臨床材料より分離される緑膿菌の抗 MRSA， 抗 Candida 作用について

はじめに

我々は，1992 年に緑膿菌（Pseudomonas aerugi-

株に高い抗微生物活性のあることを報告した

． 1993 年には緑膿菌の抗 MRSA 活性におよぼす 14 員環マクロライド剤の影響について検討

，マク ロライド剤のあらたな有用性を示唆する報告をお

こなった

．2001 年 2 月には緑膿菌感染症研究会 に お い て，最 近 の 抗 MRSA 活 性 に つ い て 報 告 し

，現在でもなお緑膿菌の抗微生物活性が十分 に認められることを明らかにした．

今回我々は，寒天平板反転法（Cross streak as- say on reversed agar plate method）を用いて，臨 床材料より分離した 34 株の緑膿菌について， その 抗 MRSA 活性，抗

活性を調べ，これらの 安定性および血液による影響についても検討し た．

臨床材料より分離される緑膿菌の抗 MRSA，

抗 Candida 作用について

順天堂大学医学部臨床病理学講座

近藤 成美 佐藤 尚武 山田 俊彦 宮崎彩記子 小栗 豊子 猪狩 淳

（平成 13 年 8 月 30 日受付）

（平成 13 年 12 月 28 日受理）

原 著

緑膿菌が他の菌種に対して抗菌作用を示すことは古くから知られており，緑膿菌の産生する抗菌物質 についても，おもにその有用性と応用性という観点から過去に様々な検討がなされてきた．

緑膿菌と MRSA やCandidaなどの，菌相互の臨床的な関係に着目した検討があらためてなされるよう になったのは 1990 年代当初からである．今回我々は，院内感染原因菌種として注目されている MRSA

やCandidaに対する緑膿菌の発育抑制作用とその安定性について，検討した．

実験に使用した緑膿菌，MRSA は臨床分離株で，Candidaは教室保存株（C. albicans，serotype A 1012）

を用い，培地には Mueller-Hinton 寒天平板および 5％ 脱線維素ヒツジ血液加 Mueller-Hinton 寒天平板を 用いた．抗菌活性は寒天平板反転法により判定した．

抗 MRSA 活性および抗Candida活性の安定性では，24 時間判定で色素産生の有無にかかわらず抑制 作用を示す菌株が高率に認められた．しかし，48 時間後では抑制作用の減弱が認められ，とくに色素非 産生株での減弱が顕著であった．一方，血液の存在下では抗 MRSA 活性に対し有意な減弱が認められた

が，抗Candida活性に対しては，24 時間判定での有意な減弱は認められなかった．

〔感染症誌 76：231〜237，2002〕

要 旨

別刷請求先：（〒113―8421）東京都文京区本郷 2―1―1 順天堂大学医学部臨床病理学講座

近藤 成美

Key words： Pseudomonas aeruginosa, MRSA,Candida albicans,bacterial interference

Table  1 Dye production of P. aeruginosa and their anti MRSA or anti C. albicans activity（Mueller- Hinton agar）

anti C. albicans^3） activity anti MRSA^2） activity

No. of strain  tested Dye^1）

48 h 24 h

48 h 24 h

  3（100%）

  3（100%）

  3（100%）

  3（100%）

  3 GG

  9（100%）

  9（100%）

  4（  44%）

  8（  89%）

  9 YG

13（100%）

13（100%）

  6（  46%）

12（  92%）

13 YY

25（100%）

25（100%）

13（  52%）

23（  92%）

Subtotal 25

（GG/YG/YY）

  1（  50%）

  2（100%）

0   1（  50%）

  2 NY

  1（  14%）

  6（  86%）

0   3（  43%）

  7 NN

  2（  22%）

  8（  89%）

0   4（  44%）

Subtotal   9

（NY/NN）

27（  79%）

33（  97%）

13（  38%）

27（  79%）

34 Total

1）：GG : green YG : yellowish green YY : yellow NY : very slight yellow NN : no color 2）：MRSA : clinical isolate

3）：C. albicans : serotype A 1,012

＊ p＜ .01

＊ ＊p  ＜ .0001

N.S.

