日本電子News Vol.38 , 2006

実用多核 NMR − CHF 測定−

朝倉 克夫

日本電子（株）分析機器本部 応用研究グループ

はじめに

核磁気共鳴の発見から現在にいたるまで、 様々な技術革新や応用測定が開発されてきた が、今なお溶液 NMR における観測の対象は、 主として1_{H と}13_{C である。これは溶液 NMR} による構造解析の対象となる有機化合物が、 ほとんどの場合1_{H と}13_{C で構成されているか} らに他ならない。生体分子などを対象とする 測定では、15_{N や}31_{P を利用することも少なく} ないが、1_{H や}13_{C の利用頻度におよぶところ} ではない。しかし当然のことながら、NMR の分析対象となるのは1_{H と}13_{C のみで構成さ} れる都合のよい化合物ばかりではなく、その 多くは多種多様の元素を含んでいる。それら の元素の NMR もまた、多くの情報を提供し てくれることは周知である。これまでにも多 くの研究者が実に様々な核種の多核 NMR を 測定し、その化学シフトやスピン結合定数な どの情報を活用しているが、さらに多くのデ ータが蓄積されれば、多核 NMR がよりいっ そう有用になることは疑いない。そのために も、装置の性能向上やデータ処理法、測定法 の充実といった、多核 NMR を利用しやすい 環境の構築が望まれる。 さて、一口に多核 NMR といっても、対象と なる核種に応じていくつかに分けられる。ま ず、比較的利用頻度の高いスピン量子数 1/2 の核種があげられる。特によく利用されるの は、先にあげた31_{P や}15_N、29_{Si などである。} 一般にこれらの核種は線幅が細く、観測しや すいのであるが、その反面、緩和時間が長い ために測定に長時間を要する場合もある。次 にスピン量子数が 1/2 より大きい核種であり、 いわゆる四極子核と呼ばれる核種がある。こ れらの核種は四極子モーメントを持つため四 極子緩和を伴い、信号が広幅化するなどの難 点がある。最近ではこのうち固体状態の半整 数スピン核に関して、MQMAS (Multiple Quantum Magic Angle Spinning) による高分 解能化が達成され、応用範囲がさらに広がっ ている。また、この分類とは別に共鳴周波数 の違いによる分類も考えられる。一般的な NMR 装置においては、1_{H および}19_{F を扱う} チャンネルを、その共鳴周波数が高いことか ら HF (High Frequency) チャンネルとして扱 い、1_{H や}19_{F を高周波核と呼ぶ。その他の、} 共鳴周波数が31_{P 以下の核種を扱うチャンネ} ルを LF (Low Frequency) チャンネルと呼ぶ。 ただし31_{P から}15_{N までの核は、さらに低い共} 鳴周波数の核種を低周波核と呼ぶ都合上か ら、あまり低周波核とは呼んでいない。15_N よりも共鳴周波数の低い核に関しては、専用 プローブを必要とし、31_{P から}15_{N までの核種} とは区別して、低周波核として取扱っている。

装置構成

CFH3 核プローブを用いることにより、13_C、 19_F、1_{H の 3 核種に対して同時に RF を出力し、} 様々な測定を行うことを称して便宜的に CFH Fig. 1 CFH 測定用装置構成。 50C5FH/FG2 プローブ 追加 HF 用 パワーアンプ 追加 FSY Temp コネクタ FG コネクタ HF2 コネクタ HF1 コネクタ LF1 コネクタ Lock コネクタ HF2（19_F） Tuning LF1（13_C） Matching LF1（13_C） Tuning HF2 チャンネル用 BEF HF1 チャンネル用 BEF HF1（1_H） Tuning 測定と呼ぶ。CFH 測定を行うためには、やや 特殊な装置構成が必要である。ECA シリーズ において標準の 2 チャンネル仕様と異なる構 成は、フィールドグラジエント付きの CFH3 核測定用プローブ C5FH/FG2、さらに 3 つの 核種の共鳴周波数を生成するための +1 基の

