第22巻第4号平成6年12月

       内     容 原  著

  長崎県下の1名のC型肝炎（HCV）患者血清中のHCVウイルス遺伝子型別及びE1とE2／NSI糖蛋   白質領域の遺伝子解析（英文）

      ・・鄭 薇 埼一………・………一………・…………・169−177   エクアドル共和国におけるらいの血清疫学的調査（英文）

      ・・細川  篤，野中 薫雄，Miguel H．Jurado，

      古川 正人，江下 優樹，三森 龍之，片倉  健       EduardoA．Gomez，和泉 眞蔵，橋口 義久…… 17H84   マラリア予防薬としてメフロキンを長期投与した際の副作用について

      ・・竹島 茂人…・………・・…・………・…・……… 185−192   日本における輸血マラリア

    ー血小板輸血により感染したと考えられる熱帯熱マラリア1症例を中心に一

      ・狩野 繁之，鈴木  守・…………・……・……… 193−198   長崎市の南部と北部における犬糸状虫伝搬蚊の個体数と自然感染率の比較（英文）

      ・小田  力，末永  敏，在津  誠，黒川 憲次，

      藤田紘一一郎，小川 保徳，山崎 一郎，飯田 国洋，

      三根真理子………一一…………・………… 199−206   ソロモン諸島で見いだされたムナケブユ亜属1新種の記載（英文）

      ・高岡 宏行，鈴木  博………・………・………・207−210 研究ノート

  タンザニアの免疫血清による熱帯熱マラリア原虫の試験管内増殖阻害（英文）

       一Thomas B．Nyambo，神原 廣二 …・………・……・211−215        （裏面に続く）

短  報

  インドネシア在住日本人の寄生虫感染状況（英文）

      ・山田 誠一，森 有加，藩       月館説子，藤田紘一郎…

悦，赤尾 信明，

217−218

症例報告

  エクアドル共和国におけるらいの2例の提示と接触者検診の試み（英文）

       一細川  篤，野中 薫雄，Juan J．Alava P，

      Eduardo A．Gometz L．，Hugo M．Jurado S．，

      橋口 義久…一 ^219−223

日本熱帯医学会雑誌

第22巻第4号 1994年12月15日 印刷 1994年12月15日 発行

発行所 日本熱帯医学会

編集者  神  原  廣  二

印刷所㈱昭和堂印刷

  諌早市長野町1007−2 （⑰854）

         奮0957−22−6000 本雑誌の刊行にあたりその費用の一部を文部省科学研究費補助金

（研究成果公開促進費）によった。

GENOTYPE IDENTIFICATION OF HEPATITIS  C VIRUS (HCV) ISOLATED FROM A SlNGLE  JAPANESE CARRIER IN NAGASAKI PREFECTURE 

AND GENOME ANALYSIS OF E1 AND E2/NS1  ENVELOPE GLYCOPROTEIN REGIONS 

WEI‑YUN ZHENG 

Received September 20, 1994/Accepted October 30, 1994 

Abstract: The nucleotide (nt) sequence of a Hepatitis C virus genome (HCV‑N) which was derived from  a single Japanese patient's serum in Nagasaki Prefecture has been determined by multiple clones coverning  22 overlapping regions of the HCV geneme. The sequenced region consisted of 9295 nt, including 248 nt of  5'‑untranslated region (UTR) , a single large open reading frame (ORF) encoding a polyprotein of 3010  amino acids (aa) and a 17 nt of 3'‑UTR. Phylogenetic analysis indicated that HCV‑N belongs to II/1b  genotype of group 1. Two other Nagasaki HCV strains (HCV‑Nl and HCV‑N2) were also sequenced in  the E1 and N‑terminus of the E2/NSI regions. Two hypervariable regions (HVR I and HVR 2) were found  in the N‑terminus of E2/NSI region among 3 Nagasaki strains and 7 other HCV strains with published  sequences. Two well‑conserved aa sequences were also identified among 10 HCV strains in the E1 and N 

‑terminus of the E2/NS1 regions. The results will be useful for future underStanding on the pathogenesis,  virological diagnosis and development of vaccine for HCV. 

INTRODUCTION 

Hepatitis C virus (HCV) is the major cause of nonA 

‑nonB (NANB) hepatitis, and chronic infection with  HCV has been linked to the development of liver cirrho‑

sis and hepatocellular carcinoma (Plagemann, 1991). 

Many entire and partial HCV sequence informations  published so far have shown that HCV genome consisted  of about 10 Kb single‑stranded positive‑sense RNA with  5'UTR, a single long ORF foll'dtved by 3'UTR. The viral  genome organization re embles that of the flaviviruses  and pestiviruses (Kato et al., 1990; Plagemann, 1991). 