＊ ＊ N.S. ＊ ＊

＊

方 法

緑膿菌は臨床材料より分離した 34 株および標 準株（ATCC27853），指示菌には MRSA（臨床分 離株 ），

（

serotype A 1012）を用いた．

緑膿菌の遊走能抑制のため 2％ 寒天に調整した Mueller-Hinton 寒天平板および 5％ 脱線維素ヒツ ジ血液加 Mueller-Hinton 寒天平板に緑膿菌を画 線後，好気的に 35℃ で 24 時間培養した．

無菌的に寒天平板を蓋に反転し，反転した培地 表面に緑膿菌に直交するように指示菌菌液（10

CFU

ml） を滅菌濾紙を用いて表面塗沫し，さらに 24〜48 時間培養し，指示菌の発育を観察した （Fig.

1） ．

緑膿菌との交点付近において指示菌が寸断なく 発育したものを発育抑制作用（−）とし，発育抑 制は認められるものの指示菌の発育が一部に残る ものを （±） ，指示菌の発育が一集落も認められな い部分が 5mm 未満のものを （＋） ，5mm 以上存在 するものを （＋＋） ，指示菌の発育が全く認められ ないものを（＋＋＋）とし，本稿では＋＋以上を 明らかな抗菌物質産生菌株とした．

緑膿菌の色素判定は，24 時間後 48 時間後の二 度行い，いずれにも色素産生の認められたものを 色素産生株とした．

緑膿菌の溶血態度は，血液寒天平板での

また は

溶血を 24 時間，48 時間で判定した．さらに，

血液存在下における発育抑制作用への影響を血液 非存在下での結果と比較した． 統計学的有意差は，

Fig. 1 Antibiotic activity ofP. aeruginosa by cross streak on reversed agar plate method.

Table  2 P. aeruginosa and their anti MRSA or anti C. albicans activity（Mueller-Hinton  agar with & without 5% sheep blood）

anti C. albicans activity anti MRSA activity

No. of strain  tested Sheep 

Blood

48 h 24 h

48 h 24 h

27（79.4%）

33（97.1%）

13（38.2%）

27（79.4%）

34

−

  7（20.6%）

29（85.3%）

  5（14.7%）

  7（20.6%）

34

＋

＊ p＜ .05 ^＊ ＊ p ＜ .0001

＊ N.S.

＊ ＊ ＊ ＊

カイ二乗検定および Fisher の直接確率計算法に よった．

結 果

1）緑膿菌の色素産生性と抗 MRSA，抗

活性（Table 1）

MRSA 発育抑制作用は，緑膿菌 34 株のうち 27 株（79.4％）に，24 時間後での発育抑制作用がみら れた．これは，色素産生株（GG

YG

YY）で 92

％（23

25）色素非産生株（NY

NN）で 44.4％（4

9）であった．しかし 48 時間後では，発育抑制作 用の見られた株は，38.2％（13

34）に低下した．

色素非産生株では 48 時間後の発育抑制は認めら れなかった．産生色素の色調別に見ると，緑色

（GG）がもっとも発育抑制作用が強くみられた

（100％）が，黄色（YY）では 48 時間後には 46.2

％に低下していた．

Candida

発育抑制作用は，緑膿菌 34 株のうち 33 株（97.1％）に，24 時間後での発育抑制作用がみら れた．これは，色素産生株で 100％ （25

25） ，色素 非産生株で 88.9％（8

9）であった．色素産生株で は，48 時間後もそのまま発育抑制作用が続いたの に対し，色素非産生株では 22.2％（2

9）に低下し ていた．

2）緑膿菌の溶血態度と抗 MRSA，抗

活性（Table 2） （Fig. 2）

MRSA 発育抑制作用は，24 時間後では 20.6％

Fig. 2 Dye production ofP. aeruginosaand their anti MRSA or antiC. albicansactiv- ity（Mueller-Hinton agar with & without 5％ sheep blood）.