FSY (Frequency SYnthesizer)、19_{F チャンネ}

ルの RF を増幅するための +1 基の HF 用パワ

ーアンプ、19_{F 用プリアンプと}1_H、19_{F の}

Isolation 用のバンド除去フィルタ(BEF:Band

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 6 kHz kHz kHz 40␮s FT Fig. 2 40µs の矩形パルスによる 励起帯域 (simulation)。 Fig. 3 CF3CHFCF2OCH2CH3の19F{1H}-NMR スペクトル。 65 kHz ppm CF3 - -CHF--CF2 -Fig. 4 CF3CHFCF2OCH2CH3の13C{1H}-NMR スペクトル ppm。 CF3 - -CHF--CF2- CF3 --CF2 -ppm Fig. 5 CF3CHFCF2OCH2CH3の13C{1H,19F(−150ppm)}-NMR スペクトル ppm。 65 kHz ppm 14 kHz 14 kHz Fig. 6 CF3CHFCF2OCH2CH3の19F{1H}-NMR スペクトル ppm。 は共鳴周波数が近いため、それぞれの RF が 漏れて干渉するのを防ぐために必要となる （Fig. 1）。 19

_F-NMR

19_{F は共鳴周波数が高く、天然存在比も 100%} であることから、非常に感度のよい核種であ り、1_{H の 83%、}13_{C の実に 4760 倍の感度を有} する。またスピン量子数が 1/2 であるため、 線幅も細く、信号の検出は極めて容易である。 しかしながら、19_{F-NMR にとって最大かつ重} 大な障害は、その化学シフト範囲が広いこと にある。化学シフトが大きいことは、シグナ ルの分離を良くするため、スペクトルを解析 する上では有効である。ところが、信号があ まりに広い範囲に分散している場合、RF パ ルスによる励起が不十分となり、定量精度を 著 し く 低 下 さ せ る 。 こ れ は 現 代 の 高 磁 場 NMR において特に顕著で、例えば 600MHz の NMR では、1_{H がおおよそ 10ppm であるか} ら、6kHz 程度の周波数範囲であるのに対し、 1000ppm 以上ある19_{F の化学シフト範囲は、} 600kHz 以上におよぶ。矩形パルスによる励起 プロファイルは、そのパルスをフーリエ変換 した結果と等価になる。従って、パルス幅を t とした時、± 1/t の広がりを持ち、約 95%の 励 起 帯 域 は 1 / 4 t と な る 。 こ の こ と か ら 、 6kHz 程度の帯域を励起するのに必要な矩形 パルスは 40µs（Fig. 2）であるが、600kHz の 帯域を励起するのに必要な矩形パルスは 0.4µs となり、現在の NMR 分光計やプローブの性 能では19_{F の全化学シフト範囲を充分に励起} することは事実上不可能である。実サンプル においては、1000ppm もの化学シフト範囲に 信号が散らばっていることはほとんどない が、100 ∼ 200ppm 程度のシフト範囲におよ ぶことはよくある。たとえ 200ppm であって も、その励起には 2µs の矩形パルスが必要で あり、標準的なプローブにおける 5 ∼ 10µs の 90 °パルスでは、不十分であるといわざるを 得ない。また、スピン結合定数は2_J FFで 150 ∼ 300Hz、3_J FF や4JFF でも 0 ∼ 100Hz と構造 に応じて非常に多岐にわたる［1］。多結合を 介すれば結合定数が小さくなるばかりではな いため、解析の上では注意が必要となる。 Fig. 3 に CF3CHFCF2OCH2CH3

(1,1,2,3,3,3-hexafuluoropropyl ethyl ether)の19_F{1_H}-NMR

スペクルを示す。4 種類の19_{F 信号が現れてい}

ppm ppm CF3- -CF2- -CHF--CF2- CF3 -


    _ _ _ 
   





Fig. 7 CF3CHFCF2OCH2CH3の13C{1H,19F(−80ppm)}-NMR スペクトル ppm。 Fig. 8 19_{F ２チャンネル照射シーケンス。} Fig. 9 19_{F ２チャンネル照射パルスプロ} グラム設定画面。 Fig. 10 CF3CHFCF2OCH2CH3 の13C{1H,19F(−80ppm,−212ppm)}-NMR を逆ゲート付きデカッ プリング法により定量測定した結果。それぞれの信号は13_{C、１個分であり、理想的} に完全デカップリングされて線幅が等しくなれば、全ての信号強度が同一になる。 tri チャンネルが- 80ppm、 qua チャンネルが- 212ppm に設定されている。 ト範囲は 135ppm におよんでいる。この場合 には、500MHz の装置で測定しているので、 最高磁場の信号と最低磁場の信号のシフト差 は約 65kHz となっている。

