Research on the pathophysiological role of AMPK activation -AMPK activation induced by mild electrical stimulation and
by Streptococcus pneumoniae-
Department of Molecular Medicine, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kumamoto University, Shingo Matsuyama
The AMP-activated protein kinase (AMPK), heterotrimeric complex composed of a catalytic subunit (α) and two regulatory subunits (β and γ), is a highly conserved serine/threonine kinase that plays a key role in the regulatory network of energy homeostasis. AMPK is known the “guardian of whole body energy metabolism”. Moreover, recent studies have shown that dysregulation of AMPK function is related to pathophysiology of several diseases. Thus, AMPK is considered to be a potential therapeutic target for diseases. In considering AMPK as a therapeutic target, it is important to understand 1) what stimuli regulates AMPK activity, and 2) how AMPK function modulates pathophysiological status.
Here, first, I focused on understanding the molecular basis how of mild electrical stimulation (MES) affects physiological outcome. Second, I focused on investigating the role of AMPK that cause in infection of streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), an important pathogen causing otitis media (OM) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD).
① Elucidation of molecular mechanism of MES effects using C. elegans
Electrical current at physiological strength has been applied as a therapeutic approach for various diseases. Several of our fundamental and clinical researches showed that MES at 0.1-ms pulse width and co-treatment with heat shock (HS) have clinical utility for the treatment of several diseases. But despite the growing evidence of the beneficial effects of MES, its effects on individual animals and the molecular underpinnings are poorly understood and rarely studied. Here, I examined the effects of MES on individual animal and its mechanisms by mainly using Caenorhabditis elegans, a powerful genetic model organism. Interestingly, MES increased stress resistance and suppressed excess fat accumulation in wild-type N2 worms but not in AMPKα/AAK-2 and LKB1/PAR-4 mutant worms. MES promoted the nuclear localization of anti-stress transcription factors and consequently increased the expression of anti-stress genes, whereas MES inhibited the nuclear localization of lipogenic transcription factor and suppressed the expression of lipogenic genes. Moreover, we found that MES induced the activation of LKB1/PAR4-AMPKα/AAK-2 pathway in C. elegans and in several mammalian cell lines. The mitochondrial membrane potential and cellular ATP level were slightly and transiently decreased by
MES leading to the activation of LKB1-AMPK signaling pathway. Together, we firstly and genetically demonstrated that MES exerts beneficial effects such as stress resistance and suppression of excess fat accumulation, via activation of LKB1-AMPK signaling pathway.
② Novel regulatory mechanism of S. pneumoniae-induced MUC5AC expression in OM
Streptococcus pneumonia (S. pneumoniae) is one of the most common bacteria pathogens causing otitis media (OM) and is well known to be a potent inducer of mucin glycoprotein. Mucin MUC5AC plays an important role in mucociliary clearance of bacterial pathogen. However, if uncontrolled, excessive mucus contributes significantly to conductive hearing loss. The molecular mechanisms underlying the tight regulation of MUC5AC production by S. pneumoniae are still largely unknown, and elucidating these mechanisms may help develop new therapeutic strategies for the inhibition of excessive mucin production in OM. Here, I examined the effects of AMPK, an attractive target for various diseases, on S. pneumoniae-induced MUC5AC production. Interestingly, S. pneumoniae, its component pneumolysin (PLY), significantly activated AMPKα in the human middle ear epithelial cell line (HMEEC) and in the middle ear of mouse. Furthermore, activation of AMPKα positively regulated S. pneumoniae-induced MUC5AC expression via inhibiting JNK, a negative regulator of S.
pneumoniae-induced MUC5AC expression. Importantly, intraperitoneal administration of AMPK inhibitor pre-infection suppressed MUC5AC expression and middle ear inflammation in a well-established S. pneumoniae-inoculated mouse model of OM. Thus, our data unveiled a novel mechanism of the tight regulation of MUC5AC mucin expression by S. pneumoniae and may lead to the development of new therapeutic strategy for reducing mucus overproduction in OM.
Collectively, the present studies have elucidated the pathophysiological role of AMPK activation induced by MES and by S. pneumoniae, and provide helpful knowledge to develop therapeutic methods for AMPK-associated diseases.
AMPK
活性化の病態生理学的役割に関する研究-微弱パルス電流と肺炎レンサ球菌による AMPK
活性化-
熊本大学大学院薬学教育部 創薬・生命薬科学専攻 バイオファーマコース 遺伝子機能応用学分野 松山真吾
AMP-activated protein kinase (AMPK) はα，β，γの3つのサブユニットからなるheterotrimeric complexであり, 種を超えて高度に保存されているSerine/Threonine kinase である. その役割か ら “guardian of whole-body energy metabolism” と称され, 生体のエネルギー代謝調節に重要な 役割を果たす．また, 近年の研究により, AMPK機能異常が様々な疾患病態と関連することが明 らかにされた. これらの知見は, 1) 如何なる刺激が AMPK の活性を調節しうるか, 2) 着目す る疾患病態，臓器，細胞においてAMPKの機能がどのように影響しうるか, を理解することが
AMPK を疾患治療標的として考える上で必要であること示唆している. そこで本研究では, 第
一に, ストレス応答やエネルギー代謝に影響を与える新規物理的ストレス「微弱パルス電流 (mild electrical stimulation : MES)」に着目し, MES による AMPK 活性化作用とその個体レベル での役割について, 主に線虫を用いて検討した. また，第二に，AMPK の感染病態時における 役割を明らかにすることを主目的とし, 中耳炎や慢性閉塞性肺疾患の重要な起因細菌である肺 炎レンサ球菌 S. pneumoniae 感染病態における AMPK の機能解析を行った.
