原 著
真性赤血球増加症および本態性血小板血症における
スクリーニング検査と
JAK2
-V617F 変異予測
についての検討
河野 浩善
1)三好 夏季
1)竹野由美子
1)山本 真代
1)沖川 佳子
2)野田 昌昭
2)兼丸 恵子
1)飯伏 義弘
1) 1) 地方独立行政法人広島市立病院機構広島市立広島市民病院臨床検査部（〒 730-8518 広島県広島市中区基町 7-33） 2) 地方独立行政法人広島市立病院機構広島市立広島市民病院血液内科 要 旨近年，真性赤血球増加症（PV）の約 98%で JAK2-V617F または JAK2 exon 12 変異を認め，本態性血小板血症（ET）の 約 80%で JAK2-V617F，MPL，CALR 変異のいずれかを認めることが報告されている。今や骨髄増殖性腫瘍において遺伝 子変異の解析は診断上必須であるにもかかわらず，限られた施設でしか検査できないのが現状である。我々は，PV，ET および各反応性血球増加症における末梢血液検査データについて後方視的解析を行い，スクリーニングへの応用や JAK2-V617F変異の予測について検討した。その結果，IPF count は PV および ET 症例群で有意に高値を示し，NAP score は PV および ET の中でも JAK2 陽性症例群において有意に高値を示すことが分かった。さらに，JAK2-V617F 変異予測における ROC解析の結果，IPF count および NAP score は AUC が 0.9 以上と予測能が高かった。我々は IPF count のカットオフ値を 10,000/μL（真陽性率 100%，偽陽性率 16.7%），NAP score を 250（真陽性率 85.7%，偽陽性率 25.0%）に設定し，症例を IPF count 10,000/μL未満＆NAP score 250 未満の A 群，IPF count 10,000/μL 未満＆NAP score 250 以上の B 群，IPF count 10,000/μL以上＆NAP score 250 未満の C 群，IPF count 10,000/μL 以上＆NAP score 250 以上の D 群に分類した。A，B 群に は各反応性血球増加症が 91.7%と高率に含まれ，D 群は JAK2 変異陽性率が 94.7%と高かった。このように，PV，ET にお いて IPF count および NAP score は，反応性血球増加症例との鑑別に有用であり，迅速かつ簡便に JAK2-V617F 変異を予測 できる可能性が示唆された。
キーワード
真性赤血球増加症，本態性血小板血症，JAK2-V617F 変異，好中球アルカリホスファターゼスコア，幼若血小板比率
I はじめに
真性赤血球増加症（polycythemia vera; PV）および 本態性血小板血症（essential thrombocythemia; ET）に おいて，2005 年の Janus kinase 2 (JAK2)-V617F 変 異1),2)の発見以降，Myeloproliferative leukemia virus
oncogene（MPL）変異3),4)，JAK2 exon 12 変異5),6)，そ
して 2013 年の calreticulin（CALR）変異7),8) と，JAK-STATシグナル伝達系を直接または間接的に活性化 するドライバー変異の存在が次々と明らかになって きた。 現在，PV の約 95%，ET の約 60%で JAK2-V617F 変異が認められることから，WHO 分類第 4 版9)で は，JAK2-V617F 変異あるいはクローン性を示す他 のマーカーの証明が PV および ET の診断根拠として 採用されている。また，ET 症例においては JAK2-V617F変異群と CALR 変異群で，その臨床像が大き く異なることも報告されており7),10),11)，診断だけで なく治療方針の決定においても遺伝子検査の重要性 が増している。 一方，遺伝子検査を自施設で行える医療機関は限
られており，外部委託検査による結果報告までに
1ヶ月近くを要することも珍しくない。さらに，2016
年 3 月現在，JAK2-V617F 変異検査は保険収載され ておらず，MPL 変異，JAK2 exon 12 変異，CALR 変 異においては外注検査でも検査対応していないのが 現状である。 そこで，我々は，PV，ET および各反応性血球増 加症における末梢血液検査データについて後方視的 解析を行い，スクリーニングへの応用や JAK2-V617F 変異の予測について検討したので報告する。 II 対象および方法 1．対象 2008年 11 月から 2016 年 3 月の間に，当院で骨髄 増殖性腫瘍（myeloproliferative neoplasms; MPN）を 疑われ，JAK2-V617F 変異解析の依頼があった 53 例 を対象とした。