含フッ素化合物の

1

_{H や}

13

_C-NMR

19

_{F デカップリング}

含フッ素化合物の1_{H-NMR や}13_{C-NMR を測定} する際問題となるのが、スピン量子数 1/2 で ある19_{F 核とのカップリングである。}1_{H にお} いては2_J HFや3JHFが∼ 50Hz あり、13C では 1_J CFが 200 ∼ 300Hz、2JCFが 20 ∼ 30Hz、3 ∼ 5 JCF も∼ 10Hz 程度ある［1］。特に13_{C-NMR を測} 定する場合には、13_{C と}19_{F とのカップリング} により13_{C の信号が複雑に分裂するため、信} 号強度が分散し、大幅に S/N を低下させる。 たとえば CF3- 基の場合、13C の信号は 4 重線 に分裂し、信号強度は最大でも 40%に低下す る。さらに隣接基が -CF2- であれば、それぞ れが 3 重線に分裂するため、信号強度は最大 で 20% に低下する。多くの含フッ素化合物で はさらに複雑に分裂するので、ただでさえ感 度の良くない13_{C-NMR が、事実上観測できな} くなる。また、直接結合の1_J CF が 200 ∼ 300Hz 程度もあるため、CF3- の信号で化学シ フトを中心に 600 ∼ 1000Hz の範囲に広がる。 これは 400MHz の場合 6 ∼ 10ppm に相当し、 化学シフトが近接する信号どうしが重なるた めに、解析を非常に困難にする。Fig. 4 に CF3CHFCF2OCH2CH3の13C{1H}-NMR スペク トルを示す。 CH3基および CH2基は1H とのカップリング がデカップルされたシングレットの信号とし て観測されているが、低磁場側の CF3基、 CF2基、CHF 基では、19F とのカップリング により、複雑に信号が分裂している。CF3基 では、直接結合する19_{F との}1_J CF が 281Hz、 隣接する CFH 基との2_J CFが 25Hz、さらに隣 の CF2基との3JCFが 1.4Hz と 3.6Hz の dd で、 32 本に分裂している。CF2基では、直接結合 した環境の異なる２つの19_{F との}1_J CFが約 265Hz で、CHF 基との2_J CFが 23Hz、さらに CF3基との3JCFが 2.17Hz で分裂している。 CHF 基では、1_J CFが 200Hz で、両隣の炭素 に結合した19_{F との}2_J CFが概ね 35Hz なってい る。ただでさえ感度の悪い13_{C の信号が、CF} 3 基の場合、最も強度のある信号ですら、シン グレットの 1/20 程度の信号強度になってしま う。このため含フッ素化合物の13_{C-NMR を測} 定する際には、1_{H と同時に}19_{F のデカップリ} ングを行う必要がある。この場合にも前項で 示した化学シフトの広さが極めて問題にな る。 Fig. 5 は 19_{F も デ カ ッ プ リ ン グ し た} CF3CHFCF2OCH2CH3の13C{1H,19F}-NMR スペ クトルであるが、Fig. 4 と差がなく、19_{F と} 13_{C のカップリングにより、}13_{C の信号が激し} く分裂してしまっている。このとき19_{F のデ} カップリングには、1_{H と同様の WALTZ-16}

(Wideband, Alternating-phase, Low-power Techniquefor Zero-residual spliting) [2、3] を