Since Choo et al. (1989) cloned the genome of an  RNA virus from the plasma of a chimpanzee inoculated  with plasma fyom patient with NANB hepatitis and  designated it as HCV, entire sequences have been report‑

ed for at least 15 HCV strains. There are: HCV‑J (Kato  et al., 1990), HCV‑1 (Choo et al.. 1991), HCV‑H (In‑

chauspe et al.. 1991), HCV‑BK (Takamizawa et al.,  1991), HC‑J6 (Okamoto et al., 1991), HC‑JI (Okamoto  et al., 1992a), HC‑J8 (Okamoto et al., 1992b), HC‑J4/ 

83, HC‑J4/91 (Okamoto et al., 1992c), HCV‑JT (Tana‑

ka et al.. 1992), HCV‑T (Chen et al.. 1992), HCV‑JKl  (Honda et al.. 1993) , HC‑C2 (Wang et al.. 1993) , HC‑G9  (Okamoto et al., 1994) and NZLI (Sakamoto et al.. 

1994) . Depending on the HCV sequence similarity, HCV  genome can be classified into 6 genotypes: I, II, 111, IV,  V and VI as reviewed by Sakamoto et al. (1994) , or into  6 major genotypes: I (a, b, c) , 2 (a, b, c), 3 (a, b), 4, 5 and  6 (Simmonds et al.. 1933b). 

Recently, the newest classification has been sum‑

marized by Sakamoto et al. (1994) who classified HCV  genome into 3 major groups with entire published  sequences. The entire HCV sequence of Japanese  strains have been assigned either to group I (1/1a  genotype: HC‑J1; II/1b genotype: HCV‑J, HCV‑BK, HC 

‑J4/83, HC‑J4/91, HCV‑JT and HCV‑JK1) or group 2  (III/2a genotype: HC‑J6; IV/2b genotype: HC‑J8)  according to Sakamoto et al. (1994). In order to know  whether there is particular HCV in the local area of  Nagasakj, Japan, HCV patient serum which came frorn  Nagasaki Prefecture was obtained and the genome  sequence of the HCV‑N in this serum was determined  by multiple overlapping clones. 

Department of Virology, Institute of Tropical Medicine, Nagasaki University, Nagasaki 852, Japan 

170 

In order to see the genetic variability of HCV in the  N gasaki area, HCV genome sequence in 2 more HCV  patient sera in Nagasaki Prefecture (HCV‑N1 and  HCV‑N2) were also analyzed similarly in the E1 and N 

‑terminus of the E2/NSI envelope glycoprotein regions. 

Two hypervariable regions have be found among these 3  Nagasaki HCV strains using the sequence diversity  comparison with published sequence data of 7 HCV 

strains. 

MATERIALS AND METHODS 

RNA extraction from HCV patient serum 

Serum samples were obtained from NANB patients  in Nagasaki Prefecture which were kindly provided by  the Second Department of Internal Medicine of Nagasa‑

ki University Hospital. These patients were confirmed  to be infected with HCV by anti‑CIOO HCV ELISA Kit  (Ortho Diagnostic Systems, Tokyo, Japan) and HCV  reverse‑transcription polymerase chain reaction (RT 

‑PCR) as published by Kurihara (1992). One hundred  microliters of HCV patient serum was mixed with 20 pl  of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 80 pl of  sterile distilled H.O at room temperature for 5 min. 

HCV RNA was extracted with phenol / chloroform and  precipitated with 3 volumes of ice‑cold absolute ethanol. 

After storage at ‑80'C for lhr, HCV RNA was pelleted  in an Eppendolf centrifuge with 15,000xg at 4'C for 30  min. The pellet was washed once in 70% ethanol,  vacuurn dried and dissolved in 100 pl sterile distilled  water. RNA solution was stored at ‑80'C. 

Selection and synthesis of oligonucleotide primers  Oligonucleotide primer sequences were selected  based on the published sequence data (Choo et al., 1991,  Takamizawa et al.. 1991) and gene walking method. 

Oligonucleotide primers were synthesized by Applied  Biosystems Model 392 DNA / RNA Synthesizer and  confirmed for their purity by ion‑exchange gel  chromatography (Gen‑pack; Waters) . 

RT‑PCR 

Ten. microliters of RNA solution were added with  90 pl of RT‑PCR mixture [100 pmol of each primers, 0.2  mM deoxynucleoside triphosphate, 10 mM Tris (PH 8. 

9) , 1.5 mM MgC1,, 80 mM KC1, 0.5 mg of bovine serum  albumin per ml, 0.1% sodium cholate, 0.1% Triton X 

‑lOO, 10 U of reverse transcriptase (Life Science Inc.)  and 2U of Tth DNA polyrnerase, a thermostable DNA  polymerase (Toyobo Co.)]. The reaction mixture was  covered by 2 drops of mineral oil and incubated for 10  min at 53'C for RT. PCR amplification (94'C for 60 sec,  53'C for 90 sec and 72'C for 120 sec by thermal cycler; 

lwaki Co.) was started irnmediately after RT and  repeated 35 times. CDNA product was subjected to  agarose gel electrophoresis and visualized by ethidium  bromide staining. 