対象症例の内訳は，PV 8 例（平均年 齢 70.4 歳，男性 2 例，女性 6 例，JAK2-V617F 変異 全例陽性），ET 19 例は JAK2-V617F 変異の有無で群 別し，ET-JAK2 (+) 15 例（平均年齢 64.8 歳，男性 8 例，女性 7 例），ET-JAK2 (−) 4 例（平均年齢 64.5 歳， 男性 3 例，女性 1 例），反応性赤血球増加症 17 例（平 均年齢 58.6 歳，男性 14 例，女性 3 例），反応性血小 板増加症 9 例（平均年齢 57.6 歳，男性 5 例，女性 4 例）だった。尚，本研究は広島市民病院倫理審査委 員会の承認を得て行った。 2．方法 1）末梢血液検査（CBC） EDTA-2K 加 末 梢 血 を 用 い ， 幼 若 血 小 板 比 率 （immature platelet fraction; IPF）が測定可能な XE IPF master 搭 載 の 多 項 目 自 動 血 球 分 析 装 置 XE-2100 （Sysmex 株式会社）にて測定した。 2）好中球アルカリホスファターゼ（NAP）染色 採血直後の末梢血を用いて塗抹標本を作製後，好 中球アルカリホスファターゼ染色試薬 ALP 染色キッ ト（武藤化学株式会社）にて染色し，好中球 100 個 の陽性指数（NAP score）と陽性率（NAP rate）を朝 長法にて算定した。 3）血清エリスロポエチン erythropoietin（EPO） 外注検査（株式会社 SRL，CLEIA 法）にて測定し た。 4）遺伝子変異解析 外注検査（株式会社 SRL）にて JAK2-V617F 変異 解析を行い，PV，ET が否定できない陰性例に関し て，さらに川崎医科大学検査診断学（病態解析）研 究室にて JAK2 遺伝子 exon 12/14 領域と CALR 遺伝 子 exon 9 領域を解析した。 5）統計解析 各群間比較については Mann-Whitney U 検定を用 いて，危険率 p < 0.05 を統計学的有意差ありと判断 した。さらに，有意差を認めた共通項目に対し， ROC解析を用いてカットオフ値を設定することで JAK2-V617F変異の予測が可能か検討した。 III 結 果 1．PV 症例群と反応性赤血球増加症例群の比較 （Table 1） PV症例群と反応性赤血球増加症例群の各検査項 目の中央値比較では，20 項目中 12 項目（WBC, NEUT, RBC, MCV, MCH, MCHC, RDW-SD, RET count, PLT, IPF count, NAP score, NAP rate）で有意差 を認めた。反応性赤血球増加症例群が赤血球系のみ の増加だったのに対し，PV 症例群は 3 血球系統共 に増加していた。 2．ET 症例群と反応性血小板増加症例群の比較 （Table 2） ET-JAK2 (+)群，ET-JAK2 (−)群および反応性血小板 増加症例群で各検査項目の中央値を比較した。ET-JAK2 (+)群と反応性血小板増加症例群では，19 項目 中 9 項目（RBC, Hb, Ht, P-LCR, MPV, PDW, IPF%, IPF count, NAP score），ET-JAK2 (−)群と反応性血小板増 加症例群では，19 項目中 6 項目（RBC, Hb, Ht, P-LCR, MPV, IPF count），ET-JAK2 (+)群と ET-JAK2 (−)群で は，19 項目中 4 項目（WBC, NEUT, P-LCR, NAP score）で有意差を認めた。ET-JAK2 (+)群は，PLT の 著増と大小不同を示唆する検査所見（P-LCR，MPV， PDWの上昇）および WBC の増加が特徴的だった。 ET-JAK2 (−)群も，ほぼ同様の傾向であったが，WBC の増加は認められなかった。一方，反応性血小板増 加症例群は，PLT の増加に加えて基礎疾患による貧 血を伴い，P-LCR，MPV，PDW の上昇は認められな かった。
3．共通項目の比較（Figure 1–3） PV症例群と反応性赤血球増加症例群，ET-JAK2 (+)群と反応性血小板増加症例群の比較より，共通し て有意差が認められた項目は，RBC，IPF count，NAP scoreの 3 項目であった。そこで新たに，この 3 項目 における各群間比較を行った。 RBCでは，PV 症例群が最も高値，続いて反応性 赤血球増加症例群が他の 3 群より有意に高値とな り，反応性血小板増加症例群が最も低値だった。ま た，ET-JAK2 (+)群と ET-JAK2 (−)群は基準範囲内で， PV症例群と反応性赤血球増加症例群の検査値比較 ①PV 8例 ②反応性赤血球増加症 17例 p値 ① vs ② WBC（/μL） 11,625 6,453 <0.001 NEUT（/μL） 8,949 4,481 <0.001 RBC（×104/μL） 630 589 0.023 Hb（g/dL） 17.7 19.0 0.170 Ht（%） 54.2 55.6 0.930 MCV（fL） 87.3 94.3 0.023 MCH（pg） 28.6 32.2 0.006 MCHC（g/dL） 32.7 34.1 0.003 RDW-SD（fL） 50.6 46.9 0.029 RET（%） 1.6 1.2 0.152 RET count（×104/μL） 9.4 7.0 0.041 PLT（×104/μL） 47.2 18.4 0.003 