用い、デカップリングパルス幅を 32µs (ハー ドパルスの 1/16 の出力)、オフセットを19_{F の} 化学シフトの中心（− 150ppm, Fig. 6 の①）と している。 デカップリングにおいても、有効帯域は 90 度パルス幅を t とした時の 1/4t になる。高磁 場における13_{C のデカップリングなどでは、} コイルに入力できる電力に対して、有効帯域 が充分に確保できないため、帯域を拡げるた め の コ ン ポ ジ ッ ト パ ル ス デ カ ッ プ リ ン グ (CPD) が種々開発されている。CPD における デカップリングの有効帯域は、コンポジット パルス列によって異なるが、有効帯域の CW （ContinuasWave: 連続掃引）に対する拡張比 を Figure of merit( Ξ ) と呼びます。 デ カ ッ プ リ ン グ 帯 域 を 考 え て み る と 、 WALTZ-16 のΞ (Figure of merit) は 1.8 なの で、Ξ× 1/4t は 1 1.8 × ＝ 14062［Hz］ 4 ×（32 × 10− 6_［s］） で、有効帯域は 14kHz しかない。このサンプ ルでは低磁場の信号と高磁場の信号が 65kHz も離れているため、それぞれの信号までデカ ップリングが届かないのである。そこで、同 じ条件でデカップリングのオフセットを低磁 場の信号の付近（− 80ppm, Fig. 6 の②）に合 わせると、Fig. 7 のような結果になる。 この場合、低磁場の19_{F はデカップリングさ}

MPF

7

MPF

8

MPF

9

MPF

10 kHz kHz kHz kHz 23[kHz] 27[kHz] 30[kHz] 34[kHz] 160 [kHz] kHz Fig. 11 MPFn シリーズのデカップリングプロファイル。 150[kHz] kHz Fig. 12 WURST20 (1ms, 200kHz) の反転プロファイル。 Fig. 13 WURST20 (1ms, 200kHz) デカップリングのデカップリングプロファイル。 れたものの、高磁場の19_{F (− 212ppm) とのカ} ップリングにより、CHF 基、CF3基、CF2基 の13_{C 信号がそれぞれ 2 重線になるため、本} 来 5 種ある13_{C の信号が、8 本になってしまっ} て い る 。 こ の よ う に 、 含 フ ッ 素 化 合 物 の 13_C{1_H,19_{F}-NMR を観測するためには、超広帯} 域のデカップリングが必要である。もちろん デカップリングのパルス幅を短くすれば、あ る程度は広帯域化が実現できるが、そのよう な高出力のデカップリングは、ラジオ波の吸 収によるサンプルの発熱を誘起するため、不 用意に使用するとサンプルに深刻なダメージ を与える恐れがある。

Multi Site Decoupling

マルチシーケンサ方式を採用する ECA シリ ーズでは、一つのチャンネルに対して複数の RF 源をアサインすることが可能である。そ こで、異なった照射オフセットの RF 源から 同時にデカップリング照射を行うことによ り、効率よく全領域のデカップリングを実現 することができる。また、それぞれの帯域を 限定できるために出力を抑えることができ、 発熱の問題を簡単に回避できる（Fig. 8、９）。 CF3CHFCF2OCH2CH3では、19F の信号が− 80ppm 付近と−210ppm 付近の 2 カ所にそれ ぞれ集まっているので、それらの領域をそれ ぞれ独立してデカップルすることにより、19_F と の カ ッ プ リ ン グ が 完 全 に 消 去 さ れ た 13_C{1_H,19_{F} スペクトルを得ることができる} （Fig. 10）。多くの含フッ素化合物に見られる ような、それぞれがある程度離れたいくつか の領域に信号が集中するサンプルに大変有効 である。ただし、それぞれのデカップリング が互いに干渉するような条件では、デカップ リングの効率をかなり悪化させるので、オフ セットが近いなどの理由で干渉が起きた場合 には、それぞれのコンポジットパルスデカッ プリング列を変更したり、デカップリング出 力を下げるなどの検討が必要になる。 この手法は19_{F の信号が広い化学シフト範囲} にまんべんなくあるようなケースには適用で きない。このような場合には、後述の超広帯 域デカップリングが有効になる。

