研究報告書

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厚生労働科学研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業）

研究報告書

公衆浴場等施設の衛生管理におけるレジオネラ症対策に関する研究

感染源解明のための環境調査

研究分担者磯部順子富山県衛生研究所研究協力者金谷潤一富山県衛生研究所研究協力者小澤賢介デンカ生研株式会社

研究要旨本研究では，浴槽水，シャワー水および市中河川水におけるLegionella ^属菌の汚染状況調査と，感染源となり得る環境検体周辺の空気中のLegionella^{属菌の棲息状況に} ついて，直接平板培養法だけでなく，アメーバ共培養法も併用して調査した．また，患者検体から最も多く分離されているLegionella pneumophila ^血清群1（以下Lp1）を環境検体から効率よく検出するため，抗Lp1抗体で感作した免疫磁気ビーズ（LP1 IMB）を用いてLp1を選択的に濃縮する方法について検討した．

Legionella^{属菌の検出率は，}^浴槽水で8/40検体（20.0%），シャワー水で10/29検体（34.5%）

であった．アメーバ共培養法による分離結果は，浴槽水，シャワー水あわせた69検体中10 検体（14.5%）で，平板培養法の18検体（26.1％）に比べ，アメーバ共培養法で低かった．

河川水からは3/4回の調査でLegionella属菌が分離され，その検出率は浴槽水やシャワー水より高かった．エアロゾルの調査については，道路沿い99検体，浴室内16 検体から，

直接培養法およびアメーバ共培養法においてLegionella属菌は分離されなかった．しかしながら，遺伝子検査法では道路沿い検体で69.7%（69/99検体），浴室内検体で75.0%（12/16 検体）から Legionella 属菌の遺伝子が検出された．その 16S rRNA 遺伝子のコピー数

（copies/m³）は，道路沿い検体で60.6，浴室内検体で71.0であった．降水量が10 mm以上の日で遺伝子量が多い傾向であった（t検定 = 0.073）．Lp1 IMBを用いたLp1の選択的濃縮については，Lp1 の回収率が25.0〜50.0%であったのに対し，Lp6，Lp5 では7.1％，

9.6%，L. bozemanii^やL. cherii，L. anisaについては，0.0〜0.01%と，Lp1で高かった．

また，直接平板培養法で Lp1 が分離されなかった実際の浴槽水検体から，IMB 法で Lp1 を分離することができた．

以上の結果から，道路沿いのエアロゾルは浴室内のそれと同様のリスクを含むことを示したものと考える．今後，条件を変えながら検討することで，レジオネラ症の罹患のリスクの一端が明らかになるものと期待できる．一方，Lp1 IMB法については，Lp1の選択的濃縮に有用であることが示された．雑菌を除去する工程を加えるなど，検出感度をあげることができれば，感染源の特定に有用な方法となることが期待される．

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A．研究目的

レジオネラ症は，感染症発生動向調査によると，平成 27 年の全国での届出数が 1,587件と，統計を取り始めた2000年からの 16 年間でもっとも多かった．本疾患は 2003 年の尿中抗原検査の保険適用により全国的に届出数が増加傾向を示し始めたが，

それから既に 10 年以上が経過した現在でも増加傾向は続いている^１）．一方，富山県におけるレジオネラ症の発生状況は全国と同様の傾向であるだけでなく，その罹患率は全国の中でもっとも高い状況が続いている ¹⁾．そして，本疾患の感染源は，富山県でも，全国でも特定された事例は多くはない．

そこで，レジオネラ症の発生を予防するため，感染源を明らかにすることを目的として，富山県の公衆浴場の浴槽水とシャワー水，河川水中のLegionella^{属菌の棲息状} 況を調査した．今年度はアメーバ共培養法についても検討した．また，これまでの調査でLegionella属菌が検出された環境検体からの感染様式を明らかにするため，検体採取近辺で空気中に浮遊するLegionella^属菌を調査した．一方，患者検体から最も多く分離されているLegionella pneumophila