（7

34） にみられ，血液非存在下に比べ血液寒天培 地での発育抑制作用の減弱が認められた．溶血態 度別では，

溶血株では 24％（6

25）

溶血株では 11.1％（1

9） と，

溶血株の方がやや優位の抑制傾 向がみられたが，統計学的な有意差はなかった．

Candida

発育抑制作用は，24 時間後では 85.3％

（29

34）にみられ，血液非存在下に比べ血液寒天 培地での発育抑制作用の減弱は認められなかっ た．48 時間後での

発育抑制作用は，20.6

％（7

34）と有意に低下していた．また，

溶血，

α

溶血による緑膿菌々株間での抑制作用に統計学 的な有意差は認められなかった．

考 察

緑膿菌は，栄養要求性が低く土壌や水などの自 然環境中の至る所に存在している環境細菌であ る．そのため，緑膿菌は病院内でも非常に多くの 場所に生息し，野菜や花はもちろん消毒薬の入っ た溶液やネブライザーからも分離されることがあ り， 緑膿菌のコンタミネーションを避けることは，

実際上は非常に困難とされている．

通常，食べ物や水とともに本菌を摂取しても，

健康人の細菌叢として存在することは稀である．

一般的に緑膿菌の毒力は弱く，健康人では緑膿菌 感染症は起こりにくい．しかし，入院患者では抗 菌剤が多用されることもあって，患者の腸管への 定着率は 60％ にも上るという報告もある．また，

慢性の呼吸器疾患や泌尿器疾患を持つ入院患者に おける気道や尿路への定着率は 50％ 以上に達す るともいわれ，持続感染を起こしやすい．

緑膿菌は， 免疫機能の低下した宿主においては，

肺炎や敗血症などの急性感染症を起こしやすく，

いったん発症すると予後も悪い．しかし，最近で は抗緑膿菌作用を有する抗菌剤の開発はめざまし いものがあり，治療効果も高まってきている．そ の結果，緑膿菌感染症は減少し，一方で MRSA

や

の保菌状態，あるいはこれらによる菌

交代症が増加し，社会問題にもなっている．

緑膿菌が，他の細菌に対して発育抑制作用を持 つ物質を産生することは，1899 年に Emmerich

らによって初めて報告された．彼らは，抗菌作用 を酵素によるものと考え pyocyanase と命名し

市販した．これに対してはその後，様々な反論

が出され Emmerich の酵素説は否定されていっ た．我が国でも Fukuhara

（1909）などが抗菌物 質の抽出を報告しているが，なかなか抗菌物質そ のものの特定には至らなかった．

一方，緑膿菌の感染巣に生ずる緑色の物質が抗 菌作用を持っていることは経験的には知られてお り，実際に抗菌物質としてジフテリア患者などの 治療に用いられたり，第一次世界大戦中までは，

緑膿菌の感染が合併すると丹毒が改善することが 着目され局所投与による治療が行われていた

．

緑 膿 菌 の 産 生 す る 色 素 で あ る ピ オ シ ア ニ ン

（pyocyanin）は Werde

（1924）らによってに分 離精製され， ピオシアニンの抗菌作用については，

Hettche

（1932）によって報告された．Schoen- tal

（1941）は緑膿菌の産生する三つの抗菌物質 を分画抽出し，これらが酵素ではなく色素系の物 質であることを示した．すなわち，フェナジン色 素 で あ る ピ オ シ ア ニ ン お よ び 1-hydroxyphena- zine，そして古い培地から得られる無色の未知の 物質，の三種類である．Young

（1947） はこれら 緑膿菌の産生物質の抗菌活性を調べ，無色の培地 から得られる物質には抗菌作用がないとした．そ のため，緑膿菌の産生する抗菌物質についての研 究はおもにピオシアニンを中心として進められて いった．緑膿菌による院内感染が問題になりはじ めた 1950 年代以降は， 緑膿菌のもつ病原因子とし ての，菌体外毒素・菌体内毒素の研究が中心とな り，ピオシアニンについても，リンパ球の活性抑 制や気道粘膜の絨毛運動の抑制といった毒性の研 究が中心になっていった．