Cloning and sequencing of HCV CDNA product  The amplified HCV CDNA was excised from agar‑

ose gel, phosphorylated with T4 polynucleotide kinase  (Nippon Gene Co.) and blunted with T4 DNA polymer‑

ase (Takara Co.). The modified CDNA fragment was  ligated into Smal site of pUC19 and transformed into  Escherichia 'coli JM 109 strain. The recombinant pUC19  carrying inserted CDNA fragment was purified with  WizardTM Minipreps DNA Purification System (U.S. 

A.). The CDNA fragment sequence was determined in  both directions with sense and antisense primers by  dideoxy chain termination method using both 35S radio‑

isotope‑labeling (DNA Sequencing Kit Version 2.0, U.S. 

A.) and fluorescent dye‑labeled DNA sequencing system  (373A DNA Sequencer, Applied Biosystems) . To avoid  sequence variabili,ty, 3 colones from each RT‑PCR  product were isolated independently for nucleotide  sequence determination. 

Analysis and homology comparison in nucleotide  and deduced amino acid sequences were carried out for  HCV‑N and 7 other HCV strains with published entire  sequence, using a computer system with DNASIS Mac  Version 2.2, NEW CD2 system (Hitachi Software Engi‑

neering Co., Ltd, 1992). 

RESULTS 

The genome characterization of HCV‑N 

Multiple cDNA clones were isolated from alto‑

gether 22 overlapping regions which covered almost  entire genome of HCV‑N, except extreme 5' and 3'  terminals (Fig. 1). For each of the overlapping region,  3 independent CDNA clones were isolated from the RT 

‑PCR product and sequenced. The cleavage site of the  polyprotein coded by the ORF of the HCV‑N genome  was assigned according to the publications by Okamoto  et al. (1992b) and Honda et al. (1993). Total length of  the sequenced region of HCV‑N consisted of 9295 nt and  3010 aa, respectively (Fig. 2) . The sequenced region can  be divided into 248 nt in the 5'UTR, 9030 nt in a single  ORF and 17 nt in the 3'UTR, respectvely. The ORF was  considered to be translated into C (191 aa) , E1 (192 aa) ,  E2/NSI (346 aa), NS2 (277 aa), NS3 (609 aa) , NS4 (398  aa) and NS5 (997 aa) proteins. 

Genotype classification and genome homology compari‑

son among HCV‑N and 7 other HCV strains with 

published sequences 

1 ooo  2000 3000  4000 5000 6000 7000 8000  ^{gooo  bp} 

C E1 E2/NSI NS2  ^{NS3  NS4  NS5} 

L ] DD 

D D 

IEl] 

:  li] ll 

 Iii ]  Ill  i] 

Figure I Physical map of the HCV genome and locations of the  CDNA clones derived from HCV‑N strain. Nucleotides are  numbered from putative 5'end as indicated on the top. The  genome organization of HCV is according to Okamoto et  al. (1994) , showing coding region from structural proteins: 

core (O , envevop (EI and E2) to nonstructural proteins  (NS1‑NS5) by blocks, untranslated region (UTR) (5' and  3') by bars. The order of clone number is based on the  cloning process. 

Entire sequence informations have been published  for the following 7 HCV strains: HCV‑1 (Choo et al.,  1991), HCV‑BK (Takamizawa et al.. 1991), HCV‑J 

(Kato et al.. 1990), HC‑J6 (Okamoto et al.. 

1991), HC‑J8 (Okamoto et al.. 1992b), HCV 

‑JT (Tanaka et al.. 1992) arid HCV‑T (Chen  et al.. 1992). Homology comparison between  HCV‑N and these 7 HCV strains was shown  in Table 1.' The most conserved region is the  5 UTR which showed nt homology more than  91.5% among 8 HCV isolates. The sequence  homology of the C protein region was also  highly conserved (nt > 81.1%, aa > 88.5%). 

In the putative E1 and E2/NSI regions, the 

HCV‑N showed high homology with HCV 

‑BK, HCV‑J, HCV‑JT and HCV‑T (nt > 84. 