血清群 1（以下 Lp1）を環境検体から効率

よく検出するため，抗Lp1抗体で感作した免疫磁気ビーズ（IMB）を用いて選択的濃縮法によるLp1の分離について検討した．

B．研究方法

1．感染源調査（浴槽水・シャワー水・河川水）

①検体

調査対象は，公衆浴場の浴槽水，シャワ

ー水および河川水とした．浴槽水とシャワー水については，対象施設の選定と採水を厚生センター職員に依頼した．河川水については，富山市の街の中心部を流れる 4河川を対象とした．

②調査期間と試料

浴槽水とシャワー水の試料は，平成28年 9月〜12月に11施設で採取された40検体および29検体である．シャワー水については，温度を40℃に設定後，約 10 秒間流出させた後，容器に採取した．河川水の試料は，富山市内を流れる4河川5地点（図１）

で5，6，9，10月に採取した20検体であ

る．

③Legionella属菌の分離

Legionella 属菌の分離は，厚生労働科学

研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業）「公衆浴場等における

Legionella 属菌対策を含めた総合的衛生管

理手法に関する研究」の精度管理ワーキンググループが推奨する浴用水の方法 ²⁾に準じて行なった．

濃縮方法：浴用水1,200 ml，シャワー水 500 ml，河川水1,000 mlは，メンブランフィルター（直径47 mm，0.2 μm，ミリポア社ポリカーボネート ISOPORE）で吸引ろ過し，フィルターを100倍濃縮量となる滅菌蒸留水で１分間ボルテックスしたものを試料とした．

培養法：浴槽水，シャワー水は濃縮，非濃縮検体いずれについても，未処理，酸処理（0.2M KCl-HCl，pH2.2で等量混合後5 分間静置），加熱処理（50℃20 分アルミバスで加熱）を行い，その100 lをGVPC培地（日水製薬）にコンラージ棒で広げて35℃

で培養した．ただし，酸処理検体は，200 l

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について同様に培養した．また，濃縮液1 ml

に PYGC 培地で 30℃１週間培養したアメ

ーバ増菌液（古畑らの報告 ³⁾）を添加し，

35℃で１か月培養した（アメーバ共培養法）．

培養液を酸処理液（0.2M KCl-HCl，pH2.2）

と等量混合後，室温で15分静置した．混合液200 μlをGVPC培地にコンラージ棒で広げて，35℃で7日間培養した．河川水は，

濃縮検体5 mlについて，上記に示したアメーバ共培養法を実施した．

④分離されたLegionella属菌の同定同定は，平板に発育したLegionella^属菌様のコロニーについて，森本の報告⁴^）した斜光法で特異的な形態を観察し，血液寒天

培地とBCYE-α培地（ビオメリュー）に移

植し，システインの要求性を確認した．次に，BCYE-α 培地にのみ発育したコロニーについて，レジオネララテックステスト

（OXIDO）とレジオネラ免疫血清（デンカ生研）により血清群を決定した．

Sequence-Based Typing法による遺伝子型（ST）の決定は，European Working Group for Legionella Infectionsの方法に従って実施した

(http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/leg ionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.

php)．

２．エアロゾル調査

主に雨天の日の道路沿い 99 検体および浴用施設の浴室内16検体について，エアーサンプラ（コリオリスμ）を用いてエアロゾルを捕集した．道路沿いのエアロゾルについては，6 月〜11 月にかけて，県内 12 地点で捕集した．浴室内のエアロゾルについては，10月〜12月にかけて12施設で捕集した．なお，12検体は9施設のミスト発