P-LCR（%） 29.8 26.9 0.280 MPV（fL） 10.5 10.2 0.324 PDW（fL） 13.2 12.3 0.253 IPF（%） 5.1 3.4 0.091 IPF count（/μL） 18,962 5,485 <0.001 NAP score 373 196 <0.001 NAP rate（%） 92.4 77.5 0.003 EPO mIU/mL 6.5 9.7 0.426 Table 1 ET症例群と反応性血小板増加症例群の検査値比較 ③ET-JAK2 (+) 15例 ④ET-JAK2 (−) 4例 ⑤反応性血小板増加症 9例 p値 ③ vs ⑤ ④ vs ⑤ ③ vs ④ WBC（/μL） 10,647 6,300 9,089 0.170 0.216 0.036 NEUT（/μL） 7,582 4,392 6,648 0.144 0.643 0.028 RBC（×104/μL） 498 448 368 0.006 0.031 0.162 Hb（g/dL） 14.0 13.9 10.4 0.009 0.031 0.548 Ht（%） 43.0 41.3 32.3 0.008 0.025 0.317 MCV（fL） 88.7 92.3 87.5 0.340 0.643 0.230 MCH（pg） 28.7 31.1 28.2 0.655 0.164 0.177 MCHC（g/dL） 32.4 33.6 32.3 0.189 0.102 0.133 RDW-SD（fL） 53.3 47.3 48.6 0.438 0.799 0.424 RET（%） 1.5 1.3 1.6 1.000 0.698 0.363 RET count（×104/μL） 7.1 5.5 5.8 0.101 0.877 0.099 PLT（×104/μL） 80.6 78.4 67.3 0.079 0.217 0.764 P-LCR（%） 24.9 18.6 12.9 <0.001 0.017 0.045 MPV（fL） 9.9 9.2 8.4 <0.001 0.029 0.071 PDW（fL） 11.8 10.3 8.9 <0.001 0.074 0.064 IPF（%） 3.2 2.2 1.1 <0.001 0.088 0.192 IPF count（/μL） 25,962 18,489 6,954 <0.001 0.045 0.368 NAP score 290（N = 13） 169 216（N = 7） 0.019 0.345 0.024 NAP rate（%） 88.1（N = 13） 67.0 80.1（N = 7） 0.074 0.296 0.070 Table 2
両群に有意差は認められなかった。
IPF countでは，PV 症例群，ET-JAK2 (+)群および ET-JAK2 (−)群の間には有意差は認められなかった が，上記 3 群は反応性赤血球増加症例群および反応 性血小板増加症例群よりも有意に高値だった。 NAP scoreでは，PV 症例群が最も高値で，続いて ET-JAK2 (+)群が他の 3 群より有意に高値であった。 また，ET-JAK2 (−)群，反応性赤血球増加症例群およ び反応性血小板増加症例群の間には有意差は認めら れなかった。 4． JAK2-V617F 変 異 予 測 に お け る ROC 解 析 （Figure 4）
RBC，IPF count，NAP score を用いて JAK2-V617F 変異（陽性 23 例，陰性 30 例）の予測における ROC 解析を行ったところ，ROC 曲線下面積（area under the curve; AUC）は，RBC が 0.601，IPF count が
800 700 600 500 400 300 200 100 0 PV ET-JAK2（＋） ET-JAK2（−） 反応性赤血球増加症 反応性血小板増加症 PV vs ET-JAK2（＋） p = 0.009 vs ET-JAK2（−） p = 0.042 vs 反応性赤血球増加症 p = 0.023 vs 反応性血小板増加症 p = 0.003 ET-JAK2（＋） vs 反応性赤血球増加症 p = 0.006 vs 反応性血小板増加症 p = 0.006 ET-JAK2（−） vs 反応性赤血球増加症 p = 0.002 vs 反応性血小板増加症 p = 0.031 反応性赤血球増加症 vs 反応性血小板増加症 p < 0.001 RBC × 10 4/μL RBCにおける各症例群での比較 Figure 1 80,000 70,000 60,000 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 0 PV ET-JAK2（＋） ET-JAK2（−） 反応性赤血球増加症 反応性血小板増加症 PV vs 反応性赤血球増加症 p < 0.001 vs 反応性血小板増加症 p = 0.002 ET-JAK2（＋） vs 反応性赤血球増加症 p < 0.001 vs 反応性血小板増加症 p < 0.001 ET-JAK2（−） vs 反応性赤血球増加症 p = 0.009 vs 反応性血小板増加症 p = 0.045 IPF × count （/ μ L ） IPF countにおける各症例群での比較 Figure 2