5%, aa > 85.8%). Whereas HCV‑N showed  low homology with HC‑J6 and HC‑J8 (nt < 

68.8%, aa < 72.3%). Nt sequence homology  between HCV‑N and HCV‑1 in the E1 and  E2/NSI regions was 73.7%, 74.5% and aa  sequence homology was 76.0%, 81.2%, respec‑

tively. From NS2 to NS5 regions, it was  evident that HCV‑N is closer to HCV‑BK, 

HCV‑J, HCV‑JT and HCV‑T and remote 

frorn HC‑J6 and HC‑J8, while HCV‑1 seems  to be located intermediate. The total  sequence homology comparison among 8 

HCV isolates gave us a conclusion that HCV‑N belongs 

to HCV‑BK/HCV‑J/HCV‑JT/HCV‑T genotype. In 

contrast, HCV‑N is remote from J6 and J8 genotypes,  Table 1  Homology comparison of,nucleotide and deduced amino acid sequence among 8 

HCV strains (HCV‑N, HCV‑1, HCV‑BK, HCV‑J, HCV‑JT, HCV‑T, HC‑J6 and  HC‑J8). The homology is indicated by %. The nucleotide sequence homology is  shown in upper and arnino acid sequence homology is shown in lowbr with  parenthesis, respectively. 

Region 

HCV‑N *& 

HCV‑1 

HCV‑N & 

HCV‑BK 

HCV‑N & 

HCV‑ J 

HCV‑N & 

HC‑ J6 

HCV‑N & 

HC‑ J8 

HCV‑N & 

HCV‑ JT 

HCV‑N & 

HCV‑T 

Total  _(84 . 5) ^77 . 9  _(94 . 1) ^92 . O  _(93 . 7) ^91 . 5  _(70 . 7) ^62 . 4  _(69 . 2) ^61 . 7  _(93 . 9) ^91 . 7  _(92 . 1) ^90 . O 

5'UTR  ^{8 . 8  ' 9  '  98 . 4  94 . o  91 . 5  99 . 2  99 . 2}  C  (96 . 3) ^90 . 7 

96 . o  (97 . 4) 

95 . 8  (97 . 9) 

83 . O  (90 . 1) 

81 . 1  (88 . 5) 

95 . 1  (96 . 3) 

93 . 9  (93 . 7) 

E1  _(76 . o) ^73 . 7  _(89 . 6) ^89 . o  _(93 . 2) ^91 . 7  _(52 . 9) ^60 . 1  _(51 . 8) ^56 . 7  _(92 . 2) ^92 . 2  _(93 . 8) ^91 . 1  E2/NS1  _(81 . 2) ^74 . 5  _(88 . 1) ^{8 +* 7}  _(86 . 1) ^84 . 5  _(71 . 1) ^68 . 8  _(72 . 3) ^66 . 8  (85 . 8) ^84 . 7 

85 . 3  (87 . o) 

NS2  (74 . 4) ^71.0 

92 . 1  (91 . 7) 

"'‑*,･ g2 . 7  (94 . 9) 

59 . 8  (58 . 7) 

58 . 2  (56 . 2) 

89 . o  (92 . 4) 

87 . 8  (91 . 3) 

NS3  (89 . O) ^78 . 1 

90 . 7 

(93.4) 

90 . 4  (91 . 8) 

69 . 9  (79 . 3) 

69 . 8  (78 . 8) 

91 . 1  (94 . 9) 

89 . 4  (92 . 8) 

NS4  (88 . 2) ^78 . 9 

93 . 1  (97 . 5) 

92 . 7  (97 . 2) 

66 . 8  (74 . 1) 

67 . o  (72 . 9) 

93 . 5  (97 . o) 

89 . 9  (94 , o) 

NS5  (83 . 7) ^78 . 8 

93 . 5  (96 . 3) 

92 . 7  (95 . 2) 

59 . 5  (71 . 8) 

59 . 2  (71 . 5) 

93 . 1  (95 . 2) 

91 .8  (92 . 5) 

