総合論文
ペ プ チ ド核 酸 (PNA) お よ び そ の 類 縁 体 か ら な る 機 能 性
人 工 核 酸 の 合 成 と 性 質 岩 瀬 村 上 礼 子* 章
Synthesis, Properties and Functions of Peptide Nucleic Acids (PNA) and Their Derivatives
Reiko Iwase* and Akira Murakami
In 1991 Nielsen et al. first described peptide nucleic acid (PNA), which is a DNA mimic with a pseudopeptide backbone composed of N-(2-aminoethyl)glycine units with the nucleobases attached to the glycine nitrogen via carbonyl methylene linkers. PNA is a very attractive molecule as a DNA mimic because it shows high biological stability with strong binding-affinity to comple- mentary DNA and RNA. The limitations of PNA include low aqueous solubility, ambiguity in DNA binding orientation and poor membrane permeability. Various PNA derivatives were reported to improve physicochemical and biological properties of PNA. Chirality was introduced into the achi- ral PNA backbone to influence the selectivity in DNA binding orientation. PNA backbone was rigidified by introduction of ring structure to preorganize PNA for duplex formation. This review focuses on the chemistry and biological activity of PNA, and gives an overview of backbone modi- fications of PNA.
Key words: peptide nucleic acids, PNA, bis-PNA, strand invasion, triple helix, antisense agents, antigene agents, molecular beacon, drug delivery
は じ め に
遺 伝 子 の 塩 基 対 形 成 能 は, 遺 伝 情 報 を 正 確 に伝 達 す る 上 で 重 要 で あ る. 化 学 合 成 し た 核 酸 オ リ ゴ マ ー も, こ の 性 質 に よ り, 塩 基 配 列 特 異 的 に 遺 伝 子 と 結 合 す る こ と が で き る. そ の た め 合 成 核 酸 オ リ ゴ マ ー は, 標 的 遺 伝 子 の 機 能 を 制 御 し た り,特 定 の 遺 伝 子 を 検 出 す る プ ロ ー ブ と し て 用 い ら れ る. そ こ で,こ の よ う な 機 能 を 生 体 内 環 境 下 で も 十 分 に 発 揮 さ せ る た め, 化 学 修 飾 核 酸 の 研 究 が 数 多 く 行 わ れ て き た ユー3). ペ プ チ ド核 酸(PNA) (1) は, DNAの 糖 一リ ン酸 骨 格 を(2‑ア ミ ノ エ チ ル)グ リ シ ン に 置 き 換 え た 人 工 核 酸 で,1991年 にNielsenら に よ り最 初 に 報 告 さ れ た(図1)4‑6). こ のPNAは, 核 酸 相 補 鎖 と 結 合 す る こ と が で き7,8), し か も 生 体 内 環 境 下 で 安 定 に 存 在 で き る 性 質 を持 つ9). 従 っ て,PNAは 遺 伝 子 の 機 能 制 御 物 質 や 検 出 プ ロ ー ブ と し て の 応 用 を 始 め と し て, そ の 適 用 範 囲 が 急 速 に 広 が り つ つ あ る 現 状 に あ る10‑16).
PNA以 外 に 遺 伝 子 制 御 に 広 く応 用 さ れ た 代 表 的 な 人 工 核 酸 と して, メ チ ル ポ ス ホ ネ ー ト型DNA(2), ホ ス ホ ロ チ オ エ ー ト型DNA(3), 2'‑O‑メ チ ル 型RNA(4)な ど が
あ る(図1)1‑3).
こ れ らの 人 工 核 酸 と は異 な り,PNAは, バ ッ クボ ー ン構 造 に糖 環 や負 電 荷 を持 た な い.こ の構造 上 の違 い に よ り,PNAは 高 い核 酸 分 解 酵 素 耐 性 を持 ち,核 酸 相 補 鎖 と安 定 な二 重鎖 お よび 三重 鎖 を形 成 す る こ とが 可 能 と な っ て い る.一 方, PNA を遺伝 子 制 御 物 質 と して 用 い る場 合 い くつ か の弱 点 が あ る. PNA の バ ック ボ ー ン構 造 は核 酸 と比 較 して よ り柔 軟 で あ る た め,PNAと 核 酸 が 二 重 鎖 を形 成 す る 際, PNA のN末 端 と核 酸 の3'末 端 が 相 対 す る ア ンチ パ ラ レル型 の 結 合 と,PNAのN末 端 と核 酸 の5'末 端 が相 対 す るパ ラ レル型 の結 合 の2種 類 が 可 能 と な る(図2)7,17).ま た, PNA が 長 鎖 に な る と水 溶 性 が 低 下 す る こ とや18),細 胞 膜 に対 す る透 過 性 が 低 い こ と な どの 性 質 を示 す19).そ こで, PNA を化 学 修 飾 す る
*
京都工芸繊維大学繊維学部高分子学科
( )
* Department of Polymer Science and Engineering, Kyoto Institute of Technology (
)
Fig. 1 Structures of DNA, PNA and modified oligonucleotides.
こ とに よ り,こ れ らの弱 点 を改 善 す る研 究 が 行 わ れ て い る20,21).本 稿 で は,ま ず,PNAの 合 成 と性 質 に つ い て 概 説 し,次 に,最 近 のPNA類 縁 体 とそ の 核 酸 認 識 能 に 関 す る研 究 動 向, そ して, PNA に よ る遺 伝 子 制 御 や 遺 伝 子 検 出へ の応 用 につ い て紹 介 す る.
1. ペ プ チ ド核 酸 (PNA) の 合 成 と そ の 性 質
1.1 PNA の 合 成
PNAの 合 成 は, ま ず ペ プ チ ド合 成 に 準 じ てBoc法 に よ る 固 相 合 成 が 行 わ れ た4,6,22‑24).核 酸 塩 基 部 位 の 保 護 基 に は ベ ン ジ ル オ キ シ カ ル ボ ニ ル (Cbz) 基 (表1, entry1, entry2), 固 相 担 体 に は 正 電 荷 を持 つ リ シ ン残 基 をPNA のC末 端 に 結 合 させ る た め に,リ シ ン修 飾MBHA一 ポ リ ス チ レ ン担 体 (5) (図3(a)) が 用 い ら れ た.こ の リ シ ン は, PNA の 自 己 会 合 を 防 ぐ た め と, PNA の 収 率 を ア ミ ノ 酸 分 析 で 定 量 す る た め に 導 入 さ れ た. Boc 基 の 除 去 に は, 50% ト リ フ ル オ ロ 酢 酸/ジ ク ロ ロ メ タ ン 溶 液 が 用 い ら れ, PNA の 担 体 か ら の 切 断 と Cbz 基 の 除 去 に は, HF
あ る い は ト リ フ ル オ ロ 酢 酸/ト リ フ ル オ ロ メ タ ン ス ル ホ ン 酸 が 用 い ら れ た.最 近, Boc 法 で の 核 酸 塩 基 の 保 護 基 と して ベ ン ゾ イ ル 基 や イ ソ ブ チ リ ル 基 を 用 い たPNAの 合 成 が 報 告 さ れ た (表1, entry3)25). こ の 時, ベ ン ゾ イ
ル ア デ ニ ン を 有 す るPNAモ ノ マ ー の 縮 合 反 応 を ウ ロ ニ ウ ム 系 縮 合 剤 のHATU (7) (図3(b)) と ジ イ ソ プ ロ ピ ル エ チ ル ア ミ ン を 用 い て 行 う と, 核 酸 塩 基 部 位 に 副 反 応 が 生 じ て 縮 合 収 率 が 低 下 し た.そ こ で, ホ ス ホ ニ ウ ム 系 縮 合 剤 の PyAOP (8) (図3(b)) と N一 メ チ ル モ ル ホ リ ン を 用 い る と縮 合 収 率 が 改 善 さ れ た.こ の 方 法 に よ りPNAl一 量 体 を 合 成 後,PAM一 レ ジ ン (6) (図3(a)) か ら の 切 り 出 し, お よ び ア シ ル 型 保 護 基 の 除 去 を ア ン モ ニ ア 水 ま た は メ チ ル ア ミ ン水 溶 液 で 行 い,全 収 率68%で 目 的 と す る PNAが 得 ら れ た と報 告 さ れ て い る.