0.936，NAP score が 0.912 だった。さらに，AUC が 0.9以上と予測能が高かった IPF count および NAP scoreに対して各々カットオフ値を 10,000/μL（真陽 性 率 100% ， 偽 陽 性 率 16.7% ）， 250 （ 真 陽 性 率 85.7%，偽陽性率 25.0%）に設定した。
5．IPF count と NAP score による各症例の分布
（Figure 5）
IPF countと NAP score を用いて，各症例の分布図 を作製し，ROC 解析で求めたカットオフ値を用い 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 ROC曲線 IPF count NAP score RBC 0.936 0.912 0.601 AUC FPF 0.2 0.4 0.6 0.8 1 TPF JAK2-V617F変異予測に対する ROC 曲線
TPF: true positive fraction，真陽性率
FPF: false positive fraction，偽陽性率（1－特異度） AUC: Area under the curve，曲線下面積
Figure 4
て，IPF count 10,000/μL 未満＆NAP score 250 未満を A群，IPF count 10,000/μL 未満＆NAP score 250 以上 を B 群，IPF count 10,000/μL 以上＆NAP score 250 未 満を C 群，IPF count 10,000/μL 以上＆NAP score 250 以上を D 群とした。A 群には，反応性赤血球増加症 が 13 例と最も多く，その他に反応性血小板増加症 4 例と ET-JAK2 (−) 2 例が分布していた。B 群には 5 例 しか分布せず，全て反応性症例だった。C 群は ET-JAK2 (+) 3例，ET-JAK2 (−) 2 例および反応性血小板 増加症 1 例が含まれていた。D 群には，PV の全例， ET-JAK2 (+) 10例および反応性血小板増加症 1 例が 分布していた。 IV 考 察 近年，日本人においても，PV 患者の約 98%で
JAK2-V617Fまたは JAK2 exon 12 変異を認め，ET 患
者の約 80%で JAK2-V617F，MPL，CALR 変異のいず れかを認めることが報告されている12),13)。今や MPN
において遺伝子変異の解析は診断上必須であるにも かかわらず，限られた施設でしか検査できないのが 現状である。しかし，今回の検討で，IPF count と NAP scoreを検査することで，PV，ET および各反応 性血球増加症との鑑別や JAK2-V617F 変異の予測に 応用可能であることが示唆された。 IPFは，フローサイトメトリー法による網血小板 と比較的良く相関し，特発性血小板減少性紫斑病 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 PV ET-JAK2（＋） ET-JAK2（−） 反応性赤血球増加症 反応性血小板増加症 PV vs ET-JAK2（＋） p = 0.008 vs ET-JAK2（−） p = 0.007 vs 反応性赤血球増加症 p < 0.001 vs 反応性血小板増加症 p = 0.003 ET-JAK2（＋） vs ET-JAK2（−） p = 0.024 vs 反応性赤血球増加症 p < 0.001 vs 反応性血小板増加症 p = 0.019 NAP score NAP scoreにおける各症例群での比較 Figure 3
（idiopathic thrombocytopenic purpura; ITP）や再生不良 性貧血，肝硬変などの血小板減少性疾患の鑑別14),15)， 化学療法や造血幹細胞移植後の血小板数回復の予 測16),17)など，骨髄の血小板産生能を反映する検査と して広く利用されている。一方，PV，ET において も JAK2-V617F 変異陽性例や血栓症合併例で IPF% が高いことが報告され，注目されている18),19)。 今回の検討でも，IPF count は PV および ET 症例 群で有意に高値を示し，各反応性血球増加症例群と の鑑別に有用と考えられた（Figure 2）。ただし，そ の要因は PV 症例群と ET 症例群でやや異なるもので あった。PV 症例群と反応性赤血球増加症例群では， IPF%に有意差は認められず，PLT に依存して IPF countに差が生じたと考えられる（Table 1）。それに 対して，ET-JAK2 (+)群，ET-JAK2 (−)群および反応性 血小板増加症例群では，PLT には有意差がなく， IPF%の差が IPF count に直接反映されていた（Table
