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μg の範囲で標準液を添加して調製した。なお、検量線

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Academic year: 2021

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(1)

過大腎クリアランス時における Cefazolin の推奨投与方法の解明

特定チーム(課題番号 )

研究期間:令和元年 月 日〜令和 年 月 日 研究代表者名:川野恭雅

.背景

感染症、膵炎、全身熱傷などにより全身性炎症反応症 候 群(systemic inflammatory response syndrome;

SIRS)が生じた場合、腎機能障害や肝機能障害を含む 臓器不全が合併症として現れることが多い。そのため、

SIRS が進行した状態では、薬物クリアランスは低下し、

薬物血中濃度が上昇するリスクがある。しかし、臓器不 全の合併症がない、もしくは、臓器不全を合併する前の 超急性期の SIRS の状態では、薬物の腎クリアランスは 増大し、薬物血中濃度は低くなることが報告されている

(Roberts et al. 2009)。この現象は ARC(augmented re- nal clearance)として提唱されている(Cook et al., 2019)。

ARC は SIRS の存在や、カテコラミンなどの血管作 動薬や輸液の負荷投与による心拍出量の増大により、腎 血流量が増加することで発現することが知られている

(Chen et al. 2020)。ARC はクレアチニンクリアランス

(creatinine clearance; CCr)が mL/min/ . m 以上 を認めた場合に診断され(Bilbao-Meseguer et al. 2018)、

集中治療領域の患者では約 %以上の割合で ARC を発 現することがわかっている(Kawano et al. 2016)。その ため、感染症、膵炎、全身熱傷など SIRS が現れやすい 病態に対して腎排泄型の薬剤を使用する際は、抗菌薬の 効果減弱および低感受性菌の出現を招くリスクが高い。

実際に、集中治療領域の患者では、抗菌薬のバンコマイ シン(Baptista et al. 2012)、メロペネム(Troger et al.

2012)、ドリペネム(Udy et al. 2012)の血中濃度が ARC により低値であったことが報告されている。また、ARC が生じやすい要因として、若年者( 歳未満)、男性、

外傷患者、基礎疾患がないことなどが挙げられる(Udy et al. 2011)。このことから、ARC が発現するリスクの 高い疾患のひとつに、交通事故や墜落による高エネル

ギー外傷が考えられる。高エネルギー外傷の患者の多く は、治療初期に感染予防として第一世代セフェム系抗菌 薬のセファゾリン(cefazolin; CEZ)を投与するが、CEZ は ARC により十分量の体内濃度を得られていない可能 性がある。しかし、外傷による ARC 発現患者における CEZ の体内動態を明らかにした報告は過去にない。

本研究では、まず、実臨床で血中濃度測定をされるこ とがない CEZ の血中濃度測定方法を確立し、高エネル ギー外傷患者における ARC の発現状況および ARC に よる CEZ の体内動態変化を明らかにする。集中治療領 域での ARC 発現患者の CEZ 体内動態を解析し、CEZ 推奨投与量を明らかにすることは臨床的転帰の改善に大 きく貢献できる可能性が期待される。

.方法

. .試薬

検量線作成のための標準品として CEZ(Fujifilm Wako Corp. Osaka, Japan)を用いた。また、内部標準品(Inter- nal Standard; IS)には cloxacillin(CXA; Fujifilm Wako Corp. Osaka, Japan)を用いた。CEZ 標準品はドラッグ フリー血清(Thermo Fisher Scientific. Tokyo, Japan)

で希釈し、標準液を作製した。超純水、アセトニトリル、

酢酸アンモニウム、ギ酸は高速液体クロマトグラフィー

(high-performance liquid chromatography; HPLC)用 を使用した。

. .標準液および品質管理(QC)資料の作製 CEZ および IS の各標準液は、薬物を精密秤量したの ち、超純水で溶解し、保存用標準液とした。検量線用の 薬物添加試料はドラッグフリー血清

μ

L 当たり 〜

μg の範囲で標準液を添加して調製した。なお、検量線

( 〜

μg/mL)は IS( μg/mL)を含有させ、内部

― 福岡大学研究部論集 F

(2)

標準法によって作成した。品質管理(quality control;