一方, Fmoc 法 に よ るPNAの 合 成 が 報 告 さ れ,塩 基 部 位 の 保 護 基 に は,酸 性 条 件 下 で 除 去 可 能 な Cbz 基26), ベ ン ズ ヒ ド リ ル オ キ シ カ ル ボ ニ ル (Bhoc)基27), あ る い は モ ノ メ トキ シ ト リチ ル (Mmt)基28) が 用 い ら れ た (表1, entry4‑6).Fmoc基 の 除 去 は, 20% ピ ペ リ ジ ン 溶 液 で 行 わ れ た.ま た, 最 終 段 階 に お け る Bhoc 基, お よ び Mmt 基 の 除 去 は, ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 が 用 い ら れ た.さ
ら に 緩 和 な 条 件 下 で PNA を 合 成 す る 方 法 と し て, N一 末 端 の 保 護 基 にMmt基, 核 酸 塩 基 部 位 の 保 護 基 に ア ニ ソ イ ル 基 や イ ソ ブ チ リ ル 基 を 用 い る 方 法 が 報 告 さ れ た
(a) (b)
Fig. 2 Schematic representation of PNA binding to complementary oligonucleotides.
Table 1 Structures of PNA monomers with protecting groups and the deprotection methods.
Fig. 3 (a) Structures of polymer supports. MBHA: (4-methylbenzhydryl)amine; PAM: 4-hydroxymethylphenylacetic acid. (b) Struc- tures of condensing reagents. HATU: N-Rdimethylamino)--1H-1, 2, 3-triazolo[4, 5-b]pyridine-1-ylmethylene]-N-methyl- methanaminium hexafluorophosphate N-oxide; PyAOP: (7-azabenzotriazol-1-yloxy)tris(pyrrolidino)phosphonium hexafluo- rophosphate.
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(表1,entry7)29). こ の PNA 合 成 法 は, DNA の 固 相 合 成 で 用 い る 保 護 基 の 組 み 合 わ せ と 一 致 し て お り, PNA/DNA キ メ ラ オ リ ゴ マ ー の 合 成 に 用 い ら れ た1一).
1.2 PNA の 性 質
1.2.1 PNA の 核 酸 に 対 す る 結 合 性
Nielsenら は,当 初 PNA を DNA 二 重 鎖 と Hoogsteen 塩 基 対 (図4(b)) で 結 合 し て 三 重 鎖 を 形 成 す る 物 質 と し て 設 計 し た.そ し て, チ ミ ン 塩 基 を 持 つ PNA10 量 体
(T10, C末 端 に リ シ ン,N末 端 に ア ク リ ジ ン を 含 む)を 合 成 し て, デ オ キ シ ア デ ノ シ ン の10量 体 (dA10) 領 域 を持 つDNA二 重 鎖 と の 結 合 を 検 討 し た4).そ の 結 果, 予 期 に 反 し てPNAはdAlo領 域 とWatson‑Crick塩 基 対 (図4(a))で 結 合 す る 一方, dAlo 領 域 と 結 合 し て い た チ ミ ジ ン10量 体 領 域 は1本 鎖 状 態 に 変 化 す る こ と が 見 出 さ れ た4).こ のPNAの 結 合 の 仕 一 は, ス ト ラ ン ド イ ン ベ ー ジ ョ ン と 呼 ば れ て い る.そ の 後 の 数 々 の 研 究 か ら , PNAとDNA二 重 鎖 の 結 合 は 以 下 に 示 す4つ の 形 式 が 知 ら れ て い る13,21).
(1) PNAがDNA二 重 鎖 とHoogsteen塩 基 対 で 結 合 し た 三 重 鎖(Triplex)(表2,entry1):PNAが シ ト シ ン塩 基 を多 く含 む ピ リ ミ ジ ン 配 列 か ら な る 場 合 に 生 じ る30).
(2) 侵 入 型 三 重 鎖(Triplex invasion) (表2, entry2): ピ リ ミ ジ ン 配 列 を 持 つPNA2本 が,相 補 的 な プ リ ン 配 列 のDNA鎖 に 対 し て, Watson‑Crick塩 基 対,お よ びHoogsteen塩 基 対 を 形 成 し, PNA‑
DNA‑PNAの 三 重 鎖 を 生 じ る生31).
(3) 侵 入 型 二 重 鎖(Duplex invasion) (表2,entry4):
PNAがDNA相 補 鎖 とWatson‑Crick塩 基 対 を 形 成 し て ー 重 鎖 を 生 じ る.こ の 二 重 鎖 形 成 は,PNA
が プ リ ン 塩 基 配 列 の 場 合 に 生 じ や す い32).PNA の ア デ ニ ン 塩 基 を2,6一 ジ ア ミ ノ プ リ ン塩 基(9) (図 5(a)) に 置 き 換 え る と, ア デ ニ ンーチ ミ ン塩 基 対 (図 4(a)) の 水 素 結 合 数 が1本 増 加 し,DNA‑PNA二 重 鎖 の 安 定 性 は 向 上 す る32).
(4) 二 重 侵 入 型 二 重 鎖(Double duplex invasion) (表2, entry5): 相 補 的 な 塩 基 配 列 を 持 つ2種 類 の PNA が,標 的DNA二 重 鎖 の 同 一 領 域 に 対 し て, そ れ ぞ れ Watson‑Crick 塩 基 対 を 形 成 し2つ の 二 重 鎖 を 生 じ る33).相 補 的 なPNAが 互 い に 二 重 鎖 を形 成 し な い よ う に,PNAの ア デ ニ ン 塩 基 を2,6一 ジ ア ミ ノ プ リ ン, チ ミ ン 塩 基 を2一 チ オ ウ ラ シ ル
(10) (図5(b))に 変 え,立 体 障 害 に よ りPNA・
PNA二 重 鎖 の 形 成 を抑 制 し たPNA誘 導 体 が 用 い ら れ る.