緑膿菌の産生する，ピオシアニン以外の抗菌物 質としては，Zyskind

（1965） が，Pseudomonas 属の産生する抗微生物活性物 質 と し て Staphy- lolytic enzyme をあらたに報告している．

その後，緑膿菌の抗菌作用という観点からの研

究が再開されたのは 1990 年代に入ってからであ

る．Machan

（1992）らが，ピオシアニンやその

他のフェナジン色素とは区別される，低分子の親

水性の物質を 抽 出 し（2-Heptyl-4-hydroxyquino-

line N-oxide） ，その抗ブドウ球菌活性を報告した．

一方，臨床材料から得られた緑膿菌が，

をはじめとする各種真菌の発育を in vitro で抑制 することは，Klite

（1961）によって初めて報告 された．ついで Hughes

（1973）らは，cystic fi- brosis の患者の喀痰において，緑膿菌と

を検出することが多いにもかかわらず，両者の菌 を同時に検出することが非常に少ないという臨床 的事実を明らかにした．そして，緑膿菌の

発育抑制作用について検討し，混合培養で緑膿菌

が

の発育を抑制することを報告した．

1990 年代にはいり，Kerr

（1994）らは臨床材 料から得られた 10 株の緑膿菌の抗真菌活性（Can-

属 8 種 と，T. glabrata ，S. cerevisiae ，A. fumi-

してピオシアニンと 1-hydroxyphenazine による ものであると報告した

（1999） ．さらに Mach- an

や Kerr

らのグループは，cystic fibrosis の患 者において，緑膿菌の colonization と黄色ブドウ

球菌や

などの感染症の発生率とが，負の

相関を持っていることを明らかにした．そして，

緑膿菌のもつ黄色ブドウ球菌や

への in vitro での抗菌作用が，in vivo でも働いているの ではないか，という仮説のもとに一連の研究をお こなっている．

今回我々は，臨床材料より分離した緑膿菌の抗 MRSA 作用および抗

作用を in vitro で検 討した．その結果，MRSA に対しては，24 時間判 定では色素産生の有無にかかわらず発育抑制をも つ株が認められたが，その中でも緑色，黄色の株 により強い傾向が認められた．また，多くの文献 では 24 時間を発育抑制判定の end point として いるが，48 時間判定の結果，抑制作用が減弱して いることが明らかとなった．これは，とくに NY，

NN で顕著であった．

に対しては，48 時間 後の判定で GG，YG，YY いずれも抑制作用の減弱 は見られなかったが，NY，NN では，抑制作用に 減弱が見られた．

これらの結果は，緑膿菌の抗微生物活性がピオ シアニンなどのフェナジン色素によるもの以外 に，Machan

らが報告している 2-Heptyl-4-hydro- xyquinoline N-oxide などの非色素性物質の 関 与

を示唆している．さらに，今回みとめられた抑制 作用の持続性の違いから，抑制物質の安定性に差 異のあることが示唆された．

また血液存在下においては， 抗 MRSA 作用は血 液非存在下に較べ大きく減弱しており，Kerr

ら も指摘しているように，血液の存在が抗微生物活 性（とくにピオシアニン産生）を抑制している可 能性が示唆された．

しかし今回の研究結果より抗

作用につ いては， 抗 MRSA 作用と異なってわずかな減弱に とどまっており，血液存在下でも産生が抑制され な い 非 色 素 性 抗 菌 物 質 の 関 与 が 示 唆 さ れ る．

Kerr

（1999） らの報告では，緑膿菌の抗

作用は主としてフェナジン色素によるものとさ れ，非色素である 2-Heptyl-4-hydroxyquinoline N- oxide には認められて い な い．今 回 の 我 々 の 抗