QC)試料は検量線用の薬物添加試料と同様の方法で、

ドラッグフリー血清

μL 当たり 〜 μg の範囲で調

製し、− ℃で保管して三か月以内に使用した。

. .分析システムにアプライするサンプルの作製 薬物添加試験は、ドラッグフリー血清

μL に CEZ

および IS を添加した混合液に対して、アセトニトリル

μ

L 加え、十分に撹拌した。 , ×g で 分間遠 心分離を行い、上澄み

μL を回収した。更に、この上

澄み液に超純水

μL を加え、よく混合したものを液体

クロマトグラフ質量分析計(Liquid Chromatograph- Mass Spectrometry; LC-MS/MS)にアプライした。こ れらの CEZ の前処理の方法は Christopher らの報告を もとに行った(Christopher et al. 2015)。

. .分析装置および条件

本分析システムには ACQUITY UPLC(Waters Corp.

Tokyo, Japan)と四重極型 MS/MS 装置(Waters Corp.

Tokyo, Japan)を接続したものを用いた。分析カラムは 逆相カラム BEH C (長さ mm、内径 .mm、粒径

μ

m; Waters Corp. Tokyo, Japan)を使用し、カラム 温度は ℃に設定した。移動相はAに .%ギ酸および mM 酢酸アンモニウム溶液を、移動相Bにアセトニ トリルを用いた。カラム流量 .mL/min、試料注入量

μ

L とした。

. .検量線の作成

内部標準法を用いた検量線の直線性は検量線用標準液

( , ., , , ,

μ

g/mL)および IS(

μ

g/mL)

をドラッグフリー血清に添加して前処理を行い、LC-MS /MS にて MRM 測定をして検討した。既知濃度(x)に 対して、CEZ/IS のピーク面積(y)を最小 乗法によ る直線回帰分析で算出し、検量線とした。検出限界はシ グナル/ベースラインノイズ比が を限界値とした。

. .研究デザイン

本研究は前向き観察研究で行った。 年 月 日よ り、福岡大学救命救急センター(以下;当センター)に 搬送された患者で、 歳以上、外傷、治療のために CEZ 回 g の投与を必要とする、動脈圧カテーテルが挿入 されている、をすべて満たす患者のうち、同意を取得で きた患者を対象患者とした。また、当センターは三次救 急医療施設のため、当センターに搬送された外傷患者は 高エネルギー外傷であると判断した(以下;外傷患者)。

なお、来院 時 心 肺 停 止、妊 婦、実 測 CCr が mL/min 以下および透析中の患者は除外した。

本研究は、「人を対象とする医学系研究に関する倫理 指針」を遵守して実行し、福岡大学医に関する倫理委員

会の承認を得て実施した(承認番号 ‐ ‐ )。個人デー タは個人情報保護に十分配慮した上で管理した。

. .対象患者

対 象 患 者 を ARC 群(実 測 CCr mL/min 以 上)と 正常腎機能群(Normal 群;実測 CCr 〜 mL/min)

の 群に分けて、CEZ の体内動態変化を評価した。ま た、患者の診療録を用いて、年齢、性別、体重、患者背 景(基礎疾患、既往歴、薬歴)、入院時診断、臨床所見、

生化学検査値を収集した。

. .ヒト検体 CEZ 血中濃度測定

CEZ は 回 g を 時 間 か け て 点 滴 静 脈 注 射 を 行 い、初回投与時のピーク時および初回投与から 時間後 のトラフ時に血液を採取した。血液を遠心分離し、上澄 みを回収した。上澄み

μL に対し、アセトニトリル μL を混合し、除タンパク処理を行った。その混合液を

遠心分離し、上澄み

μ

L を超純水

μ

L と混合し、LC -MS/MS 測定用サンプルとした。

. .統計解析

本文中の数値は平均値±標準偏差で示した。Normal 群が 例と症例数が少なかったため、ARC 群と Normal 群の 群間統計学的な比較は行っていない。

.結果

. .CEZ 測定法の確立

CEZ 標準液および IS 標準液をポジティブ ESI 法およ びネガティブ ESI 法で測定した結果、いずれもプロト ン化分子[M + H]である / .(CEZ)、 /

(IS)で感度よく検出された(CES; . ×e ,IS; .