核 酸 に よ る 三 重 鎖 の 形 成 は,pHの 影 響 を 受 け る.こ れ は,Hoogsteen塩 基 対 で 結 合 す る 核 酸 塩 基 が シ トシ ン 塩 基 の 場 合,そ のN3位(pKa4.5)が プ ロ ト ン化 し て 水 素 結 合 形 成 が 可 能 に な る と, 三 重 鎖 が よ り安 定 化 す る た め で あ る (図4(b)). そ こ で,シ ト シ ン 塩 基 を シ ュ ー ド イ ソ シ トシ ンq1) (図5(c)) に 鷹 き 換 え る と,中 性 条 件 下 で も グ ア ニ ン 塩 基 部 一位 の 窒 素 原 子 と水 素 結 合 を形 成 す る た め,三 重 鎖 の 安 定 性 がpHに 依 存 し な く な る こ と が 報 告 さ れ て い る34,35). PNA‑DNA‑PNA 型 の 三 重 鎖 に つ い て もpH依 存 性 を 解 消 す る た め に, Hoogsteen 塩 基 対 で 結 合 す る PNA に シ ュ ー ド シ ト シ ン 塩 基 が 組 ま れ た.そ し て,Watson‑Crick塩 基 対 で 結 合 す る PNA と シ ュ ー ド イ ソ シ ト シ ン を 含 み Hoogsteen 塩 基 対 で 結 合 す るPNAを リ ン カ ー で 連 結 し た ビ ス ーPNA (表2, entry 3)が 合 成 さ れ た36). こ の ビ ス‑PNAは, 中 性 条 件 下 で 安
(a) (b)
(a) (b) (c)
Fig. 4 (a) Watson-Crick base pairing of A-T and G-C. (b) Chemical structures of Hoogsteen base pairing.
Fig. 5 (a) Watson-Crick base pairing of 2,6-diaminopurine-T31). (b) Watson-Crick base pairing of 2,6-diaminopurine-2-thiouraci132).
(c) Chemical structure of pseudoisocytosine and the formation of Hoogsteen base pairing35).
定 に PNA‑DNA‑PNA 型 の 三 重 鎖 を形 成 す る.
さ て,PNAと 一 本 鎖 核 酸 の 結 合 に つ い て も,上 記 の DNA二 重 鎖 との結 合 の 場 合 と同様 に,二 重 鎖 あ るい は 三 重 鎖 の 形 成 が起 こる(表2,entry6‑8).二 重 鎖 形 成 で は,標 的核 酸 の塩 基 配列 に制 限 は な い.一 方, 三 重 鎖 形 成 は, プ リ ン塩 基 配 列 の核 酸 に対 して起 こ る. シ ュ ー ド イ ソシ トシ ン を含 む ビス 一PNAは, 一本 鎖核 酸 に対 して
も三重 鎖 を形 成 す る こ とが で きる.
1.2. 2 PNA の化 学 的, 生 化 学 的 性 質
PNAは, 遣 伝 子 の 機 能 制 御 や 検 出 に応 用 す る上 で, 次 の よ う な利 点 を持 つ.
(1) 核 酸 分解 酵 素 や タ ンパ ク 質分 解 酵 素 に耐 性 が あ り, ヒ ト血 清 や 細 胞 抽 出 液 中で 安 定 に存 在 す る9).
(2) バ ック ボ ー ンに電 荷 が ない た め,負 電 荷 を帯 び た 核 酸 相 補 鎖 と結 合 す る際 に 電荷 反発 が な い.
(3) PNA と核 酸 の 二 重 鎖 構造 の安 定 性 は,核 酸 ・核 酸 二 重 鎖 よ りも高い7,8).
(4) PNA と DNA の 二 重 鎖 構 造 の 安 定 性 は,イ オ ン濃 度 に影 響 され に くい. そ して,核 酸 二 重 鎖 を不 安 定 化 す る よ う な低 イ オ ン濃 度 の 条件 下 で も二 重 鎖 構造 を維持 す る性 質 を持 つ37).
(5) PNA は核 酸 相 補 鎖 と塩 基 配 列 選 択 的 に結 合 す る.
す な わ ち,ミ ス マ ッチ 塩 基 対 を含 むPNAと 核 酸 の 二 重 鎖 は,完 全 に 相 補 的 なPNAと 核 酸 の 二 重 鎖 と比 較 して 明 らか に不 安 定 化 す る6).
一方 , PNA を細 胞 内 の 遺 伝 子 制御 に用 い る場 合, 次 の よう な弱 点 が あ る.
(1) PNA と 核 酸 の 結 合 一 向 性:核 酸)上重 鎖 は,5'末 端 と3'末 端 が 相 対 す る ア ン チ パ ラ レル 型 の 一 向 性 で 二 重 鎖 を 形 成 す る. 一 方, PNAは, パ ラ レ ル 型 と ア ン チ パ レ ル 型 の2種 類 の 結 合 が 可 能 で あ る (図2)7,17). ア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 の 一 が,パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 よ り も安 定 性 が 高 い 傾 向 を 示 す.
(2) RNaseHに 対 す る 非 感 受 性:RNaseHと い うRNA 切 断 酵 素 は,DNA・RNA二 重 鎖 に 結 合 し て, RNAを 切 断 す る 性 質 を 持 つ.一 方, PNA・RNA 二 重 鎖 はRNaseHの 作 用 を 受 け な い.す な わ ち, PNAがmRNAと 結 合 し た 際,RNaseHはmRNA
を切 断 す る 作 用 を 示 さ な い38).
(3) PNAの バ ッ ク ボ ー ン に 電 荷 が な い た め, 鎖 長 が 長 く な る と水 溶 性 が 低 下 す る18).
(4) PNAは, 細 胞 膜 透 過 性 に 乏 しい19).
こ れ ら の 問 題 点 を 改 善 す る こ と を 目 的 と し て, PNA の 化 学 修 飾 が 検 討 さ れ て い る. 次 に, PNA の 機 能 改 善 を 目 指 し たPNA誘 導 体 の 研 究 と,PNAの 応 用 例 に つ い て 解 説 す る.
2. PNA の コ ン ホ メ ー シ ョ ン 規 制 に よ る 核 酸 結 合 性 に 関 す る 改 善
PNAの コ ン ポ メ ー シ ョ ン が, ア ン チ パ ラ レ ル 型 の PNA・ 核 酸 二 重 鎖 を 形 成 し や す い 構 造 に あ ら か じ め 規 制 さ れ て い れ ば, ア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 を 優 先 し て 形 成 す る と 期 待 さ れ る39). ま た, こ の よ う にPNAの コ ン ポ メ ー シ ョ ン が 規 制 さ れ る と,PNAと 核 酸 の 二 重 鎖 形 成 Table 2 PNA binding modes upon targeting double stranded DNA or single stranded oligonucleotide13).
