序 文
Cyclospora cayetanensis（サイクロスポーラ・カ エタネンシス）は，胞子虫綱のコクシジウム類に 属する腸管寄生原虫で，ヒトに水様性の下痢をも たらす病原体として知られている．本原虫は 1985 年頃より下痢症患者の糞便から検出されていた が，形態的に藍藻類（Cyanobacterium）に類似する ことから，Cyanobacterium-like body と呼ばれ，
CLB と略称されていた
1）．1993 年になってコクシ
ジウム類に属する原虫であることが確認され，さ らに，成熟オーシストの形態的特徴などから， Cy-
clospora 属に最も類似していることが判明し
2），
翌 年 に 新 種 と し て C. cayetanensis と 命 名 さ れ た
3）．
本症は食品媒介性の感染症としても知られてお り，北米では輸入キイチゴによる大規模な集団感 染 事 例 が 1996 年〜1997 年 に か け て 発 生 し て い る
4）5）．日本では，途上国への旅行から帰国した下 痢症患者に見出され
6）〜8），輸入感染症として認識 されている．
C. cayetanensis の保虫宿主は，これまで調査が
分子生物学的手法による患者由来 Cyclospora
（サイクロスポーラ）株の種の同定
1）大阪市立環境科学研究所微生物保健課，2）金沢大学大学院医学研究科寄生虫症制御学，
3）独協医科大学熱帯病寄生虫学教室，4）東京都立墨東病院感染症科
阿部仁一郎
1）井関 基弘
2）松田 肇
3）大西 健児
4）（平成 14 年 9 月 9 日受付）
（平成 14 年 10 月 2 日受理）
原 著
Cyclospora cayetanensisは，胞子虫綱のコクシジウム類に属する原虫で，ヒトの下痢起因病原体として
知られている．近年，霊長類からC. cayetanensisと形態的に区別できない 3 種のCyclosporaが報告され た．霊長類由来種のヒトへの感染性は不明であることから，患者の中には霊長類由来種に感染している 例があることも予想され，今後はCyclosporaの種を鑑別できる検査法が必要となる．このため本研究で は，分子生物学的手法を用いて患者由来株の種の同定を試みた．
CYC1FE と CYC4RB のプライマーペアで増幅される，Cyclosporaの 18S リボソーム RNA 遺伝子の シーケンスは，種間で異なることから，両プライマーを用いた PCR‐ダイレクトシーケンス法により分 離株の同定を行った．その結果，期待されるサイズの産物が全株で増幅され，それらのシーケンスはC.
cayetanensisの当該領域のシーケンスに一致したことから，患者由来株は全てC. cayetanensisと同定され
た．
〔感染症誌 77：47〜52，2003〕
要 旨
別刷請求先：（〒543―0026）大阪市天王寺区東上町 8―34 大阪市立環境科学研究所微生物保健課
阿部仁一郎
Key words： Cyclospora, diagnosis, PCR, 18SrRNA
ほとんど行われず不明であったが，1995 年にタン ザニアの霊長類から，C. cayetanensis と形態的に 区別できない Cyclospora が見出された
9）．その後，
ペルー
10）とハイチ
11）において様々な動物 （霊長類は 含まれていない）を対象に調査がなされたが，保 虫宿主は発見されなかった．しかしながら，近年，
エチオピア
12），ケニア
13）において， 複数の霊長類か ら， C. cayetanensis と形態的に極めて類似した Cy- clospora が高率に検出され， Cyclospora は霊長類に も広く分布していることが明らかとなった． また，
3 種類の霊長類から検出された株は，遺伝的に C.