×e )。更に、コーン 電 圧 を 、 、 、 、 V に そ れぞれ設定して測定した結果、CEZ と IS はともに V のコーン電圧により最も強いイオン強度が検出された

(CES; . ×e ,IS; . ×e )。そのため、コーン電 圧は V に設定した。また、MS スキャンで得られた上 記プロトン化分子をプリカーサーイオンとして、MS/MS 分析を行ったところ、CEZ は .(コリジョンエネル ギー V)、 .(コリジョンエネルギー V)、IS は

.(コリジョンエネルギー V)において、それぞ れプロダクトイオンが検出された。これらの結果より、

MRM トランジションは CEZ が / .→ .、

.の 通りと、IS が .→ .に設定した。保 持時間は、CEZ は .分、IS は .分であった(Fig. )。

以上より、LC-MS/MS を用いた血清中 CEZ 濃度測定法 が確立された。

(3)

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 Time

%

0

MRM of 3 Channels ES+

TIC 4.87e6 3.19

4.82

(a)

(b)

min

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50

%

0 100

MRM of 3 channels,ES+

TIC 20200902-7 Smooth(Mn,2x2)

peak 1 Patient 1

1.945e+005 4.10

Cefazolin 2.97

(a)

(b)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

ἦὊἁຜࡇ ἚἻἧຜࡇ

ᘉɶ CEZ ຜࡇ (µg/mL)

n = 7 n = 7

. .臨床検体の CEZ 検出

CEZ を投与された患者検体から、結果 .で得られた 方法で CEZ が検出できるか検討した。その結果、患者 検体からも CEZ および IS のピークを検出することがで き、臨床検体にも応用できることが明らかと な っ た

(Fig. )。

. .対象患者の CEZ 血中濃度

対象患者の詳細について Table に示す。ARC 群は 例であり、Normal 群は 例であった。ARC 群の実測 CCr は .± .mL/min で あ り、Normal 群 の 実 測

CCr は .± .mL/min であった。

ARC 群の CEZ 血中ピーク濃度は .± .μg/mL で あり、 時間後トラフ濃度は .± .μg/mL であった。

一方、Normal 群の CEZ 血中ピーク濃度は .± .

μg/mL であり、 時間後トラフ濃度は .± .μg/mL

であった(Fig. )。

.考察

集中治療領域の患者では、ARC が発現する可能性が 高く、それを想定した薬物投与量設計が重要である。特 に、外傷患者では ARC 発現リスクが高いこと、感染予 防に腎排泄型である CEZ を第一選択薬として用いるこ とから、ARC 発現外傷患者における CEZ の体内動態変 化を解明することは、患者の早期回復に繋がると考えら れる。本研究では、実臨床では測定されていない CEZ の血中濃度測定法を確立し、それを用いて、外傷患者に おける ARC 発現と CEZ の体内動態変化について評価 した。その結果、CEZ の血中濃度測定には LC-MS/MS

Table .対象患者プロフィール

ARC group

( = )

Normal group

( = ) 男/女(n)

年齢(歳)

体重(kg)

Cr (mg/dL)

Actual measured CCr(mL/min) Cockcroft-CCr (mL/min) eGFR (mL/min/1.73 m

2

)

.± .

.± .

.± .

.± .

.± .

.± .

.± .

.± .

.± .

.± .

.± .

.± . Cr: creatinine, CCr: creatinine clearance,

eGFR: estimated glemerular filtration rate.

All values are mean standard deviation (SD).

Figure .血中 cefazolin(CEZ)および Internal Standard (IS)

の検出方法の確立

(a)は CEZ のピーク、(b)は IS のピークを示す。

Figure .臨床検体(血中)における CEZ および IS の検出

(a)は CEZ のピーク、(b)は IS のピークを示す。

Figure .各臨床検体における血中 CEZ 濃度

○は Normal 群、●は ARC 群 ARC: augmented renal clearance.