61 「、1瞭㎜1℃κrA1m1て器1rκハハm1．肖1監A一1叉−A｛「Cハ凱｛互℃｛W、紺ハ｛「，1U『

38F L A R L 工 W W 1， Q Y F I T R A E A 旺 し

1一一TG㏄A鳳一

8QV回VPPLNVRGG臓DA工ILLT

601

201

蝋㎜oo…一臨

㎜7踏A〔：CCO〔コ℃

一

11a1

〔X灯Im贈A眠㎜AA1℃旧C《C搾1℃AC℃ハハAα噛1℃『mlU罵＝｛τATハ（『1、U＝

CVVHPEしISDITkしLVAILG

01耀㎜㎜一一一蹴㎜躍附1W㎜隅㏄

941㎜一瓢一一A欄GC3000

B98PL撹VLOACI^{SRLP￥FV PAOG  918}

001¶℃A㎜A眠A㎜一CA質ATσ固℃MA皿σr 3060

918L：RACMLVRKVAGG開YVOMA  93e

01ハハハα一一一CCCG一漁C   C

一一蝋一…㎜

  随ST胴PKPORKTKR国TYR

−Qザ

061轍        CσE㎜MG鳩CA「鷹＿G

938FMKL轟ALTGTYVYDHLTPLQ

121 AココXコ3CCハOG門，（コロOGgCCコ1恥CGハ鵡ロコE＝7コ0σ（三X｝1ロ昭X：ムGT−

958DWPRAGLRDLAVAV日PVVFS

08  0863  2﹃一

GC【一熈（一一AC㎜nPODVXFPGGGOIVGGVYLL

1801

PRRGPRLCVRAT貰KTSERSQ

1863

工燃一燃瓢       ^π℃AT口

eDMETK工：TWGADTAACCD工1

0387

C一αコ購        ^{ハG〔議C㎜℃}

PRGRROP工PKAR臓P已GRTWA

241      m一㎝Tハ⊂y麗   ］300

998SGLPVSAR驚n E：LLGPADS  ^IO1日

一一鴬㎜一一㎜℃C

、OPGYP脚PLYGNEGMCWTG■L

87       09 ㎜⁝   ¹⁸010801

一CT       −

LSP聴GS聴PS回GPTDPR医RSR ₆₃ 601一㎜鵬一㎝㎜㎜瓢㎜燃蹴118国LG試V工D↑LTCGFADL麗GYI ₀₈

      CM一℃

PLVGAPLCGみハRALみ闘Gvnv

6﹁・

σr一℃（訥一㎜ハσ一℃CAハTTハ 35

C栂TVFHGAGS民ILVGP賦，GPI  ^IO _OB

3541C㏄㎜㍑A㎝σ一㏄        C−

10geTOMYTSVDOD』VG■榊ERPGA  ⁝㎜（xxx㎜A㎜

LEDGV飼YA LLALLSCL

01GTTCCC皿C         一ACGみG醐丁OCTG 3660

18RSLTPGTCGSSVLYLVTRNA  ^113臼

OeB41㎜甑丁鵬丁一（コ㎜σ1℃鵬職輿一

198SG工YHVTNDCS SS工V1『EAV

61A鴨r惚A       A臓

38DVIPVRRGGDG臓GSLLSPkP

08

901 ハ｛コしπてり㌧Tてコ聖㎜陛¶       TAハCCTてコ㎜

218D岡工IDSPGCVPCVR且NNLSR

㎜A       

VSYLKGSSGGPLしCPSGHAV

㎝TGC㎜㎜AC㎜COC−C−CCACGハ

C回VALTPTL八ARNPSVPTT

貞ツ2

GC鳶一肉       乳G肥門℃ATACCCG

GIFRAAVC↑RGVAKAVDF工P

T㎜       ATGTACG町GG IOgO

IRR龍VDLLVGAAAドCSAMYV  ²⁷⁸

02

㎜瓢一乳一鵬コ℃CC（カ㏄OG390 VεS εTT翼RSLVFTDNsSPP 121

1349e−

108一一一一1140279 G  D  L  C  G  S  V  『  L  V  S  O  L  F  T  F  S  P  R  R      29日

