胆 汁 成 分 が ウ ェル シ ュ菌 の胞 子 形成 能 力 お よ び エ ンテ ロ トキ シ ン産 生 能 力 に及 ぼす影 響
谷 口 忠 敬 ・片 山 進 ・ 西 本 明 子 ・山 口 幸 弘
Effects of Bile Components on Spore-forming and Enterotoxin-producing Abilities of Clostridium perfringens
Tadataka TANIGUTI, SUSUMU KATAYAMA, Akiko NISHIMOTO, and Yukihiro YAMAGUCHI
Effects of each bile component which was added into preculture medium on spore-forming (SP-F) and enterotoxin-producing (ET-P) abilities in sporulation medium of Clostridium pefringens, NCTC 8798, 8238, have been studied. Bile acids, mucin and lecithin enhanced the both abilities of the both strains, but cholesterol and bilirubin did not. That is, cholic, glycocholic and taurocholic acids in concentration from 0.5 or 1% to 5% enhanced the both abilities of the both strains. Deoxycholic acid in 0.5 or 1% enhanced the both abilities of the both strains, but it in 3 or 5% diminished those abilities. Glycodeoxycholic acid and taurodeoxycholic acid from 0.5 or 1% to 3 or 5% enhanced the SP-F ability of the both strains, and the latter in 3 and 5%
enhanced the ET-P ability of 8238. Chenodeoxycholic acid in 0.5 or 1% and over diminished the both abilities of the both strains, but glyco- and tauro-chenodeoxycholic acids in 0.5 or 1% and over enhanced those abilities. Lithocholic acid in 1 or 3% gave the maxima of the both abilities to the both strains. Mucin in 3 and 5% and lecithin in 0.5 or 1% enhanced the both abilities of the both strains. The SP-F and ET-P abilities are discussed in connection with the food poisoning.
Keywords:ウ ェ ル シ ュ 菌Clostridiumperfringens;胞 子(芽 胞)形 成sporulation;
エ ン テ ロ ト キ シ ン 産 生enterotoxinproduction;胆 汁 酸bileacids;
コ ー ル 酸cholicacid;ム チ ンmucin;レ シ チ ンlecithin
ウ ェ ル シ ュ 菌(ClostridiumPerfringens)は 胞 子 形 成 性 の グ ラ ム 陽 性 の 嫌 気 性 細 菌 で あ り,一 般 に は 胞 子 を 形 成 し難 く1)胞子 の 耐 熱 性 も低 い と さ れ て い る2)。本 菌 に よ る食 中 毒 は 一 般 にA型 に 属 し耐 熱 性 胞 子 を形 成 す る菌 株 に よ る場 合 が 多 く2β),原因 食 品 と して は 主 と し て獣 肉,鶏 肉,魚 介 類 な ど タ ンパ ク 質 性 の 加 熱 調 理 食 品 が 多 い 馬5)。本 菌 食 中毒 は エ ン テ ロ トキ シ ン(enterotoxin,ETと 略 記)産 生 性 の 本 菌 菌 株 が 消 化 管 内 で 増 殖 し,胞 子 を形 成 す る際 に胞 子 嚢 中 にETを 産 生 し,胞 子 嚢 中 か ら消 化 管 内 に ETが 溶 出 し て起 こ る と され て い る6,7,8一10)。
