 与l ^の3群に分け飼 育し た． 酢 酸デ オ キシコ ルチ^コステ^ロ ン のO Ca c etatel 12 ．5 mgJk_g体重 を微 品性 懸 濁 液^の形で過1 回， 4 週 間皮 下 注射し た^． 球 状 層細 胞 浮遊 液は^コラ ゲ ナ^ー ゼ処理によ り副 腎被 膜 層よ り作 製し た^． 5^．2^xl O^{−1 4}か ら 5^．2 Xl O−⁶モ ル濃 度^のA 王王， 5^．9X lO^{−1 4}か ら 5^．9^Xl O^{−8モ ル}濃 度^の A C T H ， ま た は 2⁻2 か ら 1 3 m EqノL の K， と と．^{もに細 胞 浮遊 液2ml を 9 5％02−5％C O2混合ガス下，3 70C 2} 時間 膵置し た． 球 状 層細 胞^の コルチコ ステ^{ロ ン}くc o rtic o ste r o n e こKe nd al 1^，s c o m po u nd B， 以下BKと旺別

の基 礎産生 は普通 食 群^に比 し， D O C 高血 圧群で有意^に低 下し て^いた． 球 状 層細 胞の ア^ルド^ステ^{ロ ン}の基礎 産生は普 通 食群^に比 し， 食 塩 負荷 群， D O C 高血 圧群で有 意に低 下し ていた^． 普 通 食群で は細 胞 脾置 中に，

アルドステ^ロ ン_，BK産 生は と も^に3嘩の刺 激によ り増 加し た．D O C高血 圧 群で は BK産 生はA C T H に のみ増 加し た が，

一方ア^ルドステ^ロン産 生はいずれ の刺 激^に対し て も増 加しなかった．又，食塩 負荷 群で は アルドス テロ ン， BK産 生は と もにA C T H ， K によ り増 加し た が， A I Iに対しては変 化を 示 さ な^かった^． A C T H，

K 刺 激によ り産 生さ れ た ア^ルド^ステロ ンと BKの比 を求め る と， 普通 食 群^に比し食 塩 負 荷群で有 意^に低 値 を 示 し た^． 以 上 よ り， D O C 高血 圧ラットでみ ら れ る ア^ルド^ステ^ロン分 泌 抑制の機序は主に_， A 工工に対 する 球 状 層細 胞^の感 受 性 低下と副 腎球 状 層にお け る ア^ルドステ^ロン生合 成^の1at_e st_ep に与る酵素系抑 制^によ る と考え ら れ た． な お， A II に対す る感 受 性 低下は内 因性A II の欠乏と低K 血 症， さ ら に酵 素 系抑制は N a

増 大と内因 性A H の欠乏に， そ れ ぞ れ起 因す る と思わ れ る．

Key ^{w or}ds Is olated rat adr e n al c ell_， A ldo ste r o n e bio syⁿthe sis，

D O C⁻S alt h_{y p}e rtensiv e r at．

1 943 年，Selye ら^りは， ラッ トにデ オ キシコルチ^コス す る^モデル動 物と し て繁用 さ れ^{て い}る が^2I31， 常^に著し

テロ ンくde o x c o rtic o ste r o n e， 以下D O C と略1 を 3遇 い低^{レニ ン}血症を呈 す る⁴¹⁵¹ことによ り， ヒトにお け る

間^にわ た り毎日投 与し， 飲 料 水と し て 1 ％食 塩 水を与 低^{レ ニ ン}性 本 態 性 高 血^圧症^6I の実験^モデルと さ れ て^い え る と高血 圧 が 生 ず る^こと を報 告し た． こ の D O C一食 る^．

塩高血圧 ラッ ト は， その後， 高血 圧の発 症機 序を研 究 D O C一食 塩 高 血圧 ラットでは， 低^{レ ニ ン}血症に伴 Studie s o n the M in e r alo c ortic oid Produ cti_pn b_y Is olated A dr e n al Glo m e rul o s a Cells of De o xy^{c or}tic o stero n eく^{D O C}ト^{Salt H} y p^{e r}te n siv e Rats． A k ir a H o r Lj^{o， D e}p^{e r}tm e nt of Inte r n al M edicin eく叩 く^{Dire cto r こP r of． R ■ Takeda}J，S^cho ol of M edicin e_，K a n aza w a U niv e r si_{t y}．