cayetanensis とは異なり，また，各株間でも異なる
ことから，これら霊長類由来株に対して，C. cer- copitheci （サバンナモンキー由来），C. colobi （コロ ブスモンキー由来）および C. papionis （アヌビスヒ ヒ由来）という独立種名が提唱されている
12）．霊 長類由来種のヒトへの感染性は未だ明らかではな く，また， C. cayetanensis とは形態的に区別できな いことから
12），サイクロスポーラ症の患者の中に は霊長類由来種に感染している例が存在すること も考えられる．このため，本症の感染源として保 虫宿主の有無などをさらに解明し，霊長類由来種 のヒトへの感染性を確認する上でも， C. cayetanen- sis と霊長類由来種とを鑑別することは有意義な ことと考えられる．
これまでサイクロスポーラ症の診断は，オーシ ストの形態学的観察に基づいてなされてきた．し かしながら，C. cayetanensis と形態学的に区別で きない新種の存在が明らかになったことで，今後 は遺伝子診断により分離株を鑑別する必要があ る．このような観点から，本研究では，分子生物 学的手法による患者由来株の種の同定を試みた．
材料と方法
1．臨床材料
Cyclospora のオーシストが見出された下痢症患
者 4 名（A-D）の 糞 便 を 材 料 と し た．患 者 A-C は日本人成人であり，患者 A はベトナム旅行から 帰国後に発症した輸入症例である．患者 B と C は，フィリピン滞在中に感染したと考えられる症 例であり，このうち患者 B の症例は既に報告され ている
7）．患者 D は，ネパールに在住するネパー
ル人子供の症例である．糞便は 2.5％ 重クロム酸 カリウム溶液に懸濁させ，検査まで 4℃ で保存し た．
2．オーシストの回収と DNA 抽出
（1）糞便の前処理
保存中の糞便懸濁液をメッシュで 15ml 容の目 盛付き遠沈管（内径 15mm）に濾過した．保存液 を除去するために，PBS を用いて遠心洗浄を数回 繰返し，得られた沈殿物をショ糖遠心浮遊法によ るオーシストの回収に供した．
（2）ショ糖遠心浮遊法と DNA 抽出
前処理で得られた沈殿物に比重 1.2 のショ糖溶 液を 3ml 加えてピペットでよく撹拌し，さらに 10 ml のショ糖溶液を加えて 10 回転倒撹拌した．
2,000 回転（900g）で 5 分間遠心後，白金耳（先端 を径 7mm のループ状にし，ループを軸に対して 直角にしたもの）を用いて液表層部を PBS の入っ た エ ッ ペ ン チ ュ ー ブ に 採 取 し た．15,000 回 転
（14,000g）で 5 分間遠心した後に上清を除去し，
PBS 200
µl 加えて凍結融解を 5 回繰り返した．融 解後に沸騰浴中で 10 分間加熱し，QIAamp DNA Stool Mini Kit （Qiagen GmbH，Hilden，Germany）
を用いて DNA の抽出と精製を行った．PCR 反応 には精製された 200
µl の DNA 溶液のうち 5
µl を 用いた．
3．Nested-PCR 法 に よ る Cyclospora 特 異 遺 伝 子の検出
4 種類のプライマー（CYC1FE,CYC2RB,CYC3 FE,CYC4RB） を用いた Nested-PCR 法
14）15）により，
Cyclospora の 18S リボソーム RNA（18SrRNA）遺 伝子を検出した．すなわち，CYC1FE と CYC2RB のプライマーペアを用いて First-PCR を行い，増 幅産物の一部（5
µl）をテンプレートとして，CYC 3FE と CYC4RB の プ ラ イ マ ー ペ ア で Second- PCR を行った．
反 応 液 の 総 量 は 50
µl と し，DNA polymerase
には TaKaRa Taq （ TAKARA Shuzo ， Otsu ，
Japan） を 使 用 し た．ま た，PCR Buffer と dNTP
は Taq に 添 付 さ れ て い る 10×PCR Buffer と
dNTP Mixture（2.5mM each）を使用した．各プラ
イマー溶液は，最終濃度が 0.5µM となるように反
M 1 2 3 4
M 1 2 3 4
応液に加えた．反応条件は，熱変性 94℃30 秒（1 回 目 は 3 分） ，ア ニ ー リ ン グ 53℃（Second-PCR では 60℃）30 秒，伸長反応 72℃1 分（最終回は 7 分） ，反応サイクルは 40 回である．サーマルサイ クラーは GeneAmp PCR System Model 9700
（Perkin-Elmer Corp.，U.S.A.） を用いた．当該産物 の 増 幅 は PCR 終 了 後 の 反 応 液 10
µl を 3％ ア ガ ロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイド 溶液で染色した後にトランスイルミネーターで確 認した．
4．PCR−ダイレクトシーケンス法による Cy- clospora の種の同定
CYC1FE と CYC4RB のプライマーペアを用い て PCR を行い，得られた増幅産物のダイレクト シーケンスにより Cyclospora の種を同定した．
アニーリング温度は 55℃ に設定し， その他の反 応条件は前述の条件にしたがった．次に，増幅産 物を QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen Gm- bH，Hilden，Germany）で 精 製 し た 後 に，ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer Corp.，U.S.A.）
を用いて Cycle Sequencing を行った．反応産物は
Centri-Sep Columns （Perkin-Elmer Corp.，U.S.A.）
を用いて未反応のプライマーと蛍光 Terminators を 除 去 し た 後 に，ABI PRISM 310 Genetic Ana- lyzer（Perkin-Elmer Corp.，U.S.A.）で両方向の塩 基配列を解読し， 当該領域の塩基配列を決定した．
また，Sequencher version 4.1. 2（Gene Code Co- rp.，U.S.A）を 用 い て，患 者 由 来 株 と GenBank に登録されている各種 Cyclospora の 18SrRNA 遺 伝子のシーケンスを比較した．
成 績
1．Nested-PCR 法 に よ る Cyclospora 特 異 遺 伝 子の検出
Nested-PCR 法により増幅される約 290bp の産 物は，全株で明瞭に認められた（Fig. 1， 矢頭） ．
2．PCR−ダイレクトシーケンス法による分離 株の種の同定
CYC1FE と CYC4RB のプライマーペアを用い た PCR 法により，増幅が期待される約 560bp の 産物は全株で認められた（Fig. 2， 矢頭）．また，ダ イレクトシーケンスにより，増幅産物のサイズは 4 株とも 561bp であり，そのシーケンスも株間で 一致した （Fig. 3） ．さらに，分離株のシーケンスは
Fig . 1 Detection of Cyclospora-diagnostic fragmentby nested-PCR. Ethidium bromide-stained gel show- ing the PCR products amplified with CYC3FE and CYC 4 RB （ Second-PCR ）. Lanes ： M , molecular marker（100bp ladder）；1, isolate A；2, isolate B；
3, isolate C；4, isolate D. Arrowhead shows the di- agnostic fragment amplified by Second-PCR （ ap- proximately 290bp）.