生装置（稼働中）周辺の浴槽水付近で捕集した．15 mlの溶液（0.005% Tween 80液）

中に300 l/minの条件で10分間捕集した．

遺伝子検査法は，捕集液2 mlを用いて行った．15,000 rpmで5分間遠心後の沈殿に 100 l のキレックス溶液を添加し，100℃

で10分加熱後，遠心上清をDNA溶液とした．定量PCRは，Cycleave PCR Legionella (16S rRNA) Detection Kit（タカラバイオ）

を用いた．

直接培養法による検査は，捕集液100 μl をGVPC培地（日水製薬）にコンラージ棒で広げて，35℃で7日間培養した．

アメーバ共培養法による検査は，浴用水・

シャワー水・河川水と同様に行った．

３．免疫磁気ビーズによるLp1の選択的濃縮法の検討

①免疫磁気ビーズ作製方法

Lp1 IMBはデンカ生研で作製した．Lp1

以外の血清群に対する交差反応を吸収後，

硫安分画にて粗精製し，至適感作濃度（ビーズに結合しやすい抗体の濃度）とした抗体を磁気ビーズに感作し，Lp1 免疫磁気ビーズ（Lp1 IMB）とした．

②使用菌株と菌懸濁液作製法

菌株は表１に示した．これらの菌を滅菌生理食塩水にてマックファーランド 2.0 に調整し，その−5乗もしくは−6 乗まで10 倍段階希釈し，検体とした．菌懸濁液100 l

をBCYE-α培地（ビオメリュー）にコンラ

ージ棒で拡げ，35℃で7日間培養し，菌数を測定した．

③IMBによるLp1濃縮法

浴槽水検体もしくは菌懸濁液 1 ml に IMB 1滴（およそ25 l）を滴下し，10分毎に転倒混和しながら30分間吸着させた．

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ビーズを磁石で集め，滅菌生理食塩水で洗浄した．この操作（洗浄）を2回実施した後，最終的に生食 100 l もしくは 200 l に懸濁，ボルテックスでよく混和し，IMB 検体とした．この IMB 検体 100 l を

BCYE-α培地，GVPC培地のどちらか１枚

もしくは両方にコンラージ棒で拡げ，35℃

で7日間培養した．

④IMBの性能試験

−5乗，−6乗希釈したレジオネラ菌懸濁液1 mlを③の方法で濃縮分離した（単一血清群での回収率）．また，L. pneumophila の2血清群またはL. pneumophila^と他の菌種の懸濁液をそれぞれ1：1，あるいは1：

9 に混合したものを検体とし，③の方法で Lp1 を濃縮分離した(混合血清群での回収率)．分離平板に発育した菌数を数え，②で求めた推定菌数に対する回収率を比較した．

菌数が多い場合には 12〜24 個のコロニーについて，レジオネラ免疫抗血清を用いて血清群別を行い，その比率から発育菌数を求めた．また，平板上で蛍光を発する菌については蛍光を指標として菌数を区別して数えた．

⑤Lp1 IMBによる浴槽水からのLp1検出浴槽水検体を用いて，③に従い，Lp1 の分離を試みた．

（倫理面への配慮）

本研究は，研究機関内外の倫理委員会等における承認手続きが必要となる研究には該当しない．

C．研究結果

１．浴槽水・シャワー水におけるLegionella 属菌検出状況

浴槽水及びシャワー水から検出された Legionella属菌の菌数および菌種（血清群）

を表2に示した．Legionella^{属菌が検出さ} れたのは，浴槽水で4/11施設（36.4％）から 8/40 検体（20.0%），シャワー水で 5/11 施設（45.5％）から10/29検体（34.5%）であった． Legionella ^{属菌数が} 1,000 CFU/100 mlを越えたものは浴槽水2検体で，いずれも塩素注入されていない施設であった．Legionella ^{属菌が分離されたシャ} ワー水の水質は8検体（80％）が井戸水であった．その菌数が最も多かったのは温泉水を利用し，遊離残留塩素濃度（以下残塩濃度：mg/l）が 0.2 以下のシャワー水であった．浴槽水から分離されたLegionella^属菌で最も多かったのはLp6，次いでLp1であった．シャワー水で最も多かったのは Lp5とLp15であった．