本 菌 食 中 毒 患 者 の 糞 便 か らは,耐 熱 性 胞 子 が 数 多
く検 出 され る場合 が 多 い3)。一方,一 般 に食 中毒 分離 株 は培 養保存 中 に耐 熱性 が減 少 す る といわ れ,特 に 胞子 形成 段 階 に達 し得 ない所 の短 時間継 代培 養 の繰 り返 しに よ り,本 菌ET産 生 菌株 の胞子 形成 能 力 ・ ET産 生 能 力 が急 速 に減 少 す る11}。これ らの事 柄 は 本菌 の胞 子 形成 能 力 ・ET産 生 能力 が 本菌 の生 態 系 にお ける環境 の相 違 に よって容 易 に変動 す る事 を示 唆 す る もの と思 われ る。
消 化管 内 で ウェル シ ュ菌 の動 態 に影響 す る1因 子 と して胆 汁 の分泌 が あ げ られ る。 胆 汁 は食 物 の摂 取 が刺 激 にな って胆 嚢 か ら十 二指腸 に分泌 され,そ の 分 泌 量 は タ ンパ ク質 性 食 品 が 摂 取 され た 時 に 多
く12・13），主たる胆汁成分である胆汁酸は回腸までに その大部分（95％以上）が再吸収される14）。従って，
消化管内の胆汁酸の濃度は消化管の部位・摂取食物 の種類によって相違すると考えられる。胆汁酸は本 派の胞子形成を抑制する15）が，抱合胆汁酸特にグリ
ココール酸とタウロコール酸は本菌の胞子形成を促 進する16）といわれる。
他方，著者らは，胞子形成能力の低い菌株或いは 低下した菌株を胆汁末添加クックドミート培地で前 培養すると本菌の胞子形成能力およびET産生能力 が増加する事を先に報告した17）。
今回は，この事実の機構を明らかにする為の基礎 資料として，先ず，胆汁酸あるいはその他の胆汁成 分を前培養培地にそれぞれ単独に添加して，各胆汁 成分が本島の胞子形成能力およびET産生能力に及 ぼす影響を比較・検討した。その結果，コール酸お よびその抱合型，ケノデオキシコール酸の抱合型，
およびレシチン等が胞子形成能力およびET産生能 力を増加させる等，若干の知見を得る事ができた。
材料と方法
1．供試菌株
ウェルシュ菌（Clostridium PeOfringens）NCTC 8798，8238を供試した。供試菌株はクックドミート 培地（Difco）で37℃，3日間培養後，一30。cに凍結 保存した。
2．被検印培養培地および前培養法
1）被面前培養培地：クックドミート培地（CM 培地と略記，固形物1．259に純水10m1を添加したも の），および，胆汁成分を添加水分量に対し0．5，1，
3，5％（w／w）になるように添加したCM培地を 120℃で20分間滅菌したものを，被検培地として検討 した。胆汁成分としてはコール酸，グリココール酸，
タウロコール酸，デオキシコール酸，グリコデオキ シコール酸，タウロデオキシコール酸，ケノデオキ シコール酸，グリコケノデオキシコール酸，タウロ ケノデオキシコール酸，リトコール酸，コレステロー ル（Aldrich Chemical Company），ビリルビン
（Sigma Chemical Company）を供試し，ムチン（胃 粘膜製・半井化学）及びレシチン（絶品・半井化学）
も供試した。
2）被検培地による前培養法：凍結保存した供試 菌株培養液を解凍後，0．lmlをCM培地10mlに接種 し，75℃，20分間の加熱処理を加え，37℃で2日間
培養した。この培養菌液0．1m1をCM培地に接種 し，75℃，20分間の加熱処理を加え，37℃で24時間 培養した。この0．lml（4〜7×104個の胞子）を種々 の濃度に胆汁成分を添加した被検CM培地に接種 し，直ちに75℃，20分間の加熱処理を加え，37℃で 9〜12時間前培養した。なお，培養には15ml容量の スクリューキャップ付バイアルを用い，ガス置換を 行わず密栓して培養した。
3．胞子形成培養法および胞子形成率およびET 産生量の測定法
1）胞子形成培養法＝胞子形成培地としてはチオ グリコール酸ナトリウムのかわりにレアスコルビ ン酸ナトリウムを0．5％加えた18）DS培地19）を使用し た。胞子形成培地100mlに被面前培養液0．1ml（CM培 養液：10〜15×106個の細胞；胆汁成分含CM培養 液：5〜10×106個の細胞）を接種し，370Cで9時間 培養した。培養には120ml容量のスクリューキャップ 付培養びんを用い，ガス置換を行わず密栓して培養
した。
2）胞子形成率の測定法＝胞子形成培養液2mlを 等量の生理食塩水に懸濁し，遠心分離（3，000rpm，
10分間）後，菌体を10％中性ホルマリン4mlに懸濁 し固定した。このホルマリン固定液について，位相 差顕微鏡で観察しstage III〜V（fore−spore）20）以上 を胞子形成細胞とみなし，胞子形成率（sporulation rate， SRと略記）を算出した。