Adiabatic Pulse Decoupling

弊社で開発された、周波数スイッチングによ る広帯域デカップリング法である MPFn シリ ーズ［4、5］は、13_{C のデカップリングなどに} 広く用いられている。MPFnシリーズのΞ (Figure of merit)は、MPF7が 9.2、MPF8が 10.6、MPF9が 12.0、MPF10で 13.4 となる。デ カップリングパルス幅を 100µs とすると、有 効デカップリング帯域はそれぞれ 23kHz、 26.5kHz、30kHz、33.5kHz となる。実測によ るデカップリングプロファイルは Fig. 11 の ようになる。これらでもかなりの広帯域化を 実現できるが、それでも19_{F のデカップリン} グには不足する。近年、超広帯域のデカップ リング法として、CHIRP や WURST(Wideband, Uniform Rate, and SmoothTruncation)［6-10］ といった Adiabatic Inversion パルスによるデ

ppm 0 0 0 0 0 0 0 0 kHz 3.6 kHz カップリングが用いられている。これらの Adiabatic Inversion パルスは、パルスに位相 変調をかけることにより、極めて広い帯域の 磁化を反転させることができる。

CHIRP や WURST では、パルス位相 (Phase) を次式に従って変調させている。 1 φ（t）＝φ0＋ kt2 2 ここで、k は帯域(Hz)／パルス幅(s)で定義さ れる変調速度を表し、t はパルスを形成する 各時間を表す。 CHIRP や WURST では掃引する帯域を位相変 調のパラメータとして持っているので、目的 とする測定条件に合わせてパルスを作成し直 す必要がある。ECA シリーズでは、成形パル スを定義式から自動生成するため、引数とし て与えるだけで必要な Adiabatic Pulse が作成 できる。また、WURST では掃引する帯域の 両端の応答を鈍くすることにより、プロファ イルのエッジを滑らかにしている。このため に、出力強度にも変調をかけ、ソーセージ（ド イツ語で wurst）型のパルス波形としている。 出力強度(Amplitude) は次式による。 ω1（t）＝ω1（max）

｛

1 −sin（βt） n

｝

このとき、−π/2 < β t < + π/2 であり、次 数 n は勾配の激しさを表している。上のグラ フは 20 次の変調で、次数が小さいほど両端が 鈍感になる。Fig. 12 にパルス幅 1ms、帯域 200kHz とした WURST20 パルスの磁化の反 転プロファイルを示す。1ms の矩形波による 励起帯域が 250Hz であるから、Adiabatic パ ルスがいかに広い帯域を反転できるかがわか る。このような超広帯域 Inversion パルスを 用いて、極めて広い帯域のデカップリングを 行うことができる。WURST によるデカップ リングでは、WURST パルスを Tycko と Pines の方法による 5 step の位相サイクルを、 さらに MLEV4［11-15］コンポジットパルスサ イクル RRRR (R=SP0 SP150 SP60 SP150 SP0) としており、一組のデカップリング列はパル ス 20 個分の長さになる。デカップリングは FID の取り込み時間中に照射する。取り込み 時間は掃引幅とデータポイント数に依存する ので、コンポジットパルスデカップリングの サイクルを有効に働かせるためには、あまり 長いパルス幅でのデカップリングは好ましく ない。また、Adiabatic パルスでは位相変調を 利用しているため、より広い帯域のパルスを 作成するためには非常に速い速度で RF 位相 を掃引しなければならず、ハードウェア的な 制限による限界がある。

Fig. 14 CF3CHFCF2OCH2CH3の13C{1H, 19F (−150ppm)}-NMR スペクトル。WALTZ16 で

は全くデカップリングされていなかった（Fig. 5）が、WURST では全ての19_F-13_{C カ} ップリングがデカップリングされている。 H 1 : n oi l li M r e p st r a p : X 0. 5 40. 3.0 2.0 10.

Y : parts per Million : 13C

130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0 H 1 : n o il l i M r e p s t r a p : X 0. 5 4.0 3.0 20. 1.0

Y : parts per Million : 13C

130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0 Fig. 15 左： CF3CHFCF2OCH2CH3の1H-13C HMQC（19F デカップリング無し） 右：19_{F デカップリングを組み合わせた}1_H-13_{C HMQC。}