次に，今年度実施したアメーバ共培養法によるLegionella属菌の分離結果について，

通常の直接平板培養法と比較した結果を表 3 ①〜③に示した．Legionella ^{属菌の検出}

率（表3①）は，69検体中，平板培養法で

18検体（26.1％），アメーバ共培養法で10 検体（14.5%）と平板培養法で高かった．

L. pneumophila では，アメーバ共培養法でのみ検出された血清群は認められなかった（表 3②）．これ等の結果について表3③ で相関を見ると，平板培養法で Legionella 属菌のみ分離された検体が10件で，アメーバ共培養のみ陽性となった 2検体はどちらもシャワー水で，分離されたのは Lp6 と UTであった．

河川水におけるLegionella^{属菌の月別の} 検出率と分離された菌を表 4 に示す．6 月を除き，Legionella ^{属菌が検出され，その}

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検出率は浴槽水やシャワー水よりも高かった．データは示していないが，地点1で検出率（3/4検体，75％）が高かった．また，

分離されたのは，L. pneumophila^が多かった．分離されたLp1のSTは，ST127であった．

２．バイオエアロゾルLegionella^属菌検出状況

道路沿い99検体，浴室内16検体について調査した結果，直接培養法およびアメーバ共培養法においてLegionella^{属菌は分離} されなかった（表5）．しかしながら遺伝子検査法においては，道路沿い検体で 69.7%

（69/99検体），浴室内検体で75.0%（12/16 検体）からLegionella^{属菌の遺伝子が検出} された．16S rRNA 遺伝子のコピー数

（copies/m³）は，道路沿い検体で60.6，浴室内検体で71.0であった．

道路沿い検体について，降水量，平均気温，平均湿度ごとの検出率などを比較した

（表6）．エアロゾル捕集当日の降水量が10 mm 未満と以上の日で，コピー数の幾何平均が49.7と88.1となり，10 mm以上の日で遺伝子量が多い傾向であった（t 検定 = 0.073）．

３．免疫磁気ビーズによるLp1の選択的濃縮法の検討結果

Lp1を含む供試菌（表1）のLp1 IBMによる回収率結果を表7に示した．全体としてみると，Lp1 の回収率が 25.0〜50.0%であったのに対し，Lp6，Lp5では7.1％，9.6%，

L. bozemanii^やL. cherii，L. anisa^については，0.0〜0.01%と低かった．−5 乗より

−6乗希釈液での回収率が高い菌株が多く，

50％を超える回収率が，菌株 No. 3，4，5 の希釈液で認められた．

Lp1とそれ以外のLegionella^{属菌懸濁液} を混合した場合の結果は図2，3に示した．

等量混合した場合（図２）では、Lp1 の回収率は16回中12回（75.0%）で40.0％以上を示し、他の菌の回収率より高かった．

しかしながら，7回目，15回目では，これらは同一日に実施しているが，Lp1 は平板上にそれぞれ 6個，2 個のみ発育が認められただけで，その回収率は 2％以下と低かった．

一方，Lp1と他のLegionella^{属菌懸濁液} を1：9で混合した場合，1〜11回目（11/17，

64.7%）でLp1の回収率は40.0%以上であったが，14 回目を除き、12〜17 回目の試験では回収率は 10％以下と低かった．12，

13回目は前述の等量混合の7，15回目と同一日に実施した．6 回目の実験も同一日に実施したが、Lp1の回収率は10.6%と高くはなかった。表には記載していないが、13 回目の実験は2 重測定したが、もう一方の

結果も9.1%と、10％以下の回収率であった。

次に，実際の浴槽水の 100 倍濃縮水に

Lp1 IMBを用いたときの培養結果について，

直接培養法と比較した結果を表 8に示した．

IMBを用いた場合にLp1が分離されたのは 2検体で，逆に直接培養法のみでLp1が分離されたのも2 検体であった．結果が異なった4検体の詳細を改めて表8の下段に示した．IMB法のみでLp1が分離された検体では，直接培養法の結果は，１検体が Legionella属菌陰性，１検体（590 CFU/100 ml）はLp1は分離されなかったものの，Lp3，

Lp4，Lp5 が分離された．直接培養法のみ

で Lp1 が分離された 2 検体はどちらも Legionella属菌の菌数は少なかった．

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D．考察

2007年から2016年にわが国におけるレジオネラ症患者から分離され，レファレンスセンターで解析されたレジオネラ属菌は，

85.1%がLp1であった．そして，このLp1 のSBTの遺伝子型をMinimum Spanning Treeで解析すると，129/410株（31.4％）

は浴槽水グループに，165/410株（40.2％）

は土壌・水溜り分離株グループに近いことがわかっている ⁵^）．しかしながら，実際には感染源が判明した事例は極めて少ない状況である．平成26年度のレファレンスセンター収集株の中で，推定感染源からの環境検体分離株のPFGEが臨床検体分離株と一致したのは6例のみであった⁶⁾．

このような背景を踏まえ，本研究では，

実際に感染源となり得る環境検体中のエアロゾルまたはミスト中のLegionella^属菌を証明し，とりわけ，水溜りなど，これまで直接的な感染源とは証明されていない環境のリスクを明らかにしようと試みた．残念ながら，直接平板培養，アメーバ共培養法，

どちらの培養法でもLegionella^{属菌を分離} することはできなかった．しかしながら，

遺伝子検出法では 60〜70％の検体で陽性となり，空気中にLegionella^{属菌が浮遊し} ていることが示唆された．また，興味あることに，道路沿いで採取した検体（69.7%）

におけるLegionella^{属菌の遺伝子の検出率} は，浴室内のミスト発生装置周辺で採取した検体（75.0％）と比較して大きな差は認められなかった．このことは，道路沿いのエアロゾルは浴室内のそれと同様のリスクを含むことを改めて示したものと考える．

今後，晴天の日やエアロゾルの発生のない屋内における検出率や遺伝子量と比較する

ことで，雨天の日の道路沿いや浴用施設の浴室内におけるレジオネラ症罹患のリスクが明らかとなる可能性が示唆された．なお，

アメーバ共培養については，これまでの報告⁷^）でも直接培養法に比べ，検出率が低いと報告されており，本年の結果もそれと同様の結果であった．この原因は明らかではないが，環境中ではアメーバへの感染が増殖の重要な過程となっていることから，共培養については検査法の検討が必要であると思われる．

レジオネラ症の感染源を特定することは，

感染拡大を防止するために重要となる．そのためには，患者喀痰から多く分離される Lp1 を標的として分離を試みる必要がある．

しかしながら，感染源となるような，すなわち衛生管理の不十分な浴槽水はLp1だけでなく，他の血清群の L. pneumophila ^をはじめ，いわゆる雑菌も多く検出される場合が多いため，標的とするLp1の検出が困難となる場合が多い．一部のLegionella^属菌は選択分離培地上で蛍光を発するなど，

視覚的に鑑別可能であるが，多くはコロニー形状だけでLp1と特定することはできない．そのため，Lp1 を検出するには多くのコロニーについて血清群を調べるなど，時間と労力がかかることが大きな課題である．

本年度，Lp1を標的としたIMBを用いた選択的濃縮分離法は，一部で十分な回収率が得られなかったが，多くの場合で本法が有用であることを示した．回収率が低かった実験結果の原因は不明であるが，ある特定の日の実験では，ビーズ濃縮法を用いない培養平板でも菌数が少なく、菌の状態に問題があった可能性があり、結果として回収率が低くなったのかもしれない。IMB法は