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の エ ン ト ロ ピ ー 減 少 量 が 小 さ く な り, 二 重 鎖 の 安 定 化 の 増 加 に 寄 与 す る こ と が 期 待 で き る20).こ れ ま で, PNA の コ ン ポ メ ー シ ョ ン を規 制 す る た め に, 環 構 造 や 二 重 結 合 を 導 入 し たPNA誘 導 体 が 報 告 さ れ て い る.こ こ で は, こ れ ら の コ ン ポ メ ー シ ョ ン を 規 制 し たPNA誘 導 体 の 構 造 と,核 酸 相 補 鎖 に 対 す る 結 合 性 に つ い て 紹 介 す る.
2.1 4一ア ミ ノ プ ロ リル 型 PNA
Ganesh39,40)やJordan41)ら は, PNA の ア ミ ノ エ チ ル 部 位 の β‑炭 素 と グ リ シ ン 部 位 の α一炭 素 を メ チ レ ン基 で 架 橋 し たD一trαns‑4一 ア ミ ノ プ ロ リ ル 型 PNA (12) (図6) を 合 成 し た.ま ず,PNA13量 体 の 鎖 中1カ 所 に12の モ ノ マ ー を 導 入 し た 修 飾PNA (PNA1, 表3, entry1) を合 成 し た.そ して, PNA1 と DNA 相 補 鎖 と の ア ン チ パ ラ
レ ル 型 二 重 鎖 が50%解 離 す る 温 度(Tm値)を 測 定 し た.
こ のTm値 は,二 重 鎖 の 安 定 性 の 指 標 と な り,値 が 大 き い ほ ど 二 重 鎖 構 造 が 安 定 で あ る こ と を 示 す. こ の 二 重 鎖 のTm値 は33.5℃ と な り,未 修 飾 PNA・DNA 二 重 鎖 のTm値 よ り5.5度 増 加 し た (表3,entry+2). 一 方, PNA1は 未 修 飾 の コ ン ト ロ ー ル PNA1 と 異 な り, パ ラ
レ ル 型 二 重 鎖 のTm値 が 観 測 さ れ な か っ た.以 上 の 結 果 か ら,12の モ ノ マ ー をPNAの 鎖 中 に1カ 所 導 入 す る と,よ り ア ン チ パ ラ レ ル 一 向 で 結 合 し や す く な る こ とが 示 さ れ た.こ れ は,12の モ ノ マ ー に お け る コ ン ポ メ ー シ ョ ン が,PNA・DNAア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 に 適 合 し て い る こ と を 示 唆 し て い る. し か し な が ら, 12の み
か ら な る6量 体(TAP6)とDNA相 補 鎖 に よ るTm値 は 観 測 さ れ な か っ た.こ の 結 果 は,12の み か ら な る オ リ ゴ マ ー の 場 合,バ ッ ク ボ ー ン の コ ン ポ メ ー シ ョ ン の 制 限 が 過 剰 に な り,DNAと の 結 合 に 適 合 し な か っ た こ と を 示 唆 して い る.
2.2 ア ミ ノ エ チ ル プ ロ リル 型 PNA
Ganeshら は,次 に,PNAの グ リ シ ン 部 位 を プ ロ リ ン に 変 え て バ ッ ク ボ ー ン と核 酸 塩 基 部 位 の 立 体 配 置 に 制 限 を 加 え る 一 方,ア ミ ノ エ チ ル 部 位 は 修 飾 せ ず 柔 軟 性 を残 し た(2S,4S)一 ア ミ ノ エ チ ル プ ロ リ ル 型 PNA (13) を合 成 し た42,43). PNA10量 体 の 鎖 中1カ 所 に13の モ ノ マ ー を 導 入 し たPNA2(表3,entry3)の 場 合,DNAと の ア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 のTm値 は,未 修 飾 の コ ン トロ ー ルPNA2よ り も約13度 上 昇 し た(表3,entry3‑4).ま た, PNA2・DNA 二 重 鎖 のTm値 は, ア ン チ パ ラ レ ル 型 結 合 の 一 が パ ラ レ ル 型 結 合 よ り も約23度 上 昇 し た(表3, entry3).従 っ て,13の モ ノ マ ー の コ ン ポ メ ー シ ョ ン
は,12と 同 様 にPNA・DNAア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 に 適 合 し, DNA と ア ン チ パ ラ レ ル 一 向 で よ り結 合 し や す い 性 質 を持 つ こ と が わ か っ た. し か し な が ら, プ リ ン塩 基 を 持 つ13の モ ノ マ ー を PNA 鎖 中 に 導 入 し た 場 合, DNAと の パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 も安 定 化 し た. こ れ は, 13 の モ ノ マ ー 上 の 核 酸 塩 基 の 種 類 に 依 存 し て 環 構 造 の コ ン ポ メ ー シ ョ ン や 核 酸 塩 基 の 配 向 性 が 異 な る こ と を 示 唆 し て い る. 一 方, ア デ ニ ン塩 基 を 持 つ13(AAEP)の み か ら な る12量 体 (AAEP12) に つ い て,DNAと の 二 重 鎖 のTm 値 が 検 討 さ れ,未 修 飾 DNA・DNA 二 重 鎖 よ り も18度 上 昇 す る こ とが わ か っ た44). こ れ は,13の オ リ ゴ マ ー の バ ッ ク ボ ー ン の コ ン ポ メ ー シ ョ ン がDNAと の 安 定 な 二 重 鎖 の 形 成 に 適 応 し て い る こ と を 示 唆 し て い る.
Fig. 6 Structures of conformationally restricted PNA analogues.
Fig. 7 Structures of OPNA, DNG/PNA chimera and PNA/
DNA chimera17,54-58).