Fig . 2 Detection of Cyclospora 18 SrRNA gene by PCR with the primer pair CYC1FE and CYC4RB.
Lanes：M, molecular marker（100bp ladder）；1, isolate A；2, isolate B；3, isolate C；4, isolate D. Ar- rowhead shows the diagnostic fragment（approxi- mately 560bp）.
GenBank に 登 録 さ れ て い る C. cayetanensis の 当 該領域のシーケンス（accession no. AF111183）と 一致した（Fig. 3） ．
考 察
今回検査した患者由来株は，Cyclospora に特異 的なプライマーを用いた Nested-PCR 法により，
当該サイズの産物が増幅されたことから，遺伝子 レベルでも Cyclospora 属の原虫であることが確認 された．
今回用いた Nested-PCR 法
14）15）では，Fig. 3 に示 したように，CYC3FE と CYC4RB のプライマー ペアで挟まれた領域（294bp）が増幅される．この 領域のシーケンスは，Cyclospora の種間で数塩基 異なることから （Fig. 3） ，Nested-PCR 法による増 幅産物のダイレクトシーケンスでも，種の鑑別が 可能かと考えられた．しかしながら，この領域内 において，種間でのシーケンスの変異は CYC3FE のプライマー上，または，同プライマーの 3'末端付 近 に 多 く 認 め ら れ た（Fig. 3） ．一 方，CYC1FE と CYC4RB で挟まれた領域（561bp）は，Nested- PCR 法で増幅される領域を含んでいることから，
そのシーケンスには種間の変異箇所が多数認めら れた（Fig. 3） ．このため今回著者らは，CYC1FE と CYC4RB のプライマーペアで挟まれる領域を 種鑑別のターゲットとし，PCR−ダイレクトシー ケンス法により患者由来株の同定を試みた．その 結果，CYC1FE と CYC4RB を用いた PCR 法では 期待されるサイズの産物が全株で増幅され，それ ら の シ ー ケ ン ス は C. cayetanensis の 当 該 領 域 の シーケンスに一致したことから （Fig. 3） ，分離株は 全て C. cayetanensis と同定された．
今回検査した患者由来株は，ベトナム，フィリ ピン，ネパールで感染したと考えられる症例に由 来していることから，それぞれ地域の異なる株と 考えられた．しかしながら，CYC1FE と CYC4RB
のプライマーペアを用いた PCR 法により増幅さ れる 18SrRNA 遺伝子のシーケンスは，グアテマ ラで分離された C. cayetanensis 株
12）の当該領域の シーケンス（GenBank accession no. AF11183）に 一致したことから，この領域は地域を越えて C.
cayetanensis に保存された領域と考えられた．さら
に，異なる地域で分離された霊長類由来種の 18 SrRNA 遺伝子のシーケンスも， Cyclospora の種ご とに一致すると報告されており
13），CYC1FE と CYC4RB のプライマーペアを用いた PCR−ダイ レクトシーケンス法は，Cyclospora の種の鑑別に 有効な方法と考えられた．
謝辞：稿を終えるに当たり，本研究に御協力をいただき ました，獨協医科大学消化器内科，手塚勇人先生に深謝い たします．
文 献
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Fig. 3 Alignment of theCyclospora18SrRNA gene diagnostic fragments amplified with the primer pair CYC1FE and CYC4RB. Dots indicate bases that are identical toC. cayetanensis. The GenBank accession number for each species ofCyclosporais as follows：C. cayetanensis（AF111183）,C. cercopitheci（AF111185）,C. colobi（AF111186）, C. papionis（AF111187）. The sequence of the forward or reverse primer is underlined. Sequences of the isolates from patients（A-D）obtained with the same primer pair are identical to that ofC. cayetanensis.The region gen- erated with CYC3FE and CYC4RB is included in the region with CYC1FE and CYC4RB.
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Identification of Species of Cyclospora Isolates from Patients by the PCR-based Diagnostic Methods
Niichiro ABE
1）, Motohiro ISEKI
2）, Hajime MATSUDA
3）& Kenji OHNISHI
4）1）Department of Microbiology, Osaka City Institute of Public Health and Environmental Sciences
2）Department of Parasitology, Graduate School of Medical Science, Kanazawa University
3）Department of Tropical Medicine and Parasitology, Dokkyo University School of Medicine
4）Department of Infectious Diseases, Tokyo Metropolitan Bokutoh General Hospital