3）ET産生量の測定法：上記胞子形成培地での 培養液98mlを4℃で遠心分離（9，000rpm，30分間）
し，上清と沈殿に分けた。この沈殿菌体を生理食塩 水10m1に懸濁させ4℃で遠心洗浄（9，000rpm，30分 間）後，更に，これを生理食塩水2mlに懸濁させ一30℃
で1夜凍結し，次に流水中に浸漬して解凍した。こ の解凍した細胞懸濁液を氷冷しながら10秒間隔で10
〜15分間超音波処理し（TOMY製， UR200P型，20 KHz，200W，標準チップ使用），細胞を完全に破壊 した。この細胞破壊懸濁液を細胞抽出ET液とした。
また，上記培養液の遠心上清に，80％飽和硫酸アン モニウム溶液（4℃，pH7．0）を等量加え，これを4℃
で1夜塩析した。次に，塩析液を4℃で遠心分離
（9，000rpm，30分間）後，沈殿を生理食塩水2mlに 懸濁させ，これを培養上清ET液とした。
ETは，カウンターイムノ電気泳動法21）によって 測定し，培養液1ml当りET産生量（ET／mlと略記）
を算出した。本法における検出感度は精製ETとし て56．1ng／m1であった。
成
績
1．コール酸およびその抱合型がウェルシュ菌 NCTC 8798，8238の胞子形成能力およびエ ンテロトキシン産生能力に及ぼす影響 一次胆汁酸であるコール酸あるいはその抱合型の 前培養培地（CM培地）への添加が供試2菌株の胞子 形成培地における胞子形成能力およびエンテロトキ
シン（ET）産生能力に及ぼす影響を Fig．1−a，
bに示した。
コール酸の0．5或いは1％以上の添加は胞子形成 能力即ち胞子形成率を，NCTC 8798では無添加時 の22％から添加時の最高77％に増加させ，8238では 無添加時の22％から添加時の最高97％に増加させた。
また，同酸の同濃度の添加は，ET産生能力即ちET 産生量を，8798では無添加時の350ng／m1から添加時 の最高2，800ng／m1に，8238では無添加時の430ng／ml から添加時の最高2，400ng／mlにそれぞれ増加させ
た。
抱合型コール酸の場合には，グリココール酸は，
コール酸と同様に，両菌株の両能力を増加させ，ま た，タウロコール酸も両菌株の両能力を増加させた が，其の程度は前2者に比べて低かった。
2．デオキシコール酸およびその抱合型がウェル シュ菌NCTC 8798，8238の胞子形成能力お よびET産生能力に及ぼす影響
コール酸の2次胆汁酸であるデオキシコール酸お よびその抱合型が供試2菌株の胞子形成能力および ET産生能力に及ぼす影響をFig．2−a， bに示し
た。
デオキシコール酸の0．5および1％の添加は胞子 形成能力即ち胞子形成率を，無添加の時に22％で あったものを，8798では78および82％に，8238では 54および58％に増加させた。然し，3％および5％
添加では両菌株の胞子形成能力を逆に減少あるいは 消失させた。また，同酸の0．5％添加は，ET産生能 力即ちET産生量を，8798では無添加の時に350ng／
mlであったものを2，810ng／mlに増加させ，8238では 無添加の430ng／mlを1，720ng／mlに増加させた。然し，
1％添加では両菌株のET産生能力を逆に減少させ，
3および5％添加で消失させた。
抱合型であるグリコデオキシコール酸およびタウ ロデオキシコール酸の0。5〜5％の添加は胞子形成 能力即ち胞子形成率を，8798では無添加時の22％か ら添加時の最高値76および62％に，8238では添加時 の最高値41および54％にそれぞれ増加させた。即ち，
デオキシコール酸の様に，3或いは5％の添加に
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Conc． of GCA L n CM （Z） Conc． of TCA t n CM ［Z）
Fig． 1−a． Effect of concentration of CA， GCA and TCA in CM for preculture on sporulation rate of C Pe7 fringens， NCTC 8798 and 8238， in SPM．
CA： cholic acid， GCA ： glycocholic acid， TCA ： taurocholic acid， CM ： cooked meat medium，
SPM ： sporulation medium．
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Conc． of GCA t n CM （Z） Conc． of TCR t n CM ［Z）
Fig． 1−b． Effect of concentration of CA， GCA and TCA in CM for preculture on enterotoxin pro−
duction of C． Pe， f7ringens， NCTC 8798 and 8238，