63㎜一一A㎜一ハα一

AVPOAFQVAHLHAPTGSGKS

0晶⊥躍一㎜℃㎜A一㎜欄℃A瓢℃A 1200 マεTVODC閥CSLYPGHVTGHR  318

49 08

CC一A㎜GC℃CAハ㎝A㎜一 TKVPAAYAAOGY其VLVLNPS

OB超 賀L一一一一一一

凹A脚DM麗MNWSPτAALVVSO

0123

T㎜C乱C⊂コ匡賦一A面貞㎜鳳八CAT㎝ハーAACA   4080

VAATLGFGAY岡SKAHGTDP麗  ^127日

㎜㎜ハC−TGσ一CAα一LR：POAVVDMVAGGH GVLA

632︺ 0849

一丁一㍑ひ㎜一κ㎝燃獄㎝鴬㎜IRTGIRTITTGAPITYSTYC

02α一盛㎝理㎜一㎝一丁㎜㎜燗

GLAY了S圏VGNWAKVLIV岡LL

41A一㏄A（㎝唱σr階1・1で！血X欄㎝ 割て猟『A−1て『κ1 八ハ1』A−1、下1唱州、1A

96KドLADGGCSGGAYP11上ぐじレ：

1門燗on［文㍑1・1て1AOO〔＝課紹膿要1・1て賢1瓢鍬ま㍑xx芙71て試・ハ｛XU：｛てx乳｛，〔・Aし、猟1｛

8FAGVDGsTVVTGGVOGR r−rS GO巳ACTCAみC「X；AC㎜ACTA㏄AT㎜A『PC臓ACAG「陀（7rGG八㏄AAGCGGAGハ   4260

CHSTDSTTILGICTVLDQAE  ^133日

41 ㎝㎜ eσ一（㎜TCCCAGハGハσ1℃CAG㎝ATAAACACCAACG

98VFTSLFSPGASQRVQLINTN OC〔Xコて一1qσKXγ〕〔誕XでAC【＝【1【コT『AC｛X工「L℃｛X；Gく1A『1で1弔1℃AC｛、誠唱ぐ

TAGARLVVLA↑ATPPGSVTV

1聴㎜CAl職 欄民ICじeK琳じll把撒暫LwCIWAC脚1

eGS H工NRTAL国CNDSLHTU

21㎝一    ㎜…㎜

58P日PNIεEVALS田TGEVPFYG

1561「臓一M℃AC脚一一㎜℃CハGハ㏄（㎝α、

438しACVFYHNKFNSSGCPERしA

鳳一一一一一…411

KA：PLEムIKGGRHL工FCHSK ^1］9

CGπGCCGCOOCA■mATAAσ『1でGATCハGOGA㎜C〔＝CC∫》］℃A（71』『ACAA（コA八丁AC−

TCRP工DkFPQGWGPITYNNS

一一一一一

1681㏄触e鵬㏄一A一Ae踏CGC㏄σ㎜C＿A㎜AC

4？6G国SDOKPYCWHYハPRQCGlv

5…一一一…560

418YRG【，DVSVIPASGDVVV，VAT  ^工438

561一蝕一一㎜一一一4620

438 D  A  L  M  T  G  F  T  G  D  F  D  S  V  I  D  C  N  T  C    1458

轡

騨騨

㎜⁝A

一1一℃C㎝

PASDVCGPV

CC配CG轟丁α一℃C（コACGTAC赴CσR一聯GA一㏄

TTDRLGVPTYT■GEN日TDVL ㎜℃AG瓦CGσ鵬AT皿℃Aσr㎜C㏄ハCC口℃ハCCA−A（！Gム（㎜

VTQTVDFSLDPTFTIETTTv

㎜℃AAC義ATκC㎜CGCA㎜ハA一ハCA瓢ATG納CAGCA

LLNNTRPPHG国脚FCCTWMNS

㏄C陥一℃㏄一丁㎜GCAGG㎝AGG《G鵬CA

PQDAVSRSQRRGRTGRGRRG

C一一一一一一m

TGFTKTCGGPPCNIGGVGNN

9﹃一

一㎜㏄一一㎝鵬TG一㎜q切IYRFVTPGERPLG翼FDSSVL

㏄㎜㎜㏄㏄一㏄A㏄C㏄㎜A㎝ハCAC㎜爬TG

TL工CPTDCFRkHPEATYTKC ㎜丁甲 ^{㎜捧 H−}

 ⁝ 羅

㎝ ⁝01

GTTCG−ACσrAGσ1「OC八TGGTTGACTATCCGTAC㎜℃TGGCATT

GSGP吋LTPRCMVDYPYRL■H

1 ACCC（一ハハCTT℃ACCATCTTCハ汽GGTTAGGATGTATGTAGGGGGCGTGG八GC

8YPCTVNF↑IFKVRMYVGGVE

㎜α一CCCハCAT一AC−CAGA㏄黒C  4

W已DVFTGLTH工ESHFLSOTK  ¹

AC一臆A蹴AAT㎜伽℃Gハ㏄鵬一CC㎜GGAC脳

H睡LDAACNWTRGERCDLEDR ^{0﹃甲      01} ⁝ ⁝㎜⁝ 騰 ⁝ κ丁解Ic ^{㎜⁝麟       肩− 4︵ソ  0108  0e} 22i ATAGATCハGハGσ：℃ハGTC⊂GC一ACAハCAGAGTOGCAGATACTGCC㎜

658D R S日L S P L L L S T T E w O I L P C

㏄TI℃一A㏄GG㏄㎜℃CAσ㎜M℃CA瓢CA一㎜ ²³⁴⁰

SFTTLPALSTGL工HLHRNIV  ⁶⁹⁸

CGCACCCCATAハCCA湘3丁燃TCムTG漏＝AπGCATU脳：G〔XコロハC−X筑℃ACTA

THP工TKY−MTC岡S轟DLEVVT

  ㎜曇

㎜川黙

解−   皿L

樫

㎜⁝㎜−

詫昌 ㎜v 澱

   4071

1一一㎜一一㎜一…80

8STWVLVGGVLAALAAYCしTT  ¹⁶⁷⁸

1GCA㏄㎜℃A一罵皿㎜00一質℃C㏄A㎝5〕4

8GSVVIVGRIILSGRPAVVPD  ¹⁶⁹

TGCTGCTGハTAGCCCAGGCT〔；AGGCTGCCTTAGAGAACCTGGTAG『℃CTCAハTGCGGCGr

MLLIAQAEAAしENLVVLNAA

C㎜CGG羅℃A       ^rACA

SVAGAHGVLSFLVFFCAAWY

TCAひCO眠㎝ACA540

SHLPY  ¹⁷¹

㎜㎜㎜しGLLQ

    ＾＾

㎜⁝    K

    Q

    K

    F

階^O

㎜⁝ 

   評㎝㎜

㎜旧 轡

   ⑳五

一^PしL

eeTGGG鷹ATA㎜TA㎜ハ Ψ

PGAAYALYGV ₀₈

㎜ 

一欄一躍鵬㎜c一一㎜

LLしLALPPRAYAMDREMAAS

492

㎜c㎝㏄一℃ccA一燃皿α蛇㏄σ㎜

TATKO義EAAAPMVESKNRA1・

01一㎜㎜㎜一皿一㎝A−

1BCGGAVLVGLVPLTLSPYYK』V

Figure2Nucleotide and deduced amino acid sequence of HCV−N strain．The nucleotide sequence of HCV−N         is shown in the upper line and deduced amino acid sequence of HCV−N is shown in the lower line，