2）。 さらに，PV，ET における IPF%の差の原因につい て解析するため，日本臨床衛生検査技師会血液形態 ワーキンググループの血液形態検査に関する勧告 法20)に準拠し，末梢血標本による血小板形態の確認 を行った。その結果，大型もしくは巨大血小板が PV 症例群で 5 例（62.5%），ET-JAK2 (+)群で 11 例（約 73.3%），ET-JAK2 (−)群で 2 例（50%）と高頻度で認 められたのに対し，反応性赤血球増加症例群では 2 例（約 11.8%），反応性血小板増加症例群では 1 例 （約 11.1%）のみだった。IPF の解析は，核酸染色に よる蛍光強度が強く，やや大型の血小板分画をゲー ティングしているため，PV および ET では骨髄での 血小板産生能の亢進による網血小板の存在だけでな く，成熟血小板の形態異常も数値に反映されている 可能性が高いと考えられる21)。 また，NAP は好中球の二次顆粒内に含有されるリ ソソーム酵素の一種であり，その NAP 遺伝子の発現 調節は G-CSF が JAK-STAT シグナル伝達系を介して 行っている。そのため，JAK2-V617F 変異による JAK-STATシグナル伝達系の恒常的活性化は，NAP score
も上昇させると考えられている22)。今回の検討でも
NAP scoreは，JAK2-V617F 変異陽性である PV 症例 群および ET-JAK2 (+)群において有意に高値を示した （Figure 3）。奥野ら23)も，ET 58 症例において
JAK2-反応性赤血球増加症 反応性血小板増加症 PV ET-JAK2（＋） ET-JAK2（−） 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0 IPF count （ /μL ） NAP score 0 100 200 250 300 400 500 A B C D
IPF countと NAP score による各症例の分布
A群：IPF count 10,000/μL 未満＆NAP score 250 未満 B群：IPF count 10,000/μL 未満＆NAP score 250 以上 C群：IPF count 10,000/μL 以上＆NAP score 250 未満 D群：IPF count 10,000/μL 以上＆NAP score 250 以上
V617F変異陽性群の方が陰性群よりも NAP score が 有意に高値だったことを報告している。そのうえ， 今回，JAK2-V617F 変異陽性例の中でも ET-JAK2 (+) 群より PV 症例群の方が NAP score が有意に高値を 示したが，これは JAK2 変異アリル比率の差が原因 と推察される。なぜなら，PV の方が ET より JAK2 変異アリル比率が高値であることが知られている が12)，その JAK2 変異アリル比率は NAP score と強い
正の相関関係が認められているからである23)。
今回，我々が設定した JAK2-V617F 変異の予測の ためのカットオフ値（IPF count 10,000/μL, NAP score 250）を用いて，症例を 4 群に分類することで，PV， ETおよび各反応性血球増加症のスクリーニングが可 能であった（Figure 4, 5）。A，B 群には各反応性血 球増加症が 91.7%と高率に含まれ，JAK2 変異陽性の PVおよび ET 症例は 1 例も分布していなかった。逆 に，D 群の症例は JAK2 変異陽性率が 94.7%と高く， PVの全症例と ET-JAK2 (+)群の 10/13 例（76.9%）が 分布していた。また ET-JAK2 (−)群は，A 群と C 群 に分布しており，CALR 変異陽性 1 例は A 群に，
JAK2（exon 12/14）変異および CALR 変異が否定さ れ，MPL 変異もしくは triple negative と考えられる症 例が C 群に 2 例，A 群と C 群の境界に 1 例分布して いた。今後，CALR 変異，MPL 変異および triple negativeの症例数も増やし検討を行う必要があるが， 遺伝子変異の違いによって分布する群が異なる可能 性が示唆された。 V まとめ
PV，ET における IPF count および NAP score は， 反応性血球増加症例との鑑別に有用であり，迅速か つ簡便に JAK2-V617F 変異を予測できるマーカーと なる可能性がある。 謝辞 遺伝子変異解析にご協力頂きました川崎医科大学血液内科・近 藤敏範先生ならびに検査診断学（病態解析）研究室のスタッフの 皆様に深謝致します。 ■文献
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Screening examination of polycythemia vera and essential
thrombocythemia: Investigation of the prediction of
JAK2
-V617F
mutation
Hiroyoshi KOUNO1) Natsuki MIYOSHI1) Yumiko TAKENO1) Masayo YAMAMOTO1)
Yoshiko OKIKAWA2) Masaaki NODA2) Keiko KANEMARU1) Yoshihiro IBUSHI1)
