博 士 （ 農 学 ） 山 本 将 之
学 位 論 文 題 名
テンサイにおける細胞質雄性不稔性 原因遺伝子の発現に関する研究
学位論文内容の要旨
細 胞質 雄性 不稔 性は 花粉 形成 が妨げられる変異形質であり、ハイブリッド作物の種 子生 産に 欠く こと がで きな い。 この形質はミトコンドリアゲノムに生じた遺伝子突然 変 異 に 起 因 す る と 考 え ら れ る が 、 不 稔 性 発 現 の 分 子 機 構 は 不 明 の ま ま で あ る 。 テ ンサイにおいては由来の異なる複数の細1胞質雄性不稔変異が知られており、それ ぞれ の細 胞質 ゲノ ムは ミト コン ド リアDNAの構 造差 に基 づぃ てS型 、S‑2型お よびS一 3型 の3夕 イ プ に 分 類 さ れ てい る 。こ れら3種 の雄 性不 稔細 胞 質ゲ ノム の下 では 、花 粉稔 性の 回復 に働 く核 遺伝 子（ 稔性回復核遺伝子）の種類や作用性が互いに異なるこ とが分かっており、花粉不稔の発現に至る分 子機構も相違すると考えられる。従って、
各々 の細 胞質 ゲノ ムに つい て分 子的な特徴付けを行い、共通点と相違点を網羅的に究 明す るこ とに よっ て、 細胞 質雄 性不稔性の機構の全容が明らかになるものと期待され る。 これまでに各雄性不稔型ミトコンドリアゲノムにおいて 、正常稔性(N)株とは異な る転 写バ ター ンを 生ず る変 異遺 伝子が数種同定された。本研究ではこれらの変異遺伝 子の 翻訳 産物 を調 査し 、雄 性不 稔の原因遺伝子の同定を試みた。結果は以下のように 要約される。
1S型ミトコンドリアゲノムに見出された変異 遺伝子の解析 、
育 種的利用に供されているS型 ミトコンドリアゲノムに見出された変異遺伝子の内、
雄性 不稔性関与の可能性が考えられる3遺伝子(orf324，COAI，atp6)について翻訳産物 を解 析し た。 先ず 、普 遍的 なミ トコンドリア遺伝子atp8と5tコード域の一部および5t 非翻 訳領 域を 共有 する キヌ ラ遺 伝 子orp24に関 して 抗体 を作製し、花昔および葉から 抽出 した ミト コン ドリ アタ ンバ ク質に対してウェスタン解析を行った。しかし〇田24 の翻 訳産物は全く検出されなかった。ロリ8に関しては、N、S両株間で翻訳産物の蓄積 量に 差が 見ら れず 、D′ ア24mRNAとn08mRNAが翻 訳装 置を 競合 する こと も考 え難 い。
従ってD′声24が 直接的、間接的に雄性不稔に関与している可能性は低いと結諭づけた。
cDWに 関 し て も 同 様 の 解析 を試 みた が、N型株 とS型細 胞 質雄 性不 稔株 との 間で COXI夕ンパク質のサイズと蓄積量に差異は見fiiされなかった。また、S型n′′ 6はN −906―
型atp6に比 ペ著 しく 仲長 した アミ ノ末 端 を持つ。而遺伝予に共通のア ミノ酸配列を認 識 する 抗体 を用 いたところ、両者f瑚で翻訳産物の差は認められなかっ た。一方興味深 いことに、S型arp6の仲長したアミノ末端(Satp6( Nex))を認識する抗体を用 いた場合に は 、S型 不 稔 株 に お い てN型 株 に は 見 ら れ な い 翻 訳 産 物 が 検 出 さ れ た 。 た だ し 、 SATP6N(ex)ポり ペプ チド の蓄 積量 は稔 性 回復核遺伝子の有無には左右 されないようで ある。