        respectively．

172

5521 A(::A(7rtllrlTxl,r.AJW,c,w･JvlllmcIAA1,1lrA11,Jvltx a 1 IA･tnc ',v :17vi･ri,N   'Aa   :, ･t‑

l･1S8 E T r w A K R ,( w N F I s c I L, v L A U 

5581 TA TWOCA:TCAC!GA: GCATrcACA lrCATCA  1778 L S T L P G N P A I A S L ,, A P T A s I  56d I ACCC rAccClcc:UrrrMc,vtcrlt nRuvlt･(,L:1L :cl   179GT s p L T T Q N T L L p N : L e G w v A 

5701 

1818A Q L A P p s A A S A F v G A G I A G A 

S.61 T ATl GCAe 

rc38A v G s I G L G x v L v D I L A c y c A  le58G v A G A L v A F tc v  a s G E v p s T E‑

5981 

187e D L v N L L P A : L s p G A L v v G v v 

5g41 G!Gc CM:T AOG!WCCC TGM:cc 1898c A A I L R R r, v G P G E G A v o w M N  6001  AT wCA lT!CccCc ACr ;1UI creAeA  l･18R L I A F A S R G N R v S P T H Y v p E  6o61 ccGA  rcAGA!cauCCAGCarraCCRTCAClrAccreC! A  1938 s D A A A R v T O I L s s L T I T Q L L 

6121 Tr A M 

6181 eoGA TATecA 

1978 R D v ,, D w I c T v L T D F K T w L O s 

62dl TGCCAACeC : A Ae 

19･8K L L P O L P G I P p L s C Q R G Y x G  G301 ATCAl l:MCC a!ecccATo! AGCAcAGATCACCceAC  2cn8v w R a D G : ,! L T T C P c G A O I JT G 

Ga61 Alx !CA,W:T l caIGAOCA AOC TG 

2Q38H v K N G S ,1 R I v G P K T C S N T w tl 

6421 GAACATTCCCCA:rcMcccAT C ncT 

2058G T F P I N A Y T T G P C T P s p A P N 

6.81 A: 

2O78y s !t A L w R v A A E E Y v E v T R v G 

6541 AITrcCACT  W!1GOCCAI CCAOCTrcCee 2098 D F r, y v T G :, T T D N v ,c C P c o v p 

66Ol AGGT Ccc,CCecCelncA 

2118A P E P F T E v D G v R L R R Y A P A c 

6661 eACC1, ar AGTA 

2138R P L L R E E v ,t F Q v G L N O Y L v G  61 2 1 CGCAGC:!COCA COG,,T raGCAareCrCAC:rlCCAI arr,tccGATC  2158 s o L P c E P E P D v A v L T s ,, L T D 

67 81 CCrcCC 11  MOCO8WF! r CCTCCT 

217e p s H I T A E T A K R R L A R G P P P S 

6841 I CC IGCAC^c  cC 

2198 L A s s s A S Q L S A P s L x A T c T T 

e･OI A,rc･A.il5,Lcll'(J'cchoNxx;111, (xr 1'AltlhtlLlt  1lvLt ,l ',rtLn  a  lrl ･Na:At:A･na: 

22rs H H D s p D A D L I E A N L l* w R L, L: ,1  6 961 e AAACATCAOCCOCGIOGAGrcAeA rMCerACT A,FT]･IllCACrCrrrcc̲ JLCC 

223eG c N I T R v E s E N K v v I L D s F D 

,02 1 co(*rlc Jvx:(x5AoL:Aa JAlr:A(jNxx;Nx:L 7lt･LlrrlLx l;t:,L( x:A(7A,ll'("IL ,Lk:AL:A･r 

2258 P L R A E E D E R E v s v A E E; I L R R  7 081 AIGCGATQecc,,TA ecC ACMCCC:rCcA1l   2278s R x F P P A b, P I w A R P D y N P P L 

7141 T , TccIGGA; AcccGGAcTA,ro,L･rc(r[ccGcrFA(;;rAcA1[xx71lscccA,ilUc･cAc 

2298 L E s w K D P D y v P P v v H c c p L P 

?201 C!ccTAA CccCTCCMTAccAccTC CAeAeT 2]18 P A K A P P I P P P R p te R T v v L T E 