in SPM．
CA， GCA， TCA， CM and SPM：see Fig． 1−a．
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Fig． 2−a． Effect of concentration of DC， GDC and TDC in CM for preculture on sporulation rate of C． Pe7fringens， N CTC 8798 and 8238， in SPM．
DC ： deoxycholic acid， GDC ： glycodeoxycholic acid， TDC：taurodeoxycholic acid， CM：
cooked meat medium， SPM ： sporulation medium．
⊂）一一→∈）NCTC 8フ98，
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Conc． of GDCR t n CM ［Z） Conc． of TDCA t n CM CZ］
Fig． 2−b． Effect of concentration of DCA， GDCA and TDCA in CM for preculture on enterotoxin production of C． Perfn ngens， N CTC 8798 and 8238 in SPM．
DCA， GDCA， TDCA， CM and SPM ： see Fig． 2−a．
よって両菌株の胞子形成能力を顕著に減少させる事 はなかった。
グリコーおよびタウローデオキシコール酸の0。5
〜5％の添加は8798のET産生能力に明確には影響 しなかったが，タウロデオキシコール酸の3および 5％添加は8238のET産生能力を顕著に，即ちET／
m1を無添加の時に430ng／mlであったものを6，894 ng／mlに増加させた。
3．ケノデオキシコール酸，その抱合型および リトコール酸がウェルシュ菌NCTC 8798，
8238の胞子形成能力およびET産生能力に 及ぼす影響
一次胆汁酸であるケノデオキシコール酸およびそ の抱合型が供試2菌株の胞子形成能力およびET産 生能力に及ぼす影響をFig．3−a， bに示した。
一次胆汁酸であるケノデオキシコール酸は0．5或 いは1％以上の添加で両菌株の両能力を減少・消失 させたが，抱合型であるグリコケノデオキシコール 酸およびタウロケノデオキシコール酸の0．5〜5％
添加は胞子形成能力即ち胞子形成率を，NCTC 8798では無添加時の22％から添加時の最高68および 75％に，8238では無添加時の22％から添加時の最高 73および59％にそれぞれ増加させた。また，同添加・
は，両菌株のET産生能力即ちET産生量を増加さ せ，その増加は8798よりも8238において大であった。
即ち，8798ではET産生量を無添加時の350ng／mlか ら添加時の最高1，050および700ng／mlに，8238では 無添加時の430ng／mlから添加時の最高3，000および 3，000ng／m1にそれぞれ増加させた。
ケノデオキシコール酸の二次胆汁酸であるリト コール酸が供試2菌株の胞子形成能力およびET産 生能力に及ぼす影響をFig．3−a， bに示した。
リトコール酸は0．5〜5％添加で両菌株の両能力 を増加させ，NCTC 8798は3％添加で最高の両能 力（胞子形成率53％，ET産生量2，800ng／ml）を示し，
8238は1および3％添加で最高の胞子形成能力（胞 子形成率80％）を，1％添加で最高のET産生能力
（ET産生量2，600ng／m1）を示した。
4．ムチン，レシチン，コレステロールおよび ビリルビンがウェルシュ菌NCTC 8798，
8238の胞子形成能力およびET産生能力に及 ぼす影響
胆汁酸以外の胆汁成分としてのムチン，レシチン，
コレステロールおよびビリルビンが供試2菌株の胞 子形成能力およびET産生能力に及ぼす影響を
Fig．4−a， bに示した。
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Conc． of TCDCR t n CM （Z） Conc． of LCR L n CM （Z｝
Fig．3−a． Effect of concentration of CDCA，
GCDCA， TCDCA and LCA in CM for preculture on sporulation rate of C． PeijTringens， NCTC 8798， 8238 in SPM．
CDCA ： chenodeoxycholic acid， GCDCA ： glycochenodeoxycholic acid， TCDCA ：
taurochenodeoxycholic acid， LCA ： lithocholic acid， CM ： cooked meat medium， SPM ： sporu−
lation medium．
Strains ： （！）一一E） NCTC 8798， e 一 NCTC 8238．
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Conc． of TCDCA t n CM （Z） Conc． of LCR t n CM （Z）
Fig．3−b． Effect of concentration of CDCA，
GCDCA， TCDCA and LCA in CM for preculture on enterotoxin production of C． Pe｝fringens，
NCTC 8798 and 8238， in SPM．
CDCA， GCDCA， TCDCA， LCA， CM， SPM and symbols：see Fig． 3−a．
ムチンは1或いは3％以上の添加によって両菌株 の両能力を増加させた。即ち，NCTC 8798はムチ ンの1〜5％添加で胞子形成率67〜88％を，3およ び5％添加でET産生量2，800および2，800ng／m1を 示した。8238は3および5％添加で胞子形成率88お よび93％を，ET産生量2，400および1，200ng／mlを示
した。
レシチンは8798では0．5および1％添加のみにお いて両能力を増加させ，同添加において胞子形成率 43および57％，ET産生量1，400および1，400ng／mlを 示した。8238では1％添加のみにおいて両能力を増 加させ，胞子形成率47％，ET産生量1，200ng／mlを示
した。
コレステロールの添加は両菌株の両能力に影響せ ず，ビリルビンは5％添加で両菌株の胞子形成能 力を低下させ，1％以上の添加でNCTC 8798の エンテロトキシン産生能力を，3％以上の添加で NCTC 8238のエンテロトキシン産生能力を低下
させた。
考 察
ヒト胆汁の胆汁酸には，肝細胞でコレステロール から生合成されるコール酸（cholic acid， CA）およ びケノデオキシコール酸（chenodeoxycholic acid，
CDCA）の一次胆汁酸と，腸内細菌の作用によりそれ ぞれの一次胆汁酸から生ずるデオキシコール酸
（deoxycholic acid， DCA）およびリトコール酸
（lithocholic acid， L，CA）等の二次胆汁酸がある21）。
これらの胆汁酸は，いずれも側鎖のカルボキシル基 がグリシンまたはタウリンとペプチド結合した抱合 型であるが，この他に極少量の遊離型，硫酸抱合型 やグルクロン酸抱合型も存在する21＞といわれる。
胆汁中の胆汁酸構i成比から見るとCAが36％或い は41〜46．8％を，CDCAが36％或いは33．4〜37％を，
DCAが19％或いは16．7〜22％を占め，この3者で総 胆汁酸の91％或いは97．8〜100％（w／w）を占め，
LCAは5％或いは0〜2．2％を占めるに過ぎな
い21，22）。
本研究では，胆汁成分がウェルシュ菌NCTC8798，
8238の胞子形成能力およびエンテロトキシン
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Conc． of CST tn CM 〔％） Conc， of BIし しn CM 〔％工
Fig． 4−a． Effect of concentration of MUC， LEC，
CST and BIL in CM for preculture on sporu−
lation rate of C． Pei fringens， N CTC 8798 and 8238， in SPM．
MUC ： mucin， LEC ： lecithin， CST ： cholesterol，
BIL ： bilirubin， CM ： cooked meat medium，
SPM ： sporulation medium．
Strains ： H NCTC 8798， Er 一 NCTC
8238．
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Fig． 4−b． Effect of concentration of MUC， LEC，
CST and BIL in CM for preculture on entero−
toxin production of C． Perfringens， NCTC 8798 and 8238， in SPM．
MUC， LEC， CST， BIL， CM， SPM and symbols：
see Fig． 4−a．
（enterotoxin， ET）産生能力に及ぼす影響を比較・
検討した。