1)Department of Clinical Laboratory, Hiroshima City Hiroshima Citizens Hospital (7-33, Motomachi, Naka-ku, Hiroshima-shi, Hiroshima 730-8518, Japan)
2)Department of Hematology, Hiroshima City Hiroshima Citizens Hospital
Summary
In a recent report, approximately 98% of polycythemia vera patients have JAK2-V617F or JAK2 exon12 mutation. There is a genetic mutation (JAK2-V617F, MPL, or CALR mutation) in approximately 80% of essential thrombocythemia patients. Genetic mutation analysis is necessary for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms, but, at present, such analysis can be carried out in only a few facilities. This study is a retrospective analysis of the results of peripheral blood examination of PV and ET patients and secondary polycythemia and reactive thrombocytosis. The purpose of this analysis is to predict the JAK2-V617F mutation by establishing a screening examination method. Results showed that the IPF count was significantly higher in PV and ET patients. In addition, the NAP score was significantly higher in JAK2-positive PV and ET patients. Furthermore, the results of ROC analysis, AUC of IPF count, and NAP score were more than 0.9, and these had a high capability to predict the JAK2-V617F variation. For the IPF count, the cut-off level is 10,000/μL (100% true positive rate, 16.7% false positive rate), whereas for the NAP score, the cut-off level is 250 (85.7% true positive rate, 25.0% false positive rate). We divided these patients into 4 groups, namely, A (IPF count <10,000/μL & NAP score <250), B (IPF count <10,000/μL & NAP score ≥250), C (IPF count ≥10,000/μL & NAP score <250), and D (IPF count ≥10,000/μL & NAP score ≥250). 91.7% of secondary polycythemia and reactive thrombocytosis patients were classified in group A or B; on the other hand, the true positive rate of JAK2 mutations in group D was 94.7%. These study results indicate that the IPF count and NAP score in PV and ET are useful for the differentiation of treatment-responsive patients, and there is a possibility that they can be used to quickly and easily predict the JAK2-V617F mutation.
Key words: polycythemia vera, essential thrombocythemia, JAK2-V617F mutation, NAP score, immature platelet fraction