2.3 シ ク ロ ヘ キ サ ン 環 の 導 入
Nielsenら は, PNA の バ ッ ク ボ ー ン の ア ミ ノ エ チ ル 部 位 の コ ン ポ メ ー シ ョ ン を シ ク ロ ヘ キ シ ル 環 で 規 制 し た シ ク ロ ヘ キ シ ルPNA(14)を 合 成 し た45).そ し て, PNAlO 量 体 の3カ 所 を14の モ ノ マ ー と置 換 し て, DNA と の ア
ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 の 安 定 性 を 検 討 し た (表3, entry 5‑7).そ の 結 果,( S,S) 一型 の14モ ノ マ ー (Tss )を 導 入
し たPNA3は,(R,R)‑型 の14モ ノ マ ー (TRR) を 導 入 し たPNA4よ り もTm値 が 約18度 上 昇 し た. さ ら に 熱 力 学 的 パ ラ メ ー タ を 検 討 し た 結 果, PNA3 と DNA の 二 重 鎖 形 成 の エ ン ト ロ ピ ー 変 化 量 は, PNA4 の 場 合 よ り も 小 さ く な っ た.こ れ よ り, (S,S) 一型 の14モ ノ マ ー の コ ン ポ メ ー シ ョ ン は, (R,R) 一型 の14モ ノ マ ー の コ ン ポ メ ー シ ョ ン よ り も,DNAと の 二 重 鎖 を 安 定 化 す る 効 果 が 高 い こ と が 示 唆 さ れ た.次 に (S,S) 一型 の14の み か ら な る PNA5 (表3, entry8) と DNA の 二 重 鎖 の Tm 値 を 検 討 し た 結 果, ア ン チ パ ラ レ ル 型 二)重鎖 を 形 成 す る 一 方. パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 の 形 成 は 観 測 さ れ な か っ た. 従 っ て, (S,S) 一型 の14が 連 続 し た オ リ ゴ マ ー の コ ン ポ メ ー シ ョ ン は, DNA と の ア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 に 合 致 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た.し か し な が ら,そ の Tm 値 は 未 修 飾PNA・DNA二 重 鎖 のTm値 よ り14度 低 下 し た こ とか ら,核 酸 塩 基 間 相 互 作 用 な ど が 不 十 分 で 二 重 鎖 が 不 安 定 化 して い る こ と が 示 唆 さ れ た.
2.4 オ レ フ ィ ン を 導 入 し た PNA (OPA)
PNAと 核 酸 の ア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 で は, 核 酸 塩 基 と バ ッ ク ボ ー ン を連 結 す る ア ミ ド構 造 の カ ル ボ ニ ル 基 の 向 きがC末 端 側 に 制 限 さ れ て い る こ と が, NMR やX
線 結 晶 解 析 か ら 明 ら か に さ れ て い る46一49). そ こ で, Leumannら は,こ の ア ミ ド構 造 の コ ン ポ メ ー シ ョ ン に 制 限 を 加 え る た め,オ レ フ ィ ン 構造 に 置 換 し たE一 オ レ
フ ィ ン 型PNA((E)‑OPA)(15)とZ一 オ レ フ ィ ン 型PNA ((Z)‑OPA)(16)を 合 成 し た50,51). PNA の 鎖 中 央1カ 所 に(E)‑OPAモ ノ マ ー を 導 入 し たPNA6は, DNA と の 二 重 鎖 のTm値 が39.9℃ と な り,(Z)‑OPAモ ノ マ ー を 導 入 し たPNA7よ り も 約8度 上 昇 し た(表3,entry9一 10)51).こ れ よ り,(E)‑OPAモ ノ マ ー の コ ン ポ メ ー シ ョ
ン の 一 がPNA・DNAア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 に よ り適 合 す る こ とが 示 唆 さ れ た.し か し な が ら,(E)‑OPAが 連 続 し たPNA8で は,DNA相 補 鎖 と パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 の み を 形 成 し た(表3,entry12).こ れ よ りPNA上 の 核 酸 塩 基 の 立 体 配 座 よ り も,核 酸 塩 基 とバ ッ ク ボ ー ン 間 に あ る ア ミ ド構 造 の カ ル ボ ニ ル 基 の 一 が ア ン チ パ ラ レ ル 一 向 で の 結 合 形 成 に 及 ぼ す 影 響 が 大 き い こ と が 示 唆 さ れ た.
2.5 ピ ロ リ ジ ノ ン PNA, ピ ロ リ ジ ン PNA
Nielsenら は,ピ ロ リ ジ ノ ン環 を 持 つPNA誘 導 体 (ピ ロ リ ジ ノ ンPNA)(17)を 合 成 し た52).PNAの 鎖 中 央1 カ 所 に(3S,5R)一 ピ ロ リ ジ ノ ンPNAの モ ノ マ ー を 導 入 し たPNA9(表3,entry14)は,DNAよ り もRNAと よ り 安 定 な 二 重 鎖 を 形 成 す る こ と がTm値 の 測 定 か ら わ か っ た. こ れ よ り, 17の モ ノ マ ー の コ ン ポ メ ー シ ョ ン がPNA・RNA二)) 重 鎖 の 構 造 に よ り 合 致 す る こ と が 示 唆 さ れ た.し か し な が ら, PNA9 は 未 修 飾 PNA と比 較 し てDNAやRNAに 対 す る Tm 値 が 低 下 し た こ と か ら, こ の 修 飾PNAの コ ン ポ メ ー シ ョ ン は 二 重 鎖 構 造 に 最 適 化 さ れ た も の で は な い こ とが 示 唆 さ れ た(表3,entryl4,
Table 3 Thermal stabilities (Tm [t]) of PNA/DNA duplexes and PNA/RNA duplexes containing conformationally restricted PNA analogues 40, 43, 45, 51, 53)
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16). な お,17の み か ら な る10量 体 の 修 飾 PNA (H‑A*10‑Lys一NH2) はRNA相 補 鎖 とPNA2‑RNAの 特 異 な 三 重 鎖 を 形 成 す る こ とが 見 出 さ れ た.こ れ は,未 修 飾 PNAの 場 合RNAと 二 重 鎖 を 形 成 す る こ と と 異 な る 性 質 で あ る.
Nielsenら は,17の ピ ロ リ ジ ノ ン環 の カ ル ボ ニ ル 基 を 還 元 し た(2R,4S)型 ピ ロ リ ジ ンPNA(18)を 合 成 し て, そ の モ ノ マ ー をPNA鎖 に1カ 所 導 入 した(PNA10, 表 3,entry15)53). そ の 結 果,DNAやRNAと の 二 重 鎖 の 安 定 性 が,17を 導 入 し た 場 合 よ り大 き く低 下 し た(表3, entryl4一15). こ れ よ り,17の ピ ロ リ ジ ノ ン環 の カ ル ボ ニ ル 基 が 核 酸 と の 二 重 鎖 の 安 定 化 に 寄 与 して い る こ と が 示 唆 さ れ る. な お, 18の み か ら な る10量 体 の 修 飾 PNA(H‑A#10‑Lys‑NH2)は DNA 相 補 鎖 と 高 い 安 定 性 を 持 つ 特 異 な DNA2‑PNA 型 の 三 重 鎖 を 形 成 し た. こ れ は, DNA2‑PNA の 組 み 合 わ せ に よ る 三 重 鎖 形 成 の 初 め て の 例 で あ る.
以 上 を 総 括 す る と,12あ る い は13の モ ノ マ ー を PNA鎖 中 に1カ 所 導 入 し た 修 飾PNAが, コ ン ポ メ ー シ ョ ン を 規 制 したPNAと し て, ア ン チ パ ラ レ ル 型 二 重 鎖 の 形 成 を 優 先 さ せ, そ の 二 重 鎖 を 安 定 化 す る の に 効 果 的 で あ る と 言 え る. 一 方, コ ン ポ メ ー シ ョ ン を 規 制 し た 修 飾PNAモ ノ マ ー を オ リ ゴ マ ー 化 す る と, コ ン ポ メ ー シ ョ ン規 制 が 過 剰 に な る 場 合 が 多 く,未 修 飾PNAと 異 な る 結 合 特 性 を 示 す 傾 向 が あ る と言 え る. 今 後, さ ら に 各 種 塩 基 を 含 む 配 列 で 核 酸 相 補 鎖 と の 結 合 性 を 検 討 す る 必 要 が あ る と 思 わ れ る.