1. MES による AMPK の活性化と個体レベルでの役割の解明
これまで本分野では, MES および温熱の同時印加可能な新規医療機器 BioMetronome® を開 発し, 基礎的および臨床的試験の結果から, 本機器が種々の疾患の治療または予防に応用可能 であることを明らかにしてきた (PLoS ONE, 2008, EBioMedicine, 2014). しかしながら, 温熱の 生体作用の分子メカニズムについてはかなり明確にされてきた一方, MESの生体作用の分子メ カニズムに関しては, 未だ不明な点も多い. そこで, BioMetronome® による生体作用が, ストレ ス応答やエネルギー代謝に関連したものが多い点に鑑み, 本研究では, これらのシグナルを統
括する AMPK 経路に着眼し, 実験モデル生物線虫での MES による AMPK 調節作用とその
役割の解明を行った. まず, MES は, 野生型 N2 線虫において, ストレス耐性関連分子の活性 化および発現上昇を誘導し, 致死的な熱ストレスおよび酸化ストレス条件下での生存率を延長 させ，線虫にストレス耐性を付与することを見出した. また, MES は, 脂肪合成関連分子の抑 制および発現減少をもたらし, 高グルコース誘導性の過剰な脂肪蓄積を抑制することも明らか にした. 興味深いことに, ヒトにおける AMPKα ホモログ aak-2 およびその上流分子 LKB1 のホモログ par-4 の変異株線虫では, 野生型 N2 線虫で認められた MES の効果が消失した.
さらに, 野生型 N2 線虫および哺乳類培養細胞株を用いた検討により, MES は, ミトコ ンドリア活性の一過性かつ僅かな抑制を介して細胞内 ATP 量を減少させ, LKB1-AMPK 経路を活性化させることを示唆した. 以上の結果より, MES は，線虫や哺乳類細胞におい
て，LKB1-AMPK 経路を活性化し, ストレス耐性付与や脂肪蓄積抑制作用を発揮すること
が明らかになった.
2) S. pneumoniae感染刺激によるAMPKの活性化とその粘液産生における役割
肺炎レンサ球菌 (S．pnuemoniae) は鼻腔や気道に存在するグラム陽性菌であり, 中耳炎 や慢性閉塞性呼吸器疾患の重要な起因細菌である. S. pneumoniae 感染による中耳炎病態 において粘液の過剰産生が認められる. したがって, 過剰な粘液産生を抑制することは中 耳炎治療を考える上で重要であるが, 粘液産生の正・負の制御メカニズムの詳細について は未だ不明な点が多い. そこで, 本研究では, 近年, 様々な疾患の治療標的として注目を 集める AMPK が, S. pneumoniae 感染中耳炎病態の形成に，どのような影響を与えるのか について明らかにすることを目的に, S. pneumoniae 誘導性の粘液産生における AMPK の役割の解明を行った. まず, S. pneumoniae の中耳上皮細胞株 HMEEC およびマウス中 耳上皮への感染刺激は, AMPKα を活性化することを見出した. また, この AMPKα 活性 化には, S. pneumoniae 構成因子 pneumolysin (PLY) が必要であることを明らかにした. 次に, S. pneumoniae による AMPKα の活性化は, S. pneumoniae 誘導性の粘液遺伝子
MUC5AC 発現を増強することを明らかにした. この時, 活性化された AMPKα は, 粘液
発現抑制因子である JNK の抑制を介して, MUC5AC の発現を増強することが示された. また, 興味深いことに, S. pneumoniae 経鼓膜投与により誘導されたマウス中耳炎モデル において, AMPK 阻害剤の投与は, 中耳上皮でのMUC5ACおよび炎症性サイトカイン発 現を抑制し, 中耳炎病態を改善させることを明らかにした. 以上の結果より, AMPKα の 活性化は，S. pneumoniae 誘導性の中耳炎病態において，粘液やサイトカインの産生促進 を介して病態増悪に作用することが明らかになった．
以上，本研究の成果は，本研究の成果は，第 1に，MES を AMPK 活性化刺激として 積極的に臨床応用するための科学的根拠を示すものであり，また，第2に，S. pneumoniae 感染を起因とする炎症性疾患における炎症制御において，AMPK阻害が， 有用なアプロ ーチとなることを示す興味深い知見である．