Candida

作用に関する知見は，あらたな非色素性

物質の存在を示唆するものである．

緑膿菌の溶血態度と抗微生物活性（抗 MRSA，

抗

では，統計学的な有意差は認められな

いが，

溶血を示すものの方が，抗微生物活性を示 す割合がやや高かった．これは，

溶血を示す緑膿 菌では色素産生株の割合が低く，このことを反映 しているのかもしれない．

緑膿菌の抗微生物活性は，栄養状態の悪い環境 で産生能が高まり，また，各種栄養成分の補給で 抑制されるとの報告もある．このことは，緑膿菌 が活発に増殖できる環境では抗微生物活性の発現 が減弱していると考えられる．このため，緑膿菌 の保菌状態あるいはバイオフィルム形成状態で抗 微生物活性物質は活発に産生され，他の微生物の 侵入を阻止している可能性がある

．実際，Wil- son

（1988）らが報告しているように，喀痰中の ピオシアニンおよび 1-hydroxyphenazine の濃度 は有効濃度の 1

4 程度あるが，気道局所での濃度 はもっと高いものと思われる．

こ れ ら の 結 果 よ り，MRSA あ る い は

が緑膿菌と同時に検出された場合，感染所見の見

られない症例においては， colonization している緑

膿菌の除菌のみを目的とするような治療は控える

べきであろう．この場合，マクロライド剤投与に

より，緑膿菌のピオシアニンやその他の菌体外毒 素の産生は抑制される一方で，抗微生物活性は保 たれることも指摘されており

，マクロライド剤 を用いた緑膿菌の温存も考慮される治療法のひと つであろう．

現在，緑膿菌の同定および感受性試験の過程の 中で，分離された緑膿菌の抗微生物活性を調べる 直接的・間接的方法は開発されていないが，簡便 検査の開発が今後のぞまれる．

簡易法による緑膿菌の抗微生物活性の有無の サーベイランスは，院内感染対策の一環として，

また抗菌剤の選択基準の一つとして啓蒙されるべ きであろう．

緑膿菌のグラム陽性球菌発育抑制作用の抗菌域 を調査することは，VRE（バンコマイシン耐性腸 球菌）など多剤耐性菌の出現の制御に貢献するか もしれない．今後は，さらに非色素性抗

活性物質についても研究を深め，緑膿菌の抗微生 物活性作用の臨床応用への貢献がなされるべきで あろう．

文 献

1）荻野 純，山田俊彦，後藤 領，菊島一仁，藤森

功：臨床材料より分離される緑膿菌の黄色ブド

ウ球菌に対する発育抑制作用．感染症誌 1992；

66：909―13.

2）荻野 純，山田俊彦，小銭太朗，伊藤正彦，菊島

一仁，後藤 領，他：由来別緑膿菌のメチシリン

耐性黄色ブドウ球菌発育抑制作用と色素産生に およぼすエリスロマイシンの影響．感染症誌 1993；67：918―23.

3）荻野 純，山田俊彦，菊島一仁，藤森 功，後藤

領，小銭太朗，他：14 員環マクロライド剤が緑膿 菌の走化性および黄色ブドウ球菌発育抑制作用 におよぼす影響．感染症誌 1994；68：191―5.

4）福村由紀，小栗豊子，山田俊彦，猪狩 淳：緑膿

菌の MRSA 発育抑制作用の現状．第 35 回緑膿菌 感染症研究会講演記録，2001；p. 98―101.

5）Emmerich R, Lo"w O：Bakteriologische Enzyme als Ursache der erworbenen Immunita"t und die Heilung von Infectionskrankheiten durch diesel- ben. Z Hyg Infectkr 1899；31：1―65.

6） Schoental R ： The nature of the antibacterial agents present inPseudomonas pyocyaneacultures.

Br J Exp Pathol 1941；22：137―47.

7）Young G：Pigment production and antibiotic ac- tivity in cultures ofPseudomonas aeruginosa. J Bac-

teriol 1947；54：109―17.

8）Fukuhara Y：U!ber die bakteriziden und ha"moly- tiscen Eigenschaften der alkoholiscen Bakterien- extrakte. Jap Arch f Hyg 1909；71：387―414.