3. そ の 他 の PNA 誘 導 体 に よ る PNA の 性 質 の 改 善
PNAに エ ー テ ル 結 合 や 極 性 基 を 導 入 す る こ と に よ り, PNAの 水 溶 性 の 改 善 が 行 わ れ た.ま た, PNA に DNA
を 連 結 し て そ の 性 質 を 付 与 す る こ と に よ り, PNA の 弱 点 を 改 善 す る こ とが 検 討 さ れ た.こ れ ら の PNA 誘 導 体 の 構 造 と性 質 に つ い て 紹 介 す る.
3.1 オ キ シ ペ プ チ ド核 酸 (OPNA)
宍 戸 ら は,0一 ア ミ ノ エ チ ル グ リ コ ー ル 酸 を バ ッ ク ボ ー ン と す る オ キ シ ペ プ チ ド核 酸 (OPNA)(19) (図7) を 合 成 し た54・55).OPNAは,PNAと 異 な りバ ッ ク ボ ー ン に エ ー テ ル 結 合 を 含 む.そ の た め,OPNAの 水 溶 性 は PNAよ り約2倍 に 増 加 し た55).ま た,OPNA・DNA二
重 鎖 は,PNA・DNA二 重 鎖 やDNA・DNA二 重 鎖 の 場 台 よ り も狭 い 温 度 範 囲 で 解 離 す る 性 質 を 持 つ こ と が 見 出 さ れ た54,55).こ れ は, OPNA が,完 全 相 補 鎖 と 結 合 し, 一塩 基 ミ ス マ ッ チ 塩 基 を 含 む 相 補 鎖 と結 合 し な い 温 度 条 件 を 設 定 可 能 な 塩 基 配 列 特 異 性 を 持 つ こ と を 示 唆 して い る54).
3.2 PNA一 グ ア ニ ジ ン 型 DNA (DNG) キ メ ラ オ リ ゴ マ ー
Bruiceら は,PNAの 鎖 中 に,糖,核 酸 塩 基,そ し て グ ア ニ ジ ニ ウ ム 基 か ら な る グ ア ニ ジ ン 型 DNA (DNG) モ ノ マ ー を 導 入 し たDNG/PNAキ メ ラ オ リ ゴ マ ー (20) を 合 成 し た56). チ ミ ンPNA10量 体 の 両 末 端 を DNG に 変 換 す る と,DNA相 補 鎖 と の 三 重 鎖 形 成 速 度 が 増 加 す る こ と が 見 出 さ れ た.ま た, こ の 修 飾PNAは, DNA 二 重 鎖 に 対 し て 鎖 侵 入 型 三 重 鎖 を 形 成 し, そ の 結 合 速 度 が 未 修 飾PNAの 場 合 よ り増 加 す る こ と が わ か っ た. こ れ は,PNAに 導 入 し た グ ア ニ ジ ニ ウ ム 基 の 正 電 荷 と DNA の 静 電 的 相 互 作 用 に よ り, PNA と DNA と の 三 重 鎖 形 成 が 促 進 さ れ た と考 え ら れ る.
3.3 PNA / DNA キ メ ラ オ リ ゴ マ ー
PNAにDNAオ リ ゴ マ ー を 連 結 し た PNA/DNA キ メ ラ オ リ ゴ マ ー(21)が 合 成 さ れ, PNAの 弱 点 の 改 善 が 検 討 さ れ た17,57). DNA/PNA キ メ ラ オ リ ゴ マ ー と核 酸 の 二 重 鎖 の 結 合 一 向 性 は,パ ラ レ ル 型 よ り も ア ン チ パ ラ レ ル 型 の 一 が 著 し く安 定 化 し た.ま た, DNA/PNA キ メ ラ オ リ ゴ マ ー は,DNAの 場 合 と 同 程 度 に 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る こ と が わ か っ た.さ ら に, DNA/PNA キ メ ラ オ リ ゴ マ ー に よ るmRNAの 機 能 阻 害 作 用 が, RNaseH の 添 加 に よ っ て 著 し く促 進 さ れ る こ とが 見 出 さ れ た58).
こ れ は,PNAに 連 結 したDNA部 分 で, RNaseH に よ る RNA切 断 機 能 が 働 い た こ と を 示 唆 し て い る.
以 上 を ま と め る と,(1)PNAの 水 溶 性 は,エ ー テ ル 結 合 や 極 性 基 を 導 入 す る と 改 善 さ れ る こ と, (2) PNA
とDNAの 結 合 速 度 は, PNA に 正 電 荷 を 持 つ 構 造 を 導 入 す る と増 加 す る こ と,(3)PNAにDNAを 連 結 す る と 種 々 のPNAの 弱 点 を 補 え る こ と,が 示 さ れ た.
4. PNA に よ る 遺 伝 子 制 御 と 遺 伝 子 検 出
PNAを,遺 伝 子 制 御 物 質 と し て, あ る い は, 遺 伝 子 検 出 プ ロ ー ブ と し て 応 用 した 研 究 例 に つ い て 紹 介 す る.
4.1 PNA に よ る mRNA の 機 能 制 御
4.1. 1 PNA に よ る mRNA の 機 能 制 御 の メ カ ニ ズ ム PNAは,mRNAと 二 重 鎖 お よ び 三 重 鎖 を 形 成 し て, そ のmRNAの 翻 訳 機 能 を 抑 制 す る と 考 え ら れ て い る
(図8)38).具 体 的 に は, (1) PNAがmRNAの 開 始 コ ド ン付 近 に 結 合 し て,リ ボ ソ ー ム のmRNA上 へ の 結 合 を 阻 害 し,翻 訳 開 始 を 抑 制 す る 機 構 (図8(a)), (2) PNA がmRNA上 の 翻 訳 領 域 に 結 合 し て, リ ボ ソ ー ム の 移 動
を 阻 害 し,翻 訳 を 中 断 す る 機 構 (図8(b)), が 提 唱 さ れ て い る38). PNAがmRNAと 三 重 鎖 を形 成 す る た め の 標 的 部 位 は,プ リ ン塩 基 が 連 続 し た 領 域 に 限 られ る. こ の プ リ ン塩 基 領 域 が6塩 基 長 と短 い 場 合 で も, 三 重 鎖 と 二 重 鎖 の 形 成 が 同 時 に 可 能 な ク ラ ン プ PNA(22) (図8
(b))を 用 い る と, 翻 訳 阻 害 で きる こ とが 報 告 され て い る38).三 重 鎖 形 成 に よるmRNAの 機 能 阻害 は,PNA特 有 の 性 質 と言 え る.