2S‐2型 お よ びS‑3型 ミ ト コ ン ド リ ア ゲ ノ ム に 見 出 さ れ た 変 異 遺 伝 子 の 解 析 野生 ビー トに 由来 するS‑2、S‑3両細 胞 質雄性不稔株においては、ミ トコンドリアゲ ノ ムの 分子 構造 が互 いに 酷似 し、 花粉 稔 性回復の遺伝様式も比較的似 通っている。両 ゲノムより3種の変異遺伝子orf187，atp6，orf129が見付かり、さらにS‑3型 ゲノムにつ いてはこれらに加え て‑ orf145，orfl 70の2変異遺伝子が見出された。ウエスタンブロッ ト解析の結果、orf187，orf145およびorfl 70に関しては翻訳産物が認められず、またatp6 に つ い て も 雄 性 不 稔 性 へ の 関 与 を 示 唆 す る デ 一 夕 は 得 ら れ な か っ た 。 orf129はS‑2型 株 とS‑3型 株 に 固 有 の 遺 伝 子 で あ り 、 そ の 相 同 配 列 はN型 株やS型 株 には 含ま れて いない。orf129はSー2、S‑3両雄性不稔株の花蕾ミトコ ンドリアで翻訳 さ れ て い る 。 し か もORF129ポ リ ペ プ チ ド の蓄 積量 はS‑2型株 の方 がS‑3型株 より も4 倍 程度 多い こと が分かった。検定交配実験 によれば、S‑3型細胞質雄性 不稔に作用し完 全な稔性回復をもた らす核遺伝子は、Sー2型細胞質雄性不稔に対しても共通 に働くもの の 、そ の稔 性回 復作 用は 不完 全で ある 。 この稔性回復パターンの差はS‑2、S‑3両株に 共 通の 雄性 不稔 ミト コン ドリ ア遺 伝子orf129の発現量の差異に起因す ると考えるとデ ータは矛盾なく説明 できる。
3morganello翻訳産物の比較
上述 のSatp6( Nex)とorf129以外に、雄性不稔株のミトコンドリアゲ ノム中で翻訳さ れ る 変 異 遺 伝 子が 存在 す るか 否か を調 べる ため 、N型 株お よび3種 の細 胞質 雄性 不 稔 株の肥大根よルミト コンドリアを単離しin organello翻訳実験を試みた。ミ トコンドリ ア ゲノ ムコ ード のタ ンバ ク質 組成 を比 較 した 結果 、明 確な 差異 はS型 株においては約 40kDaの 固 有 ポ リペ プチ ド、 また 、S‑2型お よびS‑3型 株で は約lOkDaの 固有 ポリ ベ プ チ ド に 限 定 さ れ た 。lOkDaポ リ ペ プ チ ド は 抗ORF129抗体 を用 いた 免疫 沈降 実験 を 通 じ て、orf129翻 訳産 物で ある こと を確 認 した 。ま たS型ミ トコ ンド リ アに特異的な翻 訳 産物 は、 その サイ ズか らもSATP6(Nex)ポリペプチドである可能性が 高い。以上の結 果 より 、S型 細胞 質雄 性不 稔に 関し てはSatp6( Nex)配列が、またS‑2、S‑3両細胞質雄 性 不稔 につ いて はorf129がそ れぞ れ花 粉 不稔の原因遺伝子として働い ていると結諭さ れた。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主査 教授 三上哲夫 副査 教授 島本義也 副査 教授 佐野芳雄
学 位 論 文 題 名
テンサイにおける細胞質雄性不稔性 原因遺伝子の発現に関する研究
本論文 は89頁から なる和文 論文であり、図35と表7を含む。別に参考論文4編が 添えられている。
細胞質雄性不稔性は花粉形成が妨げられる変異形質であり、ハイブリッド作物の種 子生産に欠くことができない。この形質はミトコンドリア遺伝子突然変異に起因する が、不稔性発現の分子機構は不明のままである。
テンサイでは由来の異なる複数の細胞質雄性不稔変異（S、S‑2およびS−3型）が知 られており、それらの不稔細胞質（ミトコンドリア）ゲノムの下では、花粉稔性の回 復に働く核遺伝子の種類や作用性も互いに相違する。これまでに各雄性不稔型ミトコ ンドリアゲノムにおいて、正常稔性(N)株とは異なる転写パターンを生ずる変異遺伝子 が数種同定された。本研究ではこれらの変異遺伝子の翻訳産物を調査し、雄性不稔の 原 因 遺 伝 子 の 同 定 を 試 み た 。 得 ら れ た 結 果 は 以 下 の よ う に 要 約 さ れ る 。 1S型ミトコンドリアゲノムに見出された変異遺伝子の解析