なって， ア^ルドステロ ンくaldo ste r o n el 分 泌低 下^が認 め ら れ る^こと は よ く知ら れ た事 実^{7ト9 ぅ}で あ る が， アル ドステロン分 泌抑 制の機 序に関しては未だ明ら かでな い− ア^ルドステ^ロ ン分泌の調 節機 序は複 雑^であ り， 現 在， 幾 多の Stimul ato r な^いし m odulato rの存 在が知

ら れている が^{1 0J lり}， 今なお不明な点も多^い． 従って_，

D O C^一食塩高血圧^ラット で認め ら れ る アル ド^ステ^{ロ ン} 分 泌抑 制の機 序を単^一 の機 序 ある^いは因子 で説 明す る こと は困難^であ る^． Na 貯 留^によ るレニ ン^ーア^ンジ オ テ ン シ ン系^の抑 制， Na 貯 留 時に作 動す る と さ れ る de

W a rde n e r ら^{1 2Il}叫のいう第3因子くN a 利 尿^{れ レモ ン}l の関 与も そ のひと^つと し て考え ら れ る．

著 者は， ステ^ロイ ド 生合 成の面か ら， アルド^ステ^ロ ン分 泌抑 制^の機 序を明ら かにす る た めに， D O C一食 塩 高血 圧ラッ トく両 側副 腎及 び腎臓 存 在 下フ を作 製し，

そ の副 腎 球状 層な ら びに束^． 網状 層 遊 離 細胞を 用^い，

in vitr o にて各 種 刺激^に対す る ア^ルドステ^ロ ンな ら び に コ ルチ ^コ ス テ ロ ン くc o rtic o ste r o n eニKe ndall^，s

C O mpO u nd B， 以下BK と略l ^の分泌反応性を検討したの

で報 告す る．

対 象お よ び方法

体 重5 0_g 前 後の ウ イスタ ^ー系 雄 性ラット を普 通 食 群 く0^■2 3％Na， O j 5％E 含 有 食^と水 投与フ， 食 塩 負荷

群 洞 上食と 1 ％ 食塩勅 な ら びにD O C 高血 圧群 洞 上食と1 ％食 塩 水な ら びにD O C 投 別 の3群に分 け

一 定の条 件下 は 灯 時 間^{0 8 0 0 h}−2 2 0 0 h， 室温22士 l^OCl で4 週 間 飼育し た^． なお ミネラ ルコ ルチ^コイ ド く^min e r alo c o rtic oid l と し て酢 酸デ オ キシコ ルチ^コス テロ ンくde o xyc o rtic o ste r o n e a c etat_eJ¹2 ⁻5 m glkg 体 重を ピ^ー ナッツ油^に溶解し週1 軌 ⁴ 週 間 皮下注射し た． D O C 投 与ラット で は収 縮 期 血圧 1 5 0 m m H_g以 上 示 す ものの み を 用^いた． ラッ ト^の血 圧測 定は， ラット 自 動血 圧記 録U S M 型1 ウ^エダ 興産 株 式会 勧 を用い，

尾動脈を利用 し たtail c uff法によ り， 収 縮 期血 圧の み を測定し， 3 回連 続 計 測^の平 均 値を測定 値と し た． 各 群の ラット数は 2 0 から 2 5 匹 で あ る． 4週 間 飼育 後^， 午前8 時よ り 9 時^の間^に断頭 屠 殺し， 採血後 両側 副腎 を 迅速^に取り出し た．

工． 遊 離 細胞 作 製

Ha ning ら¹叫の方法^に準じ た． そ の手順^{を F i}g^．1 に 示 す■す な わ ち取り出し た副 腎を氷冷 下 生 食 中^に集め，

副 腎^周囲の脂肪 組 織， 結 合 組 織を剥 離し た後， 副 腎被 膜を切 開し， 圧迫して束^．網 状 層及 び髄 質^を含む中心 部 く内 層う を分 離す る． 次^に被膜 層 及び内 層を， そ れ ぞ れ水 冷し た 0^．2％グ^{ルコ ー} スを含む Kr ebs⁻R inge r

炭 酸水 素塩 緩 衝 液 くKr ebs⁻R inge rbic a rbo n atebuffe r C O ntaining glu c o s e 以下K R B G と晩 pH 7^，4， K

adr e n al r e m o v ed

l

S eP ^{ar at}ion into c ap^{s u}la r a nd d^{e c a}p^{s u}l^ated p ^{o rtio n s}

COII^ag^{en a s e}I di g^{e st}i^{o n} filter ed a nld c e nt^rif^ug ^ed

l

P ^ellet s u sp^{e n}d ed iⁿ K R B G A

l

e xp ^{e r}im e ntal ag^{e nts a}d ^miⁿi^ste r ed i^{n c u}b ^ati^{o n}， 3 7t ， 9 5l％0 ₂ ⁻ 5 ％^{C O} 2^，2 h^r