7261 CACT 5cAccTCcG lrGT 

2338･s T v s s A L A E L A T K T F G s s G s  7321 CecceAeCec rTecTeACCAeAcCl cGAccAC ceAcA  235a s A v D s G T A T A L P D Q T s D D G D 

i]81 AAceerCCG,L cc 2378K c s D v E s y s S b, P P L E G E P G D ^{ACl rcCA CC} 

74dl cceA: 

2398 P D L s D c S w s T v S D E A s E D v v  15O1 eclreClrAATgrcarACTCAT GACccoCeccATeATcACccCA OCWL  241B.c c s !1 s y s w T G A ,1 1 T P c A A E E 

CCACAACATI eTn:ATG  TcMccc rl Acc 

7561 

sLLR,tHN,1vy 

2438s K L P I ,, P L S N 

GMGercACCITrGACACACTecMO  7621 ccAcAAcArrclCeC 

245eA T T s R s A C L R Q K x v T F D R L Q 

7681 Toc! TMecAC1:ACCGGGA!CC CACTrA 

2478v L D N tt Y R D v L K E tl K A K A S T V  7741 AccCTun Fer CeT CecCCCCACA oCCAeAT  2498 K A K L L s v E E A c X L T P P H s A R  7801 ccAMT!Tl Crn , lrC CAocGccolTMccAcA  25la s x F G y G A K D V R N L s s R A v N H  7861 TCCOCTC CAC SAGACACCMTTeACAccAccArcA  253e i R s v w x D L L E D T E T P T D T T I 

7921 I cMAeAA ccccGcMeccAcx;l ccc ^MCc 

2558 11 A x N E v F c v Q P E K e G R K P A R  7981 TrATO AT!CCCAGA: ATCC 3 Al lvlITACeAI l ;  25?8jL I v F P D L G v R V C E K M A L Y D v 

8041 T ccAClrTrcCrcAGecceTGAl e ClrATACoGATTCCncl:acTICa:,LAec 

2598 v s T L P Q A v Ft G P s Y G F Q Y s p K 

8rol CAcCl TCwG IQCCerA AT 

2618Q R v E F L v N T w K s K K c p M G F s 

8161 ATeA GAAl cA 

2638 y D T R c F D S T v T E N D I R v E E S  8221 TFrAccAA ccoMGCrMeCAoGccATMACTccarcACAGAcc  2G58 1 y O c c D L A P E A K O A I x s L T E 

Figure 2 

AceTea,r,LATrrA 5940 

5640  179C  b700  1018  5760  1838  5820  1858  5800  1879 

rs90  6000  l･1B  6O6o  1938  6120  1958  6180 

1 97 e  621O  1998  63aO  2O18  6]6a  2a] 9  642O  205G  61BO  207 8  6540  2098  6600  21le  G660  2138  G720  2158  6780  217a  6B40  2198  6900  2218 

,*q,*o 

2:JB  7020  2258 

,, s*, 

227B  714O  2298  ,,oo  2318  7260  23]8  1320  2358  73Bo  2378  74la  2]9B  7500  2418  7560  2438  7620  2d58  76GO  24?8  7740  2498  7800  2518  78eo  25]8  7920  2558  7980  2578  8040  2598  8100  2GIB  816O  2638  822O  265B  8280  2678 

e2el  2678  8341  2698  84cn  2718  8461  27]8  8521  27S8  8S81  2778  8641  2798  87O1  2818  8761  2838  8821  2859  88Bl  2e78  0941  289a  9001  2918  9O61  2938  9121  29S8  9181  2978  9241  29g8 

GGalvrAT,Ll ( cslccc(,,oAc:lwv ,Ir v x xx :AL: JVlt ; I u x   n･ rAl  x x x I k   r 

RLyiGGPLTNSXGONceyRR 

ecceCeC CT GC COe!1MTACCaCACAl TAall MGO 

CRAS GVLTTSCGNTLTcyL A GAc:rcx:Ac:c･uvf e;crcx7luJU (1‑:G G:Ac:(; 

ASAACRAAXLQDCT,1LVNGD 

Ta GM:1rcA GGAl CG CCrncGAccar 

DLVVICECTGTOE:DAANLRA ,,TGACC, T COGeGACCCOCCCCMCCAaMTnco 

FTEAIITRysAPPODppOPEV 

Aal earMTMCATCA TocATCl  DLELITSCSSNVSVAHDASG 

CWP AC1:nc CCccAlrOCA 

XRVyYLTRDPTTPIARAAWE A:T!rc! r, CAACA:11CAIC,,TarncCCccCCAceT 

C T TARHTPVNSWLGNI INYAPT 

T I CMGGATeA:TTll A TCCT! : 

LWARIIIL'IT'tprSILLAQEO 

AGAT  acTccATIGