タンパク質の定量 および 統計解析

動 物 生 産 学(畜 産 学)分 野 にお け るプ ロテ オ ー ム解 析 の展 開

武 本 淳 史1,池 上 春 香1,加 藤 里 恵1,松 本 和 也1

要約

プ ロテ オ ー ム は組 織 ・細胞 内 に存 在 す る タ ンパ ク質 全 体 を示 す 言 葉 と して 使 われ 始 め 、プ ロテ オ ミクス は プ ロテ オ ー ム を網 羅 的 に扱 う解 析 方 法 論 を意 味 して い る。 プ ロテ オ ミク ス研 究 は 、① 組 織 ・細胞 で発 現 す る タ ンパ ク質 情 報 の カ タ ロ グ化 、② 細 胞 の機 能 調 節 に お け るタ ンパ ク質 の機 能 の解 析 、 ③ 生 体 の 生 理機 能 制 御 の 分 子 機 構 の解 明 、④ 生 体 内 の情 報 の指 標 とな る タ ンパ ク質(バ イ オ マ ー カ ー)の 探 索 に応 用 され て い る。 近 年 、動 物 生 産 学(畜 産 学)分 野 にお い て 、 プ ロテ オ ー ム解 析 技 術 が応 用 され る よ うに な り、 疾 患 や 肉質 に 関 わ るバ イ オマ ー カー タ ンパ ク質 の探 索 に 関す る研 究 は進 展 しつ つ あ る。

本稿 で は、プロテオー ム解析 技術 の基本 的概要 を示す とともに、動物生 産学(畜 産学)分 野 にお けるプ ロテ オー ム解析 技術 を用 いたバイ オマーカー タ ンパ ク質 の探索 の現 状 と今後 の展 開について紹介す る。

1.緒 論

1995年 に 、 組 織 ・細 胞 内 に 存 在 す る 全 て の タ ン パ ク 質 を 示 す 言 葉 と して プ ロ テ オ ー ム(proteome)が 初 め て 使 わ れ た1)2)。 そ の 後 、1997〜1998年 に 、 ゲ ノ ミ ッ ク ス(genomics)と 並 ぶ 造 語 と して 、 細 胞 ・組 織 で 発 現 す る タ ン パ ク 質 を 網 羅 的 に 調 べ る 研 究 を 示 す プ ロ テ オ ミ ク ス(proteomics)が 登 場 した3)4)。 プ ロ テ オ ミ ク ス 研 究 は 、 ① 組 織 ・細 胞 で 発 現 す る タ ン パ ク 質 情 報 の カ タ ロ グ 化 、 ② 細 胞 の 機 能 調 節 に お け る タ ン パ ク 質 の 機 能 の 解 析 、 ③ 生 体 の 生 理 機 能 制 御 の 分 子 機 構 の 解 明 、 ④ 生 体 情 報 の 指 標 と な る タ ン パ ク 質(バ イ オ マ ー カ ー)の 探 索 、 な ど に 応 用 され て い る 。 タ ン パ ク 質 を 網 羅 的 に 解 析 す る 主 な 手 法 と し て 、 二 次 元 電 気 泳 動(Two‑dimensionalelectrophoresis:2DE)で 分 離 し て か ら ゲ ル 内 消 化 し て 質 量 分 析 す る 方 法 と 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー(Liquidcolu㎜chromatography:LC)に よ り分 離 し て か ら質 量 分 析 を 行 う方 法 が あ る5)。

2DEは 、 組 織 や 細 胞 か ら抽 出 した タ ン パ ク 質 溶 液 を 、 ポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル を 用 い て タ ン パ ク 質 を 等 電 点 と分 子 量 の 差 異 に よ っ て 分 離 し 、タ ン パ ク 質 を ス ポ ッ ト と し て 検 出 で き る よ うに 展 開 す る 方 法 で あ る 。 こ の 解 析 で は 、 分 離 され た 各 々 の ス ポ ッ トは 異 な る タ ン パ ク 質 を 示 し て い る。 こ れ ら の ス ポ ッ トを切 り出

し、 ト リプ シ ン な ど の タ ン パ ク 質 分 解 酵 素 を 用 い て ゲ ル 内 で ペ プ チ ドを 分 解 し て 断 片 化 し、 質 量 分 析 装 置 とデ ー タ ベ ー ス 検 索 に よ っ て タ ン パ ク 質 を 同 定 す る6)。2DEを 用 い た プ ロ テ オ ミ ク ス 研 究 は 、 タ ン パ ク 質 の 可 視 化 や ゲ ル 画 像 を 元 に し た デ ー タ ベ ー ス の 作 成 、 サ ン プ ル 間 で の 比 較 解 析 を行 な え る利 点 が あ る が 、 再 現 性 が 悪 い 、 あ る い は 低 分 子 量 の タ ン パ ク 質 の 解 析 が 難 し い 点 が 欠 点 と し て 挙 げ られ る。

一 方、LCは ア ガ ロ ー ス や セ ル ロ ー ス な ど の 担 体 を 充 填 させ た カ ラ ム に タ ン パ ク 質 溶 液 を 通 し 、 担 体 に タ ン パ ク 質 を 結 合 させ 、 徐 々 に 溶 液 の 組 成(塩 濃 度 、pH、 疎 水 度 な ど)を 変 え る こ と で カ ラ ム に 結 合 した タ ン パ ク 質 を 順 次 溶 出 させ る 方 法 で あ る 。 質 量 分 析 の 前 段 階 に お け るLCの 利 点 と し て 、 タ ン パ ク 質 溶 液 を ゲ ル に 含 ま せ る 工 程 が な い た め タ ン パ ク 質 の ロ ス が 少 な い こ と 、 さ ら に 数 百 数 千 の タ ン パ ク 質 を 分 析 す る こ と が で き る こ と が 挙 げ られ る 。 し か し な が ら 、 こ の 方 法 を 用 い た プ ロ テ オ ミ ク ス 研 究 で は 、 膨 大 な タ ン パ ク 質 の デ ー タ が 得 られ る こ と か ら 、 デ ー タ ベ ー ス の 作 成 に は 不 適 で あ る こ と も指 摘 さ れ て い る。

質 量 分 析 と は 、 ペ プ チ ドな ど の 物 質 を イ オ ン 化 し 、 磁 場 や 電 場 を 利 用 し て 質 量 の 異 な る 分 子 を 分 離 し、

検 出 す る 方 法 で あ る 。 イ オ ン化 方 法 と して 、 マ ト リ ク ス 支 援 レー ザ ー 脱 離 イ オ ン 化 法(matrix‑assistedlaser

原 稿 受 付2011年6.月28日

本 研 究 は 近 畿 大 学 生 物 理 工 学 部 戦 略 的 研 究No.08‑1‑1,2009の 助 成 を 受 け た.

1.近 畿 大 学 生 物 理 工 学 部 遺 伝 子 工 学 科,〒649‑6493和 歌 山 県 紀 の 川 市 西 三 谷930

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desorption‑ionization:MALDI)や エ レ ク トロ ス プ レー イ オ ン 化 法(electrosprayionization:ESI)が 主 に 用 い られ る 。MALDI法 は 、測 定 試 料 の 断 片 化 や 多 価 イ オ ン 化 が 起 こ り に く い た め 、解 析 が 容 易 で あ る 。 ま た 、 ESI法 はLCと 組 み 合 わ せ て 用 い る こ と で 、 サ ン プ ル 溶 液 の 分 離 ・質 量 分 析 を 一 貫 し て 行 な う こ と が で き る 方 法 と な っ て い る 。 ま た 、 こ の 方 法 で は サ ン プ ル を 溶 液 状 態 で 用 い る た め 、 タ ン パ ク 質 の 酵 素 消 化 と 同 定 を オ ン ラ イ ン で 行 う こ と で 数 百 ・数 千 の タ ン パ ク 質 を 同 時 に 扱 う こ と が 可 能 と な る"シ ョ ッ トガ ン 法"

プ ロ テ オ ミ ク ス が 開 発 さ れ て い る6)。 ま た 、 代 表 的 な 質 量 分 析 装 置 と し て は 、 四 重 極 型 質 量 分 離 装 置 (quadrupoleMs:QMs)、 イ オ ン ト ラ ッ プ 型 質 量 分 析 装 置(iontrapMs:ITMs)、 飛 行 時 間 型 質 量 分 離 装 置(time‑omightMS:TOFMS)、 フ ー リエ 変 換 イ オ ン サ イ ク ロ トロ ン 型 質 量 分 離 装 置(FTICRMS)が 挙 げ られ る 。QMSは 、4本 の ロ ッ ドを 互 い に 並 行 に 束 ね て 作 られ て い る 装 置 で 、 そ の ロ ッ ドに 特 定 の 条 件 の 電 位 と直 流 電 流 を 与 え る こ と で 、 特 定 の 大 き さ の イ オ ン だ け を 選 択 的 に 取 り出 す こ と が で き る 。ITMSは 、 弱 い 高 周 波 電 圧 を か け 、 イ オ ン を トラ ッ プ し て お き 、 そ の 後 、 高 周 波 電 圧 を徐 々 に 強 く す る こ と で 質 量 電 荷 比 の 小 さ い も の か ら順 に マ ス ス ペ ク トル を 得 る こ と が で き る 特 徴 を 持 つ 。 ま た 、TOFMSは 、 イ オ ン を 加 速 し て か ら検 出 器 に 到 達 す る ま で の 時 間 を 測 定 す る こ と で 質 量 を 求 め る方 法 で あ り、 一 定 距 離 の 空 間 を 検 出 器 に 向 か っ て 飛 行 させ る とイ オ ン は 質 量 の 小 さ い も の か ら順 に 検 出 器 に 到 達 し 同 定 さ れ る。 さ ら に 、 非 常 に 高 い 測 定 精 度 と分 解 能 を 持 つFT‑ICRで は 、 磁 場 と 電 場 を 装 置 内 に か け る こ と で 、 イ オ ン は 回 転 運 動 し、 そ の 回 転 速 度 に 応 じ た 周 波 数 の 信 号 が 検 出 器 に 検 出 さ れ る。 そ し て 、 そ の 信 号 を 数 学 的 処 理(フ ー

リエ 変 換)す る こ と で マ ス ス ペ ク トル が 得 ら れ る 原 理 と な っ て い る 。 通 常 、 タ ン パ ク 質 の 同 定 に はPMF (peptidemassfingerprinting)法 と タ ン デ ムMS法 が 用 い られ て い る 。PMFは タ ン パ ク 質 を ト リプ シ ン な ど の タ ン パ ク 質 分 解 酵 素 で 消 化 す る こ と で 得 られ る 各 ペ プ チ ドの 組 み 合 わ せ が 、 個 々 の タ ン パ ク 質 に 固 有 で あ る こ と を 利 用 す る も の で あ る 。 一 方 、 タ ン デ ムMS法 は 、2つ の 質 量 分 離 装 置 を 組 み 合 わ せ て ペ プ チ ド の ア ミ ノ 酸 配 列 を 調 べ る 方 法 で あ り 、ア ミ ノ 酸 配 列 を 分 析 す る た めPMF法 よ り も 詳 細 な デ ー タ が 得 られ 、 精 度 の 高 い タ ン パ ク 質 の 同 定 が 可 能 で あ る こ と が 知 られ て い る6)。 これ ら 一 連 の 技 術 の 開 発 に よ っ て 、 プ ロ テ オ ー ム 解 析 が 飛 躍 的 に 進 み 、 現 在 プ ロ テ オ ー ム 解 析 を 行 う上 で 必 要 不 可 欠 な 技 術 と な っ て い る 。

技 術 開 発 され て16年 以 上 経 過 し た プ ロ テ オ ミ ク ス は 、技 術 開 発 の 進 展 と と も に 、様 々 な 応 用 研 究 が 数 多 く行 わ れ て い る 。 特 に 、 生 命 科 学 分 野 で は 、 疾 患 発 症 分 子 メ カ ニ ズ ム の 解 明 や 治 療 標 的 マ ー カ ー ・臨 床 マ ー カ ー ・腫 瘍 マ ー カ ー の 同 定 ・開 発 な ど 医 学 や 理 学 で の 研 究 成 果 は 著 し い も の が あ る。 そ して 、 こ の プ ロ テ オ ミ ク ス 研 究 が 、 動 物 生 産 学(畜 産 学)分 野 に も展 開 され つ つ あ る。

III

タンパク質の定量 および 統計解析

画 像 解 耕 ソフトに よ り そ れ ぞれ の タン パ ク質 スポ ットの 発 現 強 度 を 数 値 化

図1二 次 元 電 気泳 動 を用 い た プ ロテ オー ム解 析 の 流れ

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2.動 物 生 産 学(畜 産 学)分 野 に お け る プ ロテ オー ム解 析

近 年 、動 物 生 産 学(畜 産 学)分 野 に お い て 、 これ ま で 報 告 さ れ て い る プ ロ テ オ ミ ク ス の 応 用 研 究 と して 、 病 気 や 妊 娠 な ど の 診 断 バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 や 、 肉 の 市 場 価 値 に 関 わ る形 質(経 済 形 質)で あ る 脂 肪 交 雑 や 肉 の 色 、 柔 ら か さ 、 重 量 な ど の 形 質 に 関 連 す る タ ン パ ク 質 の 探 索 と そ の 分 子 メ カ ニ ズ ム の 解 明 が 挙 げ ら れ る 。

ま ず 、 病 気 や 妊 娠 の 診 断 技 術 の 開 発 や 、 品 種 問 で の 形 質 差 を 調 査 す る た め に 、 プ ロ テ オ ー ム 解 析 技 術 が 強 力 な ツ ー ル と な っ て い る 研 究 を 、 以 下 に 示 す 。 家 畜 の 病 気 診 断 方 法 に プ ロ テ オ ー ム 解 析 を利 用 す る研 究 と して 、 健 康 的 な ブ タ に 対 し ア ク チ ノ バ チ ル ス ・プ ル ロ ニ ュ ー モ ニ ア の 感 染 に よ る肺 炎 を発 症 した ブ タ と サ ー コ ウイ ル ス の 感 染 に よ る 離 乳 後 多 臓 器 消 耗 症 候 群(PMWS)を 発 症 し た ブ タ の 血 清 の2DE像 の 比 較 解 析 が 行 な わ れ 、 そ れ ぞ れ の 罹 患 し た ブ タ の 血 清 で 特 異 的 に 発 現 す る タ ンパ ク 質 ス ポ ッ トの 同 定 が 報 告 さ れ て い る7)。 次 に 、 ウ シ の 繁 殖 に お い て は 、 妊 娠 に 関 わ るバ イ オ マ ー カ ー タ ン パ ク 質 の 探 索 が さ れ て い る 。 体 外 受 精 卵 の 胚 移 植 に よ る 妊 娠 と 、 自然 交 配 に よ る 妊 娠 で タ ン パ ク 質 の 発 現 プ ロ フ ァ イ ル が 異 な る こ と が 示 され て お り 、 発 現 量 の 異 な る タ ン パ ク 質 群 を 含 む 免 疫 シ ス テ ム が 妊 娠 初 期 に お け る 流 産 に 関 与 す る こ と が 認 め られ て い る8)。 ま た 、 プ ロ テ オ ー ム 解 析 を 用 い て 、 家 畜 の 品 種 問 で の 形 質 の 違 い の 指 標 と な る タ ン パ ク 質 を 同 定 し た 研 究 も 行 わ れ て い る 。 乳 牛 で あ る 刀b15'伽F吻3∫ 伽 種 と 肉 牛 で あ るC伽 伽 α種 の 肝 臓 の プ ロ テ オ ー ム 解 析 結 果 か ら 、タ ン パ ク 質 ス ポ ッ トの パ タ ー ン に ほ と ん ど違 い が 見 ら れ な い こ と が 示 さ れ た が 、 こ の 二 種 問 で 異 な る 発 現 を し た タ ン パ ク 質 も あ り、1躍3観 ηF漉3伽 種 で は 、 シ ャ ペ ロ ン タ ン パ ク 質 の 発 現 が 多 く 、 一 方 、C伽 痂 α種 で は 脂 肪 酸 代 謝 に 関 わ る タ ンパ ク 質 が 多 く発 現 し て い る こ と が 明 らか に さ れ た 9)。 こ れ ら の こ と か ら 、 系 統 発 生 的 に 近 い ウ シ の 種 間 で も タ ン パ ク 質 の 発 現 が 異 な る こ と に よ り 、 品 種 間 で の 形 質 の 違 い が 生 ま れ る の で は な い か と示 唆 され て い る。 ブ タ に お い て も 同 様 に 種 間 で タ ン パ ク 質 の 発 現 が 異 な る こ と が 報 告 され て い るlo)。

3.プ ロテオ ー ム 解 析 を用 い た 肉 質 に 関わ る 因子 や分 子 メ カ ニ ズ ム の解 明

現 在 、畜 産 にお い て 肉質 に 関 わ るバ イ オ マー カ ー と して利 用 され て い る もの と して 、 ビタ ミ ンAが あげ られ る。 日本 で は脂 肪 交 雑 の割 合 が高 い もの が 良 い と され て お り、肥 育 時期 に ビタ ミ ンAの 摂 取 量 を制 限 す る こ とで脂 肪 交 雑 の割 合 が高 くな る こ とが分 か っ て い る11)。しか し、個 体 問 での バ ラつ き が多 く、 ビ タ ミンAの 制 限 に よるVA欠 乏症 を 引 き起 こ し、 増 体 の低 下 や 足 腫 れ 、 肉 質 の 低 下 に っ な が る筋 肉水 腫(食 肉分 野 にお い て ズル と呼 ばれ 、 肉質 の低 下 を 引 き起 こす)を 引 き起 こす 可 能 性 が あ るll)。そ の た め、 ビ タ

ミンAの 摂 取 制 限 に よる肥 育 管理 方 法 だ け で は 不 安 定 な 面 も指 摘 され て い る。

近 年 、 プ ロテ オー ム解 析 を主 体 と した 肉質 に 関 わ る 因子 の探 索や 分子 メ カ ニ ズ ム の解 明 が 盛 ん に お こな われ て い る。 そ の背 景 と して 、 肉質 に 関 わ る 因子 や 分子 メ カ ニ ズ ム の解 明 が進 む こ とに よ り、 現 在 の 長 年 の経 験 か ら予 測 を立 て て肥 育 管 理 を行 う方 法 か ら、科 学 的根 拠 に基 づ く新 しい 肥 育 管理 方 法 へ の 転 換 が 可 能 に な る と期 待 され て い る こ とが挙 げ られ る。

以 下 に、 プ ロテ オ ー ム解 析 技 術 を用 い た 肉質 に 関 わ る因子 も し くは 分 子 メ カ ニ ズ ム の解 明 に 関 す る知 見 を紹 介 す る

3‑1.肉 の 熟 成 と 柔 らか さ に 関 す る プ ロ テ オ ー ム 解 析

肉 の 柔 ら か さ に は 、 肉 の 熟 成 が 大 き く 関 わ っ て い る 。 屠 殺 直 後 の 筋 肉 は 硬 い が 、 熟 成 期 間 を 経 る と 肉 は

柔 らか く な り食 肉 と な る 。 こ の 熟 成 期 間 で 起 き る タ ン パ ク 質 の 変 化 が 肉 の 軟 化 に 関 わ っ て い る 可 能 性 が あ り、 肉 の 軟 化 プ ロ セ ス の メ カ ニ ズ ム を 明 らか に す る た め に 、2DEを 用 い た プ ロ テ オ ー ム 解 析 が 盛 ん に お こ な わ れ て い る 。 牛 肉 の 熟 成 期 間 に お い て 経 時 的 に プ ロ テ オ ー ム を 比 較 し た 結 果 、 屠 殺 後 の 熟 成 期 間 で タ ン パ ク 質 の 発 現 が 大 き く変 化 す る こ と が 明 ら か に され 、屠 殺5日 後 か らHeatshockprotein(HSPs)やCreatine

kinaseの 発 現 量 が 上 昇 す る こ と が 示 され た 。HSPsは 屠 殺 直 後 で は 可 溶 性 画 分 で 観 察 され た が 、屠 殺5日 目 に は 非 可 溶 性 画 分 へ と タ ン パ ク 質 の 可 溶 性 が 変 化 し て い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る。 屠 殺 直 後 に 起 こ る 死 後 硬 直 で は 、 嫌 気 的 グ リ コ ー ゲ ン の 分 解 に よ っ て 乳 酸 が 生 じ る 。 こ の 乳 酸 が 筋 肉 内pHの 低 下 を 引 き 起 こ す た め 、 筋 肉 内pHの 低 下 と タ ン パ ク 質 の 可 溶 化 能 の 減 少 との 関 係 が 示 唆 さ れ て い る12)。 牛 肉 の 柔 ら か い グ ル ー プ と硬 い グ ル ー プ 間 で の プ ロテ オ ー ム を 比 較 し た 結 果 、 柔 ら か い グル ー プ で は 、 屠 殺 直 後 に 、 ミ

ト コ ン ド リ ア の 膜 タ ン パ ク 質 で あ るProhibitin、Mitomin、ElongationfactorTu、Vbltage‑dependent

anion‑selectivechannelproteinlと2、NADH‑ubiquinoneoxidoreductaseと 断 片 化 し たActinが 増 加 して い る こ とが 明 らか に され て お り 、 断 片 化 し たActinは ア ポ トー シ ス の 指 標 と し て も 知 ら れ て い る た め 、 肉 の 柔 ら か さ に お い て ア ポ トー シ ス の 関 与 が 示 唆 さ れ て い る12)。 ま た 、 屠 殺5日 後 に は 、 筋 肉 タ ン パ ク 質 で あ る Troponinの 存 在 量 が 柔 ら か い グ ル ー プ で 増 加 す る こ と も 明 ら か に され て お り、 筋 繊 維 を構 成 す る タ ン パ ク 質 の 分 解 と放 出 の プ ロ セ ス が 促 進 され て い る 可 能 性 が 示 唆 され て い る12)。

ま た 、牛 肉 の 柔 ら か さ にPeroxiredoxin‑6が 関 与 して い る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る13)。 屠 殺7日 後 に 肉 の 勢 断 力(Warner‑Bratzlershearfbrce:WBSF)を 測 定 し 、 柔 ら か い グ ル ー プ と硬 い グル ー プ と に グ ル ー プ 分 け した 後 、 プ ロ テ オ ー ム が 比 較 され た 。 そ の 結 果 、 硬 い グ ル ー プ と 比 べ て 、 柔 ら か い グ ル ー プ の バ イ オ プ シ ー サ ン プ ル でPeroxiredoxin‑6の 存 在 量 が 多 く な っ て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 屠 殺 後1時 間 経 過 し た サ ン プ ル で も 柔 ら か い グ ル ー プ でPeroxiredoxin‑6の 存 在 量 が 多 い こ と が 観 察 され た 。Peroxiredoxin‑6は 抗 酸 化 酵 素 の 一 つ で 、 酸 化 ス ト レ ス か ら細 胞 を 守 る 役 割 を 果 た し て い る た め 、 柔 ら か い グル ー プ で は 硬 い グ ル ー プ よ り も 酸 化 ス ト レ ス が 軽 減 され て い る 可 能 性 が あ る13)。 さ ら に 、 ブ タ に お い て もPeroxiredoxin‑6

と 同 じ 魚milyに 属 す るPeroxiredoxin‑2の 存 在 量 が 屠 殺3日 後 、7日 後 の サ ン プ ル と 比 較 して 屠 殺 後24時 間 の 柔 ら か い グ ル ー プ の サ ン プ ル で 多 い こ と が 明 ら か に な っ て い る14)。 こ れ ら の こ と か ら 、 酸 化 ス トレ ス が 肉 の 柔 らか さ に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 され て い る 。

肉 の 熟 成 が 進 む に つ れ て 、 断 片 化 し たActinが 増 加 し 、 ま たMyosinheavychain(MHC)の 検 出 量 が 増 加 す る こ とが 観 察 され て い る こ と か ら 、ActinやMHCが 屠 殺 後 に 分 解 を 受 け て い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。ActinやMHCは 主 要 な 構 造 タ ン パ ク 質 で あ る 。そ して 、断 片 化 し たActinの 量 やMHCの 量 と も にWBSF 値 に 負 の 相 関 関 係 が あ る こ と が 明 ら か に され て い る こ と か ら 、 これ ら の タ ン パ ク 質 の 分 解 が 、 肉 の 柔 ら か

さ に 関 与 し て い る こ と が 認 め られ た15)。

シ ャ ペ ロ ン タ ン パ ク 質 で あ るT‑complexproteinl(TCP1)の 発 現 量 がWBSF値 の 高 い 牛 肉 で 多 い こ と が 明 らか に され た 。TCP1はTublinやActinと い っ た 構 造 タ ンパ ク 質 の 折 りた た み に 関 与 す る タ ン パ ク 質 で あ る 。Actinと い っ た 筋 原 線 維 タ ン パ ク 質 は 、熟 成 が 進 む に つ れ て 徐 々 に 分 解 され 、肉 が 柔 ら か く な る こ と が 分 か っ て い る 。 そ の た め 、WBSF値 の 高 い 牛 肉 でTCP1の 発 現 量 が 高 い と い う こ と は 、 本 来 屠 殺 後 に 変 性 したActinや 筋 原 線 維 タ ンパ ク 質 が 分 解 を 受 け て 肉 が 柔 ら か く な る は ず の も の が 、TCPIに よ っ て 再 度 折 り た た ま れ る こ と で こ れ ら の タ ン パ ク 質 の 分 解 が 抑 え られ 、 肉 の 硬 さ が 保 た れ て い る と 考 え ら れ る16)。

シ ャ ペ ロ ン タ ン パ ク 質 で あ るHeatshockproteinbeta‑1(HSP27)も ま た 、 官 能 検 査 と プ ロ テ オ ー ム 解 析17) やWBSF値 の 低 い 牛 肉(柔 らか い 肉)と 高 い 牛 肉(硬 い 肉)の プ ロ テ オ ー ム 解 析 の 結 果 か ら 肉 の 柔 らか さ に 関 与 す る こ と が 示 唆 され て お り 、WBSF値 と正 の 相 関 が あ る こ と が 示 され て い る16)。

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3‑2.脂 肪 蓄 積 ・形 成 に 関 す る プ ロ テ オ ー ム 解 析

脂 肪 細 胞 の 分 化 に 関 わ る 遺 伝 子 と し て 、Peroxisomeproli飴ratoractivatedreceptor(PPARγ)、

CCAAr‑enhancerbindingproteins(C/EBPα,C/EBPβ)、Sterolregulatoryelementbindingprotein(SREBPlc)が よ く 知 ら れ て い る 。

近 年 、 遺 伝 子 の み な ら ず 脂 肪 蓄 積 や 形 成 に 関 わ る 因 子 の 探 索 や そ の 分 子 メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に す る た め に プ ロ テ オ ー ム 解 析 が 利 用 さ れ て い る 。 ウ シ に お い て 、C伽01薦 種 ×Rε4珈gπ8種 の 交 雑 種 と 」馳r⑳ κ1種

×Rθ4肋gπ5種 の 交 雑 種 の 背 脂 肪 組 織 の 厚 さ の 厚 い 個 体 群 と 薄 い 個 体 群 と に 分 類 し 、 プ ロ テ オ ー ム の 比 較 解 析 が 行 な わ れ た 。 そ の 結 果 、 背 脂 肪 の 厚 い 個 体 はAnnexinA1の 発 現 量 が 高 く な る こ と が 明 ら か に さ れ た 18)。AnnexinAlは カ ル シ ウ ム 依 存 性 の リ ン 脂 質 結 合 タ ン パ ク 質 と し て 機 能 し 、 カ ル シ ウ ム 依 存 的 に 細 胞 膜 へ と 結 合 す る 機 能 を 持 つ 。 マ ウ ス に お け るAnnexinAl欠 損 型 と 野 生 型 と の 比 較 解 析 に よ っ て 、AnnexinAl 欠 損 マ ウ ス で は 、 副 睾 丸 脂 肪 体 量 の 減 少 が 観 察 さ れ た 。 ま た 、 脂 肪 細 胞 の 大 き さ は 変 化 し な い と い う 報 告 が な さ れ て お り19)、AnnexinAlは 脂 肪 細 胞 前 駆 体 や 脂 肪 細 胞 の 維 持 に 関 与 し て い る 可 能 性 が あ り 、 そ の た めAnnexinAlの 発 現 量 は 背 脂 肪 の 厚 さ に 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ る 。

ウ シ の 腹 膜 の 一 部 で あ る 大 網 膜 、 背 脂 肪 、 筋 内 脂 肪 組 織 由 来 の 未 分 化 の 脂 肪 問 質 細 胞 と 分 化 し た 脂 肪 細 胞 の プ ロ テ オ ー ム 解 析 で 、 脂 肪 間 質 細 胞 が 脂 肪 細 胞 へ と 分 化 す る と 、ActinやC面linと い っ た 構 造 タ ン パ ク 質 の 発 現 が 減 少 し 、ubiquinolcytochrome‑creductasecomplexcoreproteinl(uQcRc1)や 、ATPsynthaseD chain、Superoxidedismutase(SOD)、Glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase(GAPDH)、SulfbtransfbraselAl

(SULTIAI)、CarnitineO‑palmitoyltrans琵rase2(CPT)と い っ た 脂 質 代 謝 や 代 謝 活 性 に 関 わ る タ ン パ ク 質 の 発 現 量 が 増 加 す る こ と が 観 察 さ れ て い る 。 そ し て 、 こ れ ら の タ ン パ ク 質 は 背 脂 肪 、 筋 内 脂 肪 よ り も 大 網 で よ り 高 く 発 現 し て い る こ と も 観 察 さ れ て お り 、 組 織 毎 に タ ン パ ク 質 の 発 現 制 御 機 構 が 異 な る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る20)。

3‑3.筋 肉 内 脂 肪 量 に 関 す る プ ロ テ オ ー ム 解 析

韓 牛 の 牛 肉 の プ ロ テ オ ー ム 解 析 か ら筋 肉 内 脂 肪 量 に 関 係 す る 可 能 性 の あ る タ ン パ ク 質 が 同 定 さ れ て い る 。 そ の タ ン パ ク 質 はInositoll,4,5‑triphosphatereceptortypel(IP3Rl)で あ り、 筋 肉 内 脂 肪 量 と負 の 相 関 関 係 が あ る こ と が 明 ら か に され た 。 こ の タ ン パ ク 質 は 、 細 胞 内 か らのCa2+の 放 出 を 仲 介 す る 細 胞 内 パ ス ウ ェ イ に 関 わ っ て い る こ と が 知 られ て い る16)。

肉 質 の 異 な る2種 類 の ブ タ に お け る 筋 肉 内 の ミ トコ ン ド リア の タ ンパ ク 質 に 焦 点 を 置 い た プ ロ テ オ ー ム 解 析 の 結 果 か ら 、Succinatedehydrogenase(SACD)の 発 現 量 が 肉 質 の 良 い 種(赤 み を 帯 び て お り、柔 らか く 、 筋 肉 内 脂 肪 量 が 多 い)で 増 加 す る傾 向 が 見 られ て お り、 ま た トラ ン ス ク リプ トー ム 解 析 に お い て もPPARα

とSACDの 発 現 量 が 増 加 す る こ とが 明 らか に され た 。SACDに お い て は プ ロ テ オ ー ム 解 析 の 結 果 と 一 致 す る こ と が 示 され た21)・PPARα は 脂 質 と グ ル コー ス を 制 御 し 、 体 重 を 調 節 す る 転 写 因 子 で あ る こ と が 認 め ら れ て お り、 酸 化 型 筋 繊 維 で 高 く発 現 し て い る こ と が 知 られ て い る。 筋 肉 内 脂 肪 は 解 糖 型 筋 繊 維 よ り も 酸 化 型 筋 繊 維 で 多 い こ と も 知 られ て い る 。SACDは 、短 鎖 脂 肪 酸 の 脱 水 素 化 を 触 媒 す る ミ トコ ン ド リア 酵 素 で 、 β酸 化 を 開 始 す る 。 筋 肉 内 脂 肪 の 発 達 は 、 筋 肉 内 で 起 こ る脂 肪 酸 酸 化 とArp合 成 が 関 与 して い る と さ れ て お り、 こ れ ら の タ ン パ ク 質 が 筋 肉 内 脂 肪 量 に 関 係 し て い る 可 能 性 が 示 唆 され る21)。

筋 肉 内 脂 肪 量 の 多 い ウ シ と少 な い ウ シ の 骨 格 筋 の プ ロ テ オ ー ム 解 析 の 結 果 、Carbonicanhydrase2(CA2) お よ び 、Myosinlightchain3(MYL3)が 筋 肉 内 脂 肪 量 の 多 い 骨 格 筋 で 減 少 す る傾 向 が 観 察 さ れ た 。 そ して 、 Real‑timePCRに よ るmRNA発 現 解 析 で も 、脂 肪 細 胞 に 分 化 す る と こ の 二 つ の タ ン パ ク 質 のmRNA量 が 減 少 す る こ と が 明 ら か に され て お り 、 こ の 二 つ の タ ンパ ク 質 が 筋 内 脂 肪 量 の ネ ガ テ ィ ブ マ ー カ ー と して 利 用 で き る の で は な い か と考 え られ て い る22)。GlutathioneS‑trans飴rasel(GSTPI)のmRNA量 、 タ ン パ ク 質 の

発 現 量 とも に脂 肪 含 量 の多 い ブ タ の最 長 筋 で上 昇 して い る こ とが 明 らか に な っ て い る。GSTPIは 細 胞 の 解 毒 に 関与 す る タ ンパ ク質 で あ る た め 、脂 肪 含 量 の 多 い豚 に お け る脂 質過 酸化 反応 を軽 減 す るた めにGSTP1 の発 現 が上 昇 してい る可 能 性 が示 唆 され て い る23)。

4.プ ロテ オ ー ム 解 析 技 術 の 課 題 と将 来 性

こ れ ま で に 述 べ た よ う に 、 プ ロ テ オ ー ム 解 析 技 術 の 精 度 が 格 段 に 進 歩 し た お か げ で 、 遺 伝 子 情 報 の み な らず 、 タ ン パ ク 質 を よ り詳 細 に 解 析 す る こ と が 可 能 と な っ た 。 し か し 、 技 術 の 進 歩 に よ っ て よ り詳 細 に タ ン パ ク 質 の 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 解 析 で き る よ うに な っ た 今 日 で も 、 ゲ ノ ム 上 の 遺 伝 子 に コ ー ドさ れ て い る タ ン パ ク 質 を 網 羅 的 に か つ 同 時 に 解 析 す る こ と は 不 可 能 で あ る。 な ぜ な ら 、 プ ロ テ オ ー ム 解 析 は 、 あ る 時 点 で の あ る 組 織 ・細 胞 に 注 目 し て タ ン パ ク 質 の 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 調 べ る か ら で あ る。 そ の た め 病 気 を 診 断 す る バ イ オ マ ー カ ー や 肉 質 に 関 わ る バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 お よ び 開 発 に は 、 リア ル タ イ ム に 生 体 の 情 報 を 取 得 し、 経 時 的 に モ ニ タ リ ン グ す る 必 要 が あ る 。 現 在 ま で に 、 畜 産 分 野 に お い て 病 気 の 診 断 や 肉 質 を リ ア ル タ イ ム に モ ニ タ リ ン グ す る バ イ オ マ ー カ ー の 実 用 化 に は 至 っ て は い な い が 、 バ イ オ マ ー カ ー 探 索 に 関 す る 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て い る た め 、 近 い 将 来 に バ イ オ マ ー カ ー が 実 用 化 さ れ る 可 能 性 は 高 い と 考 え ら れ る 。 家 畜 の 疾 患 バ イ オ マ ー カ ー が 実 用 化 され れ ば 、 病 気 の 早 期 発 見 に つ な が る だ け で な く 、 そ れ が 感 染 症 で あ る な ら ば 、 拡 大 防 止 を す る こ と が で き る の で は な い か と 考 え られ る。 ま た 、 家 畜 の 肉 質 に 関 わ る バ イ オ マ ー カ ー の 実 用 化 は 、 肉 質 の 状 態(霜 降 り度 合 い 、 肉 色 な ど)を 経 時 的 に モ ニ タ リ ン グ し 、 あ ら か じ め 診 断 ・予 測 で き る よ う に な る 。 そ し て 、 肉 質 の 状 態 に 応 じ て 、 飼 料 の 配 合 や 環 境 を 変 え る と い っ た 、 個 体 毎 に テ ー ラ ー メ イ ドな 肥 育 を す る こ と が で き る よ うに な り、 高 品 質 の 食 肉 を 安 定 的 に 生 産 で き る よ うに な る か も しれ な い 。 こ の よ う に 、 プ ロ テ オ ー ム 解 析 技 術 を 畜 産 分 野 に 応 用 す る こ と で 、 育 種 分 野 で は 肥 育 管 理 方 法 の 改 善 、 繁 殖 分 野 で は 妊 娠 診 断 の 確 立 と い っ た 様 々 な 可 能 性 が あ り、 動 物 生 産 学(畜 産 学)分 野 に お け る プ ロ テ オ ー ム 解 析 技 術 の さ ら な る 発 展 が 期 待 され る 。

謝 辞

本 研 究 の 一 部 は 、 生 研 セ ン タ ー ・イ ノベ ー シ ョ ン 創 出 基 礎 的 研 究 推 進 事 業 で 実 施 し た 。

引用 文 献

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英文抄録

The application of proteomic analysis in livestock animals

Atsushi Takemoto_ Haruka Tkegami_ Rie Kato and Kazuva Matsumoto

Finding protein bio-markers associated with some diseases and meat quality in livestock animals is important for both industry and consumers. Recently, by discovering disease bio-markers using the tools of proteomics, diseased animals can be found and diffusion of infectious diseases can be prevented at an early stage. Furthermore, differential proteome analysis is used for identifying protein bio-markers related with major aspects of quality of the meat, such as marbling. New protein bio-markers will enable us to efficiently select animals with high economic value. In this review, we discuss proteomics study in search of protein bio-markers which are associated with the quality of Wagyu beef and the future of proteomics technology in the animal science.

Department of Genetic Engineering, Kinki University, Wakayama 649-6493, Japan