RI A ．of c o rltic o ste r oid s

F ig^．1− Pr epa r atio n of c ell s u spe n sio n a nd in c ubatio n pr o c edu r e．

D O C一食塩 高^{血 圧 ラットのアルドステロ ン}分泌 能

度を 3^，6 n lM 濃度^に調 整フ 約5 0 ml中^に移す^{． つい}で

コラ ゲ ナ^ー ゼ液8 ml を含む 反応^フラス コに移し，95％ 02

−5％C O2混 合ガ^ス下， 3 7⁰C恒温 槽 内で 5 0 分 間， 1 2 0 回ノ分^で振 漸 削ヒす る^{． コ}ラ ゲ ナ ^ー ゼ液は， 4 ％アルブ ミ ンを含む K R B Gく以 下K R B G A と略1 にコ ラ ゲ ナ^ー ゼくc ollage n a s e， t y pe I， W o rth ing to n B io che m．

C^{o r}p^．1 3^．3 m gノml 及 び デ オ キシリ ボヌク レ ア ^ーゼ Cde o xy^ribo n u cle a s e， S igm aC he m ．Co．川．0 5 m gJ ml を加え て作 製し た． 次^に細胞を分 散さ せ る た め， 各 層 を含む^コ ラゲ ナ^ー ゼ液をパ ス ツ ^ー ルピペ ット^にて吸

い_， ゆ^っく り約¹0 0 回 上 げ下げ を行う． さ ら^に混合 液 を 2 枚重 ね た ナ イ^ロ ン メ ッシ^ュ6 0 で濾 過し， 粗 大な組 織を取り除き， 濾 液を プ ラ^スチック製 遠 心 管^に受け，

10 0^X g にて 1 0 分 間遠 心す る． 遠心後， 上滞を棄て，

残^ったc ellpellet に K R B G A lO ml を加え， パ ス ツ ^ー ルピ^ペッ トによ り攫拝す る^． こ のよ う な低 速 遠心操 作 く100 X g^，10 分間Iを 3 固練り返し，最 後に c ellpellet にE R B G A を加えて遊 離 細胞 浮 遊 液を作 製す る^．

工I^． イ^ンキ^{ュ ベ ー シ} ョン

， 遊 離 細胞数， 細胞生存 能 な ら びに鉱 質^{コ ル}チ^コ イ ド， アデノ シ ン^ー3⁷二 5^仁一環 状 リ ン酸 くade n o siれ e ⁻3^ノこ5^ノーCyClie

m o n opho sphate， 以 下cyclic A M P と略 等^{につ いて}

細 胞 浮遊 液0．9 n ll を 2^．5 ml 反応^フラ^スコに刺激 物 質0^．1 ml，K R B G A O^．1 ml と共^に加え，総 量2^．O ml と し，9 5％02 ^へ 5 ％C O2混 合ガス下，3 7⁰C恒温 槽 内で，12 0 回ノ分の振 塩を加えて_，イ^ンキ^{エペ ー} ト し た後， メ ジ ウ ムを測定に供す る まで ⁻2 0⁰C に て凍 結 保存し た． 刺 激 物質と し て は a ^{ト2 4}adr e n o c o rtic otr opicho r mo n eく以 下A C T H と略， Co rtr o sin 魯

， N．V ^．Orga n o n 社l，

is ole u cin e−⁵−^{a n}gi^{ote n s}inII く以 下 A II と略l 及 び K を使用 し た． A C T H は， pH 4^．0の生食 水^に溶 解し，

5^．9^xl O−^{1 4}よ り 5．9Xl O−^{6モ ル}濃 度にな る よ うに メジ ウ^ム中^に加え， 又 A II は K R B G A に溶 解し， 5．2 ^X

肝⁻⁴よ り 5^．2x lO−⁶モ ル濃 度にな る よ うに メジ ウム中

に加え た． さ らに K 投 与は， メジ ウム中K 濃 度を 2^．2 よ り¹3m EqlL に調 整し た． 対照 と し^{て メ}ジ ウ^ム中に pH 4．0 の生 食 水あ る^いは K R B G A を加え た ものを 用

いた．

細胞 数^は細 胞 浮遊 液の 1 部を染色す ること な し^に直 接血 球計算 盤^に採取し， 顕 微 鏡 下 くX 40 0う^で細 胞 数を 数え た． 副 腎 皮 質細 胞^は， 細 胞 質 内に脂 肪小 顆粒を含 み，