9）Florey HW, Chain E, Heatley WG, Jennings MA, Sanders AG, Abrham EP,et al.：Antibiotics, Vol.

1. Oxford University Press, Oxford, 1949；p. 20―

26.

10）Wrede F, Strack E：U!ber das Pyocyanin , den blauen Farbstoff des Bacillus pyocyaneus . Z physiol Chem 1924；140：1―15.

11）Hettche HO：Untersuchungen u"ber die bakteriz- iden und anthrakoziden Bestandteile vonBacillus pyocyaneus und Bacillus prodigiosus . Arch Hyg 1932；107：337―53.

12）Zyskind JW, Pattee PA, Lache M：Staphylolytic substance from a species ofPseudomonas.Science 1965；147：1458―9.

13）Machan ZA, Pitt TL, White W, Watson D, Taylor GW, Cole PJ,et al.：Interaction betweenPseudo- monas aeruginosa and Staphylococcus aureus： de- scription of an anti-stphylococcal substance . J Med Microbiol 1991；34：213―7.

14）Machan ZA, Taylor GW, Pitt TL, Cole PJ, Wilson R：2-Heptyl-4-hydroxyquinoline N-oxide , an an- tistaphylococcal agent produced byPseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother 1992；30：

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15） Klite PD , Gale GR ： An Antifungal substance fromPseudomonas aeruginosa. Antibiot Chemother 1961；11：256―60.

16）Hughes WT, Kim HK：Mycoflora in cyctic fibro- sis：some ecologic aspects ofPseudomonas aerugi- nosa and Candida albicans . Mycopathol Mycol Appl 1973；50：261―9.

17）Kerr JR：Suppression of fungal growth exhibited by Pseudomonas aeruginosa. J Clin Microbiol 1994；32：525―7.

18）Kerr JR, Taylor GW, Rutman A, Hoiby N, Cole PJ, Wilson R：Pseudomonas aeruginosapyocyanin and 1-hydroxyphenazine inhibit fungal growth. J Clin Pathol 1999；52：385―7.

19）一宮朋来，中野哲治，平田範夫，村上純子，平松 和史，山崎 透，他：緑膿菌と MRSA の付着性に 関与するバイオフィルムの影響，第 34 回緑膿菌 感染症研究会講演記録，2000；p. 94―7.

20）Wilson R, Skyes DA, Watson D, Rutman A, Tay- lor GW, Cole PJ：Measurement ofPseudomonas aeruginosaphenazine pigments in sputum and as- sessment of their contribution to sputum sol tox- icity for respiratory epithelium . Infect Immun 1988；56：2515―7.

Antibiotic Activity of

Against MRSA and

Shigemi KONDO, Naotake SATO, Toshihiko YAMADA, Sakiko MIYAZAKI, Toyoko OGURI & Jun IGARI

Department of Clinical Pathology, Juntendo University School of Medicine

The antibiotic activity demonstrated by

more than one hundred years ago by Emmerich et al（1899） . Studies on such bacterial interference between

and other pathogenic bacteria or fungi have not been extensively reported in recent years. In this paper, we report on the anti MRSA activity and anti

activity demon- strated by clinical isolates of

.

The antibiotic activity was tested by reversed agar plate method, as previously reported, and the degree of the activity was expressed as the diameter of the zone of growth inhibition. The stabil- ity of both anti MRSA activity and anti

activity was evaluated at the time after 24 and 48-hr incubation. Also the effect of agar plate with or without 5％ sheep blood on antibiotic activity was evaluated. Strong anti MRSA activity and anti

activity was shown at the time after 24-hr in- cubation. At the time after 48-hr incubation, anti MRSA activities were significantly suppressed but anti

activities were persisted. The inhibitory activity was correlated with dye production of

hr incubation. Result from these strains without suppression of anti

activity by additional blood may suggest that the existence of a new factor produced by

Because of frequent isolation of MRSA or

from clinical materials, we must consider bac-

terial flora and bacterial interference against pathogenic bacteria at the time of the antibiotic choice

for the patients infected or colonized with