(a) Blockage of assembly of ribosome
(b) Arrest of translation elongation
4.1.2 PNA の 細 胞 内 導 入
PNAは 大 腸 菌 に 取 り込 ま れ に く い が59), 細 胞 壁 透 過 性 の 正 電 荷 を帯 び た ペ プ チ ド [(Lys‑Phe‑Phe)3Lys]60) を PNAに 連 結 す る と (23) (図9), 大 腸 菌 へ の 取 り込 み が 改 善 さ れ る こ と が 報 告 さ れ た61).さ ら に,23を 用 い て β一ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ 遺 伝 子 のmRNAの 発 現 抑 制 が 検 討 さ れ た 結 果,未 修 飾PNAよ り も 約20倍 発 現 阻 害 効 果 が 高 い こ とが 見 出 さ れ た.
PNAの 真 核 細 胞 へ の 取 り込 み の 改 善 に も, 細 胞 膜 透 過 性 ペ プ チ ドのtransportan(24)62)やpAntp (25)63) が 用 い ら れ た64).こ れ ら の ペ プ チ ドは, 正 電 荷 を 持 つ ア ミ ノ 酸 側 鎖 が 複 数 あ り,細 胞 膜 上 の 負 電 荷 と静 電 的 相 互 作 用 が 可 能 で あ る.こ れ ら の ペ プ チ ド とPNAを ジ ス ル フ ィ
ド結 合 で 連 結 した 誘 導 体(26,27)(図9)を 用 い て,PNA の 細 胞 内 導 入 と神 経 ペ プ チ ド(galanin)レ セ プ タ ー の mRNAの 発 現 抑 制 が 検 討 さ れ た 結 果,未 修 飾PNAよ り 極 め て 低 濃 度 でmRNAの 発 現 を抑 制 す る こ と が 見 出 さ れ た. こ れ よ り,PNAに 細 胞 膜 透 過 性 ペ プ チ ドを 連 結
す る と,PNAの 細 胞 内 導 入 と遺 伝 子 制 御 の 効 率 の 改 善 に 有 効 で あ る こ とが 示 さ れ た.
4.1.3 PNA に よ るmRNAタ ン パ ク 質 相 互 作 用 の 阻 害 ヒ ト免 疫 不 全 症 ウ イ ル ス (HIV) に 感 染 し た 細 胞 で は, ウ イ ル スmRNAの 転 写 が,そ のmRNAの 先 端 部 分 の ヘ ア ピ ン構 造(TARRNA)と ウ イ ル ス タ ンパ ク 質Tatの 複 合 体 に よ り促 進 さ れ て い る(図10,ル ー トA). こ こ で, TAR RNA と そ れ に 相 補 的 なPNAを 結 合 さ せ る と, TAR RNA と Tat の 複 合 体 形 成 が 抑 制 さ れ る こ とが 見 出 さ れ た(図10,ル ー トB)65). さ ら に, こ の PNA と膜 透 過 性 ペ プ チ ド (tansportan) の 連 結 体 を用 い る と, HIV 感 染 細 胞 に お け る HIV の 増 殖 を 抑 制 で き る こ と が 明 ら か に さ れ た66). こ れ ら の 結 果 は, PNA が RNA 一タ ン パ ク 質 相 互 作 用 の 阻 害 に有 効 で あ る こ と を 示 唆 し て い る.
4.1.4 PNA に よ る RNA タン パ ク質 複 合 体 の機 能 阻 害 ガ ン細 胞 で は,テ ロ メ ラー ゼ とい うRNA含 有 タ ンパ ク質 に よっ て,遺 伝 子 末 端 の テ ロ メ ア とい う特 定 塩基 配 列 の繰 り返 し部 位 の 欠 落 を修 復 す る機 構 が 活発 に働 い て い る(図11(a)). そ して,こ の テ ロ メ ア の修 復 が, ガ ン 細 胞 の異 常 増 殖 に関 与 してい る と考 え られ て い る. テ ロ メ ラー ゼ 内 のRNA成 分 (テ ロ メ ラ ー ゼRNA)は, 遺 伝 子 の テ ロ メ ア領 域 に結 合 して, そ れ を修 復 す る鋳 型 と し て機 能 す る (図11(a))67). この テ ロ メ ラー ゼRNAに 相 補 的 なPNAは, テ ロ メ ラ ー ゼRNAと 結 合 して, テ ロ メ アの 修 復 を抑 制 す る こ とが 報 告 され た68). さ らに, ガ ン細 胞 へ の PNA の 導 入 に, PNA・DNA二 重 鎖 と カ チ オ ン性 脂 質 (リ ポ フ ェ ク トア ミ ン) の複 合 体 が 用 い られ た (図11(b))69). こ の複 合 体 か らの PNA の遊 離 は,細 胞 内 でDNA相 補 鎖 が 核 酸 分 解 酵 素 に よ り分 解 され る こ と に よ り起 こ る. こ の PNA 複 合 体 に よ り PNA の細 胞 内 取 り込 み が 改 善 され, ガ ン細 胞 の増 殖 が顕 著 に抑 制 さ れ た と報 告 され た.以 上 よ り, PNAは, RNA 含 有 タ ンパ ク質 の 機 能 制御 に も有 効 で あ る こ とが示 唆 さ れ た.
Fig. 8 Inhibition of translation of mRNA by PNA.
Fig. 9 Cellular transporter peptides and peptide-PNA constructs61-64).
Fig. 10 Efficient transcription of HIV DNA by TAR RNA-Tat interaction (route A) and inhibition of the transcrip- tion by anti-TAR PNA (route B)65).
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( 42 ) 有機合成化学協会誌
(a)
(b)
4.2 DNA を 標 的 と し た PNA の 生 理 活 性
PNA を細 胞 核 内 のDNA二 重 鎖 に 鎖 侵 入 的 に 結 合 (ト ラ ン ス イ ン ベ ー ジ ョ ン)さ せ, DNA の 転 写 を 抑 制 す る 一 法 が 検 討 さ れ た(図12)70). ま ず, PNA の 核 内 導 入 を 促 進 す る た め,PNAに 核 移 行 シ グ ナ ル ペ プ チ ド(Pro‑Lys‑
Lys‑Lys‑Arg‑Lys一Val)が 連 結 さ れ た. こ の ペ プ チ ド は, トラ ン ス ポ ー チ ン と い う タ ン パ ク 質 と結 合 し て,核 内 へ 輸 送 さ れ る 性 質 が あ る. c‑myc ガ ン 遺 伝 子 に 相 補 的 な PNA (TCAACGTTAGCTTCACC) と核 移 行 シ グ ナ ル ペ プ
チ ドの 連 結 体 を用 い る と,核 内 のPNA量 が 増 加 し, c一myc 遺 伝 子 の 転 写 が 抑 制 さ れ た.こ れ よ り, DNA の 転 写 活 性 化 部 位 はPNAに よ りス トラ ン ドイ ンベ ー ジ ョ
ン され や す く,通 常 の プ リ ン一 基 とピ リ ミジ ン塩 基 の 混 合 配 列 のPNAに よ っ て も,DNA二 重 鎖 に対 す る侵 入 型PNA・DNA二 重 鎖 の 形 成 が 可 能 で あ る こ とが 示 唆 さ れ た.