育種的利用に供されているS型ミ卜コンドリアゲノムに見出された変異遺伝子の内、
雄性不稔性関与の可能性が考えられる3遺伝子(orf324，coxl，atp6)について翻訳産物 を解析した。先ず、orp24に関して抗体を作製し、花蕃や葉から抽出したミ卜コンド リアタンパク質に対してウェスタン解析を行った。しかし翻訳産物は全く検出されな かった。c甜´に関しても同様の解析を試みたが、N型株とS型雄性不稔株との問でCOXl 夕ンバク質のサイズと蓄積量に差異は見出されなかった。従って〇′タ24やc甜´が雄性 不稔に関与している可能性は低いと結諭した。
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S型arp6はN型atp6に 比 ぺ著 し く 仲長 し た アミノ 末端を 持つ。両 遺伝子 に共通の ア ミノ酸 配列を認 識する抗 体を用 いたとこ ろ、両 者間で翻 訳産物 の差は認 められなかっ た。一 方興味深 いことに 、S型tup6の伸長したアミノ末端(Satp6( Nex))を認識する抗体 を′Hいた場 合には、S型 不稔株に おいてN型株 には見られない翻訳産物が検出された。
2Sー2型 お よ びS−3型 ミ ト コ ン ド リ ア ゲ ノ ム に 見 出 さ れ た 変 異 遺 伝 子 の 解 析 野生ビ ートに由 来するS‑2、S‑3両細 胞質雄性 不稔株に おいて は、ミト コンド リアゲ ノムの 分子構造 が互い に酷似し 、花粉稔 性回復 の遺伝様 式も比 較的似通 ってい る。先 に見出された5種の変異遺伝子(orf129、orf145、orf/ 70、orfl 87、atp6)の内、orf145、 orfl 70お よびorfl87に 関しては 翻訳産 物が認め られず 、またatp6についても雄性不稔 性への関与を示唆するデータは得られなかった。
orfl 29はS‑2型株 とS‑3型 株 に固 有 の 遺伝 子 で あ り、 そ の 相同 配 列 はN型 株やS型 株に は 含 ま れて い な い。 し か もORF129ポ リベ プ チド の蓄積 量（花蕾 ）はS―2型株の 方がS‑3型株 よ り も4倍 程度多 いこと が分かっ た。検定 交配実 験によれ ば、S‑3型細胞 質雄性 不稔に作 用し完 全な稔性 回復をも たらす 核遺伝子は、S‑2型細胞質雄性不稔に対 しても 共通に働 くもの の、その 稔性回復 作用は 不完全で ある。 この稔性 回復バ ターン の差はS‑2、S‑3両株 に共通の 雄性不稔 ミトコ ンドリア 遺伝子orf129の発現 量の差異に 起因すると考えるとデータは矛盾なく説明できる。
3加organello翻訳産物の比較
in or8anello翻 訳産物 の解析を 通じて 、S型 株固有の タンパク質はSarp6(Nex)の産物 で あ り 、 ま たS‑2型 お よ びS‑3型 株を 特 徴 づけ る タ ン バク 質 はORF129で あ るこ と を 確認した。以上の結果より、S型細胞質雄性不稔に関してはSatp6(Nex)配列が、またS‑2、 S‑3両 細 胞 質 雄性 不 稔 につい てはorf129が それぞれ 花粉不 稔の原因 遺伝子 として働 い ていると結諭された。
本研究 の成果は テンサ イの細胞質雄性不稔性の機構解明に寄与するところが大きく、
学術お よび応用 の両面で 高く評 価できる 。
よって 審査員一 同は、 山本将之 が博士（ 農学） の学位を 受ける に十分な 資格を有す るもの と認めた 。
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