一 般^に球状 層細 胞は束状 層細 胞よ り も^ノJ^lさ く， 細 胞 質内小 顆粒も少な^{い こ}と よ り他^の混 入細 胞と鑑 別さ れ る^岬．

細胞 生 存 能の検 討は次の如く行^った． 試験 管に細 胞 浮遊 液0^．5 ml を取り， さ らに0．4％ト リバ ンプル ^ー液

4 01

0．1 ml を加え，均 等^に混 和し， 5分後に細 胞 数を数え，

染色さ れ な^い細 胞を生き た細 胞と し， その割合を求め た．

ラッ ト を断頭し， 採 取し た血 液を 用いて血祭^{レニ ン} 活 性 くpla s m a r e nin a ctivi_{t y}， 以下P R A と掛 ， 血 費 アル ド^ステ^{ロ ン}くpla s m a aldo ste r o n e， 以下P A と

圧酎， 血柴BK くpla s r n a BK， 以 下^{P BK} と田削 を測 定

し た．血 清^{N a}， K は溶血の影響を少な く す る た め，腹 部 大動 脈よ り採 取し た血 液を用^い， す ば や く遠心後，

測 定^に供し た． P R A は，S k in n e r 法を改良し た b io a s^． S ay によっ た^． 本 法^によ る測定 間の変 動係 数は 1 0^．9％

であった． 又血 祭及 び^メジ ウ^ム中ア^ルドステロ ンは ミ ド リ十 字 く株 ト^{の k it} を用^いてr ad ioim m u n o a s s ayく以 下R 工A とF別^によ り測 定し た．血祭 及び メ ジ ウム中BK

の測 定は， 血 祭又 は メ ジ ウム を he x a n e ニbe n z e n e

8 0^こ2 0 の溶 液^にて振過 し， 交叉性の大き^いコルチコス テロイ ド を あ ら か じ め抽 出 除 去し た後， 次にBEを he x a n e二be n z e n e2 0^ニ8 0の 溶 液 ^にて抽 出し，BK⁻3

−^{O Xim e}−^{bo vin e} s e r u m albumi n に対 する抗 体を 用^い R 工A にて行っ た． 測 定 内及び測 定 間変 動係 数^は， そ れ ぞ れ 6⁻8％， 9^．8％で あった． メジ ウム中cyclic A M F は^ヘキスト ジャ パ ンり剰の kit を用^いて サ クキ^{ニ ル}化 法によ る R 工A にて測 定し た． 血 清N a， E は燭 光 光 度 計^によ り測 定し た． なお_， メジ ウム中^ステ^ロイ ド産生 量は，実験 間の遊 離細 胞 数の^バラツキ を是正 す る た め，

細 胞1 0⁶個^に対す るステ^ロイ ド塵 生 量で表 記し た． メ ジ ウ^ム中^ステ^ロイ ド な ら びに_cyclic A M P 測定 値は平 均 値土標 準 誤 差で 示 し， 推 計 学 的 処理 は^stude nt^，s t te st によ り行^った．

成 績

工^． 対 象 各群間の体重， 副 腎重量， 血清電解 質，

P R A， P BK， P Aく平均 値^士標 準偏 差う^{につ いて} くTab le り

体重 は普 通食 群2 2 0士1 1g， 食 塩 負 荷群2 33 士1 2 _g，

D O C 高血 圧群2 7 6^士34 g と食 塩 負 荷 瓢 ^{D O C} 高血 圧 群で有 意の体重増 加を認め たくそ れ ぞ れp く0^．0 5， p く 0−0い． 副 腎重量く片側うは， 普通 食 群2 3 士5 ^．4 m g^， 食 塩負 荷 群2 2士4⁻5 ^m g^， D O C 高血 圧群14士3．3 m g と D O C 高血 圧群で有 意^に低 下し たくp く0．0 1う． 血圧 は普 通食 群10 8士8 m m Hg， 食塩負 荷群1 3 0士 10 m m H_g，

D O C高血 圧群^では 1 66士 18m m Hg で あった． 血 清 Na には 3 群 間で有 意 差を認め な か^っ た が， 血 清E は D O C 高 血圧群2^．8士0^．2 m EqJL と有 意に低 値で あ^っ

た くp く0^．01う． P R A 及び P A は そ れ ぞ れ普 通 食 群 7．3士 1．5nglmllh， 10 ．6士2 ．1 ngld l， 食 塩 負 荷 群 3．9士 1^．6ng J

，

mllh， 4^．6士2^．2 ngld l， D O C 高 血圧 群