― 福岡大学研究部論集 F

(4)

を用いることで、迅速で簡便な測定方法を確立した。ま た、外傷患者の多くが ARC を発現していることが明ら かになった。従って、外傷患者では ARC を想定した CEZ の投与量設計が必要であると考えられる。

CEZ は国産初のセファロスポリン系誘導体であり、

グラム陽性菌および陰性菌に抗菌スペクトルを有する。

その作用は殺菌的で、特にブドウ球菌をはじめとするグ ラム陽性菌やグラム陰性桿菌の大腸菌、肺炎桿菌に対し て強い抗菌力を示す(JAID/JSC, 2019)。そのため、外 傷患者の創部感染症で起炎菌になりやすいブドウ球菌を 含むグラム陽性菌をカバーする目的で、CEZ は治療初 期より投与開始されることが多い(JAID/JSC, 2019)。

CEZ の体内動態は、静脈注射後より速やかに高い血中 濃度が得られ、体内でほとんど代謝されることなく高濃 度で尿中に排泄される。従って、ARC が発現した状態 では CEZ の腎排泄が上昇し、十分な体内濃度を保持で きていない可能性が考えられる。

本研究では、臨床現場で測定されることのない CEZ の血中濃度測定法の確立から行った。CEZ の血中濃度 測定法は、HPLC を用いた方法もしくは Bacillus subtilis ATCC を検定菌とする Disc 方による Bioassay 方が ある(Hamada et al. 1993)。集中治療領域の患者では、

迅速性が優先されることから、測定時間の早い HPLC を利用した LC-MS/MS による測定法の確立を選択し た。CEZ は タ ン パ ク 結 合 率 が − %で あ り(LTL- pharma. 2018)、CEZ の血中濃度を測定するためには除 蛋白処理を行う必要がある。今回、除蛋白処理としてア セトニトリルを用いたが、その結果、約 %以上の回収 率で CEZ を測定することができ(data not shown)、十 分な精度を確保することが出来た。また、本測定方法は、

検体採取から 分以内に血中濃度測定まで至ることが き、臨床現場での迅速な CEZ の投与量設計が可能にな ると考える。これらの方法を用いて、外傷患者の血中 CEZ 濃度測定を行った。その結果、Normal 群の CEZ 血中ピーク濃度は .± .μg/mL であった。セファ メジンの医薬品情報データでは、健常成人男性( =

)に対して CEZ を g 点滴静脈注射した場合、CEZ 血中ピーク濃度は .± .

μ

g/mL であったと報告さ れている(LTL-pharma. 2018)。従って、本研究で用い た CEZ 血中濃度測定法は、それに近い値を得ており、

十分な精度であるといえる。

この測定法を用いて、ARC 群の CEZ 血中ピーク濃度 を測定した結果は .± .

μ

g/mL であり、Normal 群 .± .μg/mL と比較して大幅に低値であった。

通常、CEZ g を患者に投与した場合、創傷部位(筋組 織)の CEZ ピーク濃度は約

μg/mL であり、血中から

の筋組織移行率は約 %である(LTL-pharma. 2018)。

つまり、ARC が生じた患者では、創傷部位 CEZ 濃度は 更に低値となることが考えられる。従って、ARC 発現

外傷患者に対して、CEZ の通常用量である g/回投与 では、感染予防効果の減弱および低感受性菌の出現頻度 増加につながる可能性がある。また、ARC 発現外傷患 者の Cockcroft-Gault CCr だけみると ARC の発現には 気付かない可能性があるが、多くの外傷患者は ARC 発 現リスクが高いと言える。つまり、外傷患者では ARC 発現を想定した抗菌化学治療が必要と考えられる。

本臨床研究は、症例数の少ない単施設観察研究である ことに加え、ARC 群と比較すべき Normal 群を十分に 集めることができなかったことから、ARC 発現外傷患 者に対する CEZ の推奨投与量などを導き出すまでには 至ることができなかった。しかし、本検討では外傷患者 において ARC 発現が多くみられること、感染予防のた めに必要な CEZ が通常投与量では十分な血中濃度を得 られていない可能性が高いことを明らかにした。外傷患 者では ARC 発現を想定し、CEZ 投与量と治療効果に関 して注意深くモニタリングしていく必要がある。

参考文献

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― 福岡大学研究部論集 F

参照

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