Fig. 16 1ms の E-BURP1 パルスによる磁化の励起特性 (simulation)。 4 kHz

0 0 0 0 0 0 0 0

kHz Fig. 17 1ms の RE-BURP パルスによる磁化の反転特性 (simulation)。

Fig. 13 に デ カ ッ プ リ ン グ パ ル ス 幅 1ms （ WURST パ ル ス 一 個 分 の 長 さ ）、 帯 域 200kHz とした時のでカップリングプロファイ ルを示す。概ね 150kHz がデカップリングさ れているので、この場合のΞは約 600 になる。 このように Adiabatic デカップリングは、非 常に広い帯域をデカップルできる。Fig. 14 は WURST デカップリングを CF3CHFCF2OCH2CH3 の13_C{19_F,1_{H}-NMR に適用した例である。若干} のデカップリングサイドバンド生じてるが、 全ての19_{F とのカップリングをほぼ消去する} ことができている。 CF3CHFCF2OCH2CH3の様に19F の信号がい くつかのグループを作っている場合には、前 述のマルチサイトデカップリングの方が、サ ンプルの発熱防止や、測定の容易さの面で優 れているが、19_{F の信号が広範囲にまんべん} なく存在している場合には、WURST デカッ プリングを使用する必要がある。

多次元測定

C5FH/FG2 プローブは、フィールドグラジエ 2D=IA  ! $ '   # &  " % ! !! !$ Amplitude    ! " # $ % & ' 

CPD

19

_F

13

_C

Gz

t

1

1/2J

1/2J

E-BURP1 RE-BURP F/2 F/2 acquire

X : parts per Million : 19F

Y : parts per Million : 13C

120.0

110.0

100.0

90.0

X : parts per Million : 19F

Y : parts per Million : 13C

120.0 110.0 100.0 90.0 Fig. 18 mrs-HMQC のパルスダイアグラム。 Fig. 19 CF3CHFCF2OCH2CH3の mrs-HMQC ２次元スペクトル。 Fig. 20 CF3CHFCF2OCH2CH3の HMQC ２次元スペクトル。 ントコイルが備わったことにより、その応用 範囲を広げた。特に多次元 NMR 測定が短時 間で速やかに測定できる。これにより、13_C と1_{H の相関を測定する際に}19_{F のデカップリ} ングを組み合わせてスペクトルを解析しやす くすることができ（Fig. 15）、また、19_{F と}1_H の相関なども検出することができる。矩形パ ルスを使用したパルスシーケンスでは、通常 の19_{F のパルス幅による励起範囲から、検出} 可能な19_{F の化学シフト範囲がある程度 (50} ∼ 100ppm 程度) 限定されるが、ECA シリー ズでは CFH 測定用のシーケンス群を標準で 搭載している。 19_{F が絡んだ 2 次元測定は、}1_{H や}13_{C のみの 2} 次元測定とは大きく異なる難点がある。前述 の通り、とにかく問題になるのが、極めて広 い化学シフトである。2 次元の場合、処理可 能なデータサイズの制限から、データポイン ト数を少なめに測定するのが一般的である。 ところが、観測範囲の広い19_{F では、データ} ポイントが少ないと取り込み時間が短かすぎ て信号を検出できなくなる。また、マルチパ ルス実験である 2 次元 NMR では、それぞれ のパルスが全ての磁化を期待通りに操作でき ないと、最終的な信号強度が著しく低下する ために、相関信号を検出できない。そこで、 それぞれの磁化を個々に励起するための測定 法や、前項で登場した超広帯域の反転パルス などが利用されたパルスシーケンスが提案さ れている。 ここでは、HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) 測定の観測核側パルス を選択励起パルスである BURP (Band-selec-tive, Uniform Response, Pure-phase)［16］パル

スのうち、励起用の E-BURP1 パルス（Fig. 16） とリフォーカス用の RE-BURP パルス（Fig. 17） で置き換えた、mrs-HMQC (multiple region selective HMQC :パルスダイヤグラム Fig. 18）［17］の測定結果を Fig. 19 に示す。19_{F の} RF のオフセットを− 80ppm とした矩形パル スで測定した通常の HMQC では、− 210ppm の19_{F 信号に対する相関信号は検出されてな} い（Fig. 20）が、mrs-HMQC では E-BURP1 や RE-BURP パルスを shifted laminar パルス［17］ として用い、信号のある複数の領域を選択的 に励起およびリフォーカスするため、全ての 相関信号が観測されている。

参考文献

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