一次胆汁酸の場合，CAは抱合型・遊離型に関係な く両菌株の胞子形成能力およびET産生能力を増加 させ，CDCAは抱合型に限って両菌株の両能力を増 加させたのが特徴的であった。
二次胆汁酸の場合，CAの二次胆汁酸であるDCA は両菌株の両能力を低濃度で増加，高濃度で減少さ せ，一方，CDCAの二次胆汁酸であるLCAは高濃度 でも両菌株の両能力を増加させたのが特徴的であっ
た。
肝より胆汁中に分泌された胆汁酸は胆嚢内にL時 貯蔵され，食餌摂取と共に胆嚢は収縮し大量の胆汁 酸が腸管内に流入する。その結果，胆汁酸の腸肝循 環の流れは食餌時に増加し，空腹時に減少する変動 を繰り返している14）。腸管内に流入した胆汁酸の 95％以上は再吸収されるが，其の殆どは回腸での能 動輸送によるとされている14）。ヒトの胆汁酸プール は2〜49であり，これが食餌毎に2回回転すると，
最高約249の胆汁酸が，即ち247m1或いは338〜150m1 の胆汁が，毎日腸管内を灌流している事になる14・23＞。
成人（体重70㎏）の普通時の飲食物と共に摂取され る水の量は2，300mlであるといわれる24）。即ち，十二
指腸に分泌された胆汁は摂取水分によって約10倍或 いは6〜14倍に希釈されるものと思われる。
本研究において，胆汁酸類は0．5或いは1．0％以上 で，ムチンは3および5％でく供試〉両菌株の両能 力を増加させ，レシチンは8798では0．5および1％の みにおいて，8238では1％のみにおいて，両能力を 増加させた。ビリルビンは5％で両菌株の胞子形成 能力を低下させ，1％以上で8798のET産生能力を，
3％以上で8238の同能力を低下させた。
一方，胆嚢胆汁中における胆汁酸の含有量は97㎎／
m112）或いは7．1〜159．6㎎／m122），ムチンの含有量は10
〜40㎎／m122＞，リン脂質（主にレシチン）の含有量は 5．56〜67．5㎎／m122），ビリルビンの含有量は0．6
〜41．3㎎／m122）といわれる。
従って，胆汁の分泌・i摂取水分による希釈後の胆 汁成分の濃度は，胆汁酸の場合にはウェルシュ菌の 胞子形成能力およびET産生能力の増加に有効な濃 度範囲内に有り得ると考えられるが，胆汁酸以外の 構成成分即ちムチン，レシチン，ビリルビンの場合 はその濃度が低く胞子形成能力およびET産生能力 に及ぼす影響は少ないと思われる。
また，本菌食中毒の原因食品として「タンパク質 性食品」が多く見られる事実4・5）は，同食品が摂取一さ
れ た 時 に 胆 汁 の 分 泌 が 最 も 多 く な る と い わ れ る 事12・13),胆汁 成 分 と くに 胆 汁 酸 が 本 菌 の 胞 子 形 成 能 力 ・ET産 生 能 力 を 増 加 させ た 事,お よ び,抱 合 型 コ ー ル 酸 が 本 菌 の 胞 子 形 成 を促 進 す る と い わ れ る 事16)と関 連 が 有 る の か も知 れ な い 。
要 約
前 培 養 培 地 に 単 独 に 添 加 し た 胆 汁 成 分 が ウ ェル シ ュ菌NCTC8798,8238の 胞 子 形 成 培 地 にお け る 胞 子 形 成 能 力 お よ び エ ン テ ロ トキ シ ン(ET)産 生 能 力 に及 ぼ す 影 響 を検 討 した 。
コ ー ル 酸,グ リコ コ ー ル 酸 お よび タ ウ ロ コ ー ル 酸 は0.5或 い は1%か ら5%の 範 囲 で 両 菌 株 の 胞 子 形 成 能 力 お よ びET産 生 能 力 を 増 加 さ せ た 。 デ オ キ シ コ ー ル 酸 は0.5或 い は1%で 両 菌 株 の 両 能 力 を増 加 さ せ た が,3或 い は5%で は そ れ ら能 力 を 減 少 さ せ た 。グ リ コ‑お よ び タ ウ ロ ーデ オ キ シ コ ー ル 酸 は0.5 或 い は1%か ら3或 い は5%の 範 囲 で 両 菌 株 の 胞 子 形 成 能 力 を,ま た,後 者 は3お よ び5%で8238のET 産 生 能 力 を増 加 さ せ た 。ケ ノ デ オ キ シ コ ー ル 酸 は0.5 或 い は1%以 上 で 両 菌 株 の 両 能 力 を減 少 させ た が,
グ リ コ‑お よ び タ ウ ローケ ノ デ オ キ シ コ ー ル 酸 は0.5 或 い は1%以 上 で そ れ ら の 能 力 を増 加 さ せ た 。 リ ト
コ ー ル 酸 は1或 い は3%で 両 菌 株 に 最 高 の 両 能 力 を 与 え た。 ム チ ン は3お よ び5%で,レ シ チ ン は0.5或 い は1%で 両 能 力 を増 加 さ せ た 。 ビ リ ル ビ ン は5%
で 胞 子 形 成 能 力 を 減 少 さ せ,1或 い は3%以 上 で ET産 生 能 力 を減 少 さ せ た 。
文 献
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