4.3 PNA に よ る遺伝 子 の検 出
標 的 遺伝 子 の存 在 を簡 便 に検 出す る一 法 の開 発 は, 遺 伝 子 診 断 や 遺伝 子 機 能 解 析 に お い て有 用 で あ る. 標 的 遺 伝 子 を均 一 溶 液 中 で 検 出 す る一 法 の1つ に, モ レキ ュ
(a)
(b)
(c)
ラ ー ビ ー コ ン71)とい う 蛍 光 標 識DNAプ ロ ー ブ を 用 い る 一 法 が あ る. こ のDNAプ ロ ー ブ は,蛍 光 剤 と消 光 剤 を 併 せ 持 ち, こ れ ら が 近 接 して 蛍 光 消 光 状 態 に あ る(図13
(a)). こ の プ ロ ー ブ がDNA相 補 鎖 と二 重 鎖 を 形 成 す る と, 蛍 光 剤 と消 光 剤 の 距 離 が 離 れ て 蛍 光 発 光 が 生 じ, 結 合 し たDNA相 補 鎖 の 存 在 を 検 出 で き る(図13(b)). PNA
は,核 酸 分 解 酵 素 耐 性 に 優 れ,相 補 鎖 と 安 定 な 二 重 鎖 を 形 成 す る た め, ヘ ア ピ ン 構 造 (28)72) や 非 ヘ ア ピ ン 構 造
(29)(図13(a))73‑75)の PNA モ レ キ ュ ラ ー ビ ー コ ン が 開 発 さ れ た.PNAモ レ キ ュ ラ ー ビ ー コ ン の 特 徴 は,低 塩 濃 度 の 条 件 下 で も 標 的 DNA と 速 や か に 結 合 す る こ と で あ る75). こ れ は, PNA の バ ッ ク ボ ー ン構 造 が 無 電 荷 で あ る た め, PNA モ レ キ ュ ラ ー ビ ー コ ン の 二 次 構 造 や DNAと の 二 重 鎖 形 成 能 が 一 濃 度 の 影 響 を 受 け に く い こ と に 起 因 して い る. ま た, 標 的DNAが 二 重 鎖 の 場 合 で も, ビ ス PNA を利 用 し て DNA 二 重 鎖 を 解 離 さ せ, PNA モ レ キ ュ ラ ー ビ ー コ ン に よ り検 出 で き る こ と が 報 告 さ れ た (図13(c))74,75). し か し な が ら, ビ ス PNA の 結 合 部 位 は ポ リ プ リ ン配 列 に 限 ら れ る た め, そ の 適 用 範 囲 は 制
限 さ れ る.
低 分 子 化 合 物 と タ ン パ ク 質 と の 相 互 作 用 をPNAと DNA の 二 重 鎖 形 成 を利 用 し て 蛍 光 検 出 す る 一 法 が 報 告 Fig. 11 (a) Extension of telomere DNA by telomerase and inhibition of the extention by PNA67'68).
(b) PNA- DNA-cationic lipid complex69).
Fig. 12 Nuclear transport of peptide-PNA construct and the strand invasion to c-myc DNA70).
Fig. 13 (a) Schematics of molecular beacon72-75). (b) Schematic representation of the detection of DNA by molecular beacon. (c) Schematic representation of hybridization of bis-PNAs to DNA duplex, followed by the detection of the DNA by molecular beacon74' 75).
され た76).Schultsら は, タ ンパ ク質 阻害 剤 で あ る ペ プ チ ドにPNAと フル オ レセ イ ンを連 結 した 誘 導 体(30)を 合 成 し た(図14).次 に,こ の誘 導 体 ど タ ンパ ク質 を混 合 して,生 成 した タ ンパ ク質 一阻害 剤 一PNA一 フ ル オ レセ イ ン複 合 体(31)を, 排 除 ク ロマ トグ ラ フ ィー に よ って精 製 後,基 板 上 に固 定 化 したDNAに 作 用 させ た.そ の結 果,31はDNA相 補 鎖 と結 合 して,基 板 上 の特 定位 置 で 蛍 光 発 光 を示 した.阻 害 剤 の 種 類 とPNAの 塩 基 配 列 を 1対1対 応 させ る と,複 数 の タ ンパ ク質 一阻 害 剤 相 互 作 用 を,DNAを 固 定 した基 板 上 で 一 挙 に 蛍 光 検 出 す る こ
とが 可 能 で あ る.遺 伝 子 か ら発 現 され る 多種 類 の タ ンパ ク質 を解 析 す る一 法 と して 応 用 が期 待 され る.
お わ り に
PNA の 重 要 な 特 徴 は,標 的 核 酸 と安 定 な 二 重 鎖 お よ び三 重 鎖 を形 成 し,か つ,生 体 内環 境 下 で極 め て高 い分 解 耐 性 を示 す こ とで あ る. そ して,PNAの 化 学 修 飾 に よ って,一 基 配 列特 異 的 結合 性,水 溶 性,細 胞 膜 透 過 性 な どが 向 上 す る こ とが様 々 な研 究 に よ り示 され た. さ ら に,修 飾 PNA の細 胞 内へ の積 極 的 導 入 に よ り, PNA が 遺 伝 子 制 御 や タ ンパ ク 質一核 酸 相 互 作 用 の制 御 に有 効 で あ る こ とが 明 らか に され た.近 年 は, PNA と核 酸 の 安 定 な結 合性 を利 用 して,新 規 な機 能 性 物 質 を創 成 す る研 究76,77) が 活 発 化 して お り, PNA の 応 用 研 究 は今 後 も広
く展 開 され る と期 待 され る.
(2002 年 7 月 8 日受 理)
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PROFILE
岩 瀬 礼 子 京 都 工 芸 繊 維 大 学 繊 維 学 部 ・助 手
〔経 歴 〕 1984 年 東 京 理 科 大 学 理 学 部 化 学 科 卒 業, 1989 年 東 京 工 業 大 学 大 学 院 総 合 理 工 学 研 究 科 生 命 化 学 専 攻 博 士 課 程 修 了(理 学 博 士), 同年 ヘ キ ス トジ ャパ ン(株)創 薬 研 究 所 研 究 員, 1996 年 よ り現 職.〔 専 門 〕 核 酸 化 学.
〔連 絡 先 〕 e‑mail:
村上 章 京 都 工 芸 繊 維 大 学 繊 維 学 部 ・教 授
〔経 歴 〕 1973 年 京 都 大学 工 学 部 石 油 化 学 科 卒 業, 1988 年 京 都 工 芸 繊 維 大 学 助 教 授, 1993 年 京 都 工 芸 繊 維 大 学 教 授 〔専 門 〕 核 酸 化 学.
〔連 絡 先 〕