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これまでにも様々な菌種での検査法⁸^）に採用されている事からも，その有用性が高いという結果は信頼できるものと考える．本年の実際の浴槽水において Lp1 IMB を使用した培養法で，従来の直接平板培養法で検出できなかったLp1を検出した意義は大きい．残念ながらこのLp1は患者由来株と SBTが異なっていたため，感染源特定には至らなかったが，このIMB法はレジオネラ症の感染源の特定に一助となることが明らかとなった．さらに検出感度を高めるため，

Lp1 以外の菌を除去する方法として，酸処理法や熱処理法などを検査工程に加える検討が必要と思われる．

結語

感染源となり得る環境（エアロゾル）検体から Legionella 属菌の遺伝子を検出し，

ヒトへの感染経路の一端を証明することができた．しかしながら，直接，菌を分離することはできなかったため，継続した調査が必要である．一方，IMBについては，感染源調査に有用と思われるため，検出感度の向上を目指し，実用化に向けて具体的な使用手順などの検討が必要である．

謝辞

本実態調査を実施するにあたり，富山県生活衛生課，各厚生センター，富山市保健所の担当者および採水にご協力いただいた浴用施設の皆様に深謝いたします．

E．参考文献

1) 国立感染症研究所感染症発生動向調査週報．

http://www.nih.go.jp/niid/ja/allarticles/sur

veillance/239-idwr/data/6998-idwr-sokuh o-data-j-1652.html．

2) 森本洋，他．Legionella^{属菌検査法の} 安定化に向けた取り組み．厚生労働科学研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業）「公衆浴場等におけるLegionella 属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究」平成24年度総括・分担研究報告書 93-131．

3) 古畑勝則，他．2002．土壌からの

Legionella 属菌の分離状況．日本防菌防黴

学会誌．30:555–561．

4) 森本洋．2010．分離集落の特徴を利用したLegionella属菌分別法の有用性．日本環境感染誌 25:8-14．

5) レジオネラレファレンスセンター会議報告．2016年．衛生微生物技術協議会第 37回研究会．

http://www.nih.go.jp/niid/images/lab-man ual/reference/H28_Legionnaires.pdf．

6) レジオネラレファレンスセンター会議報告．2015年．衛生微生物技術協議会第 36回研究会．

http://www.nih.go.jp/niid/images/lab-man ual/reference/H27_Legionnaires_2.pdf．

7) Akiko Edagawa et al. 2015.

Investigation of Legionella

Contamination in Bath Water Samples by Culture, Amoebic Co-Culture, and

Real-Time Quantitative PCR Methods.

Int J Environ Res Public Health.

12:13118-13130.

8) 工藤由起子，他．2015．腸管出血性大腸菌O26，O103，O111，O121，O145および O157 の食品からの検出における選択増菌培地および酵素基質培地の検討．日本食

(8)

品微生物学会誌．32:60-66．

F．研究発表論文発表

Jun-ichi Kanatani, Junko Isobe, et al.

2017. Prevalence of Legionella Species Isolated from Shower Water in Public Bath Facilities in Toyama Prefecture, Japan. J Infect Chemother. Epub ahead of print. doi: 10.1016/j.jiac.2017.01.002.

報告

磯部順子，金谷潤一，他：富山県における浴用水中Legionella属菌の分離状況（2015 年）富山県衛生研究所年報.39,61-67，2016.

G.知的財産権の出願・登録状況なし

(9)

図 1 平成 28 年度市中河川水採水地点

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表 6．道路沿いエアロゾルにおけるLegionella 属菌検出状況表 5．エアロゾル中のLegionella 属菌検出状況

表７．IMB によるLegionella 属菌（単一血清群）の回収率

(11)

図 3．Lp1 菌の混合比を 1/10 にした場合の回収率の比較

(12)

表 8．実検体（浴槽水）における Lp1 の分離状況

（免疫磁気ビーズと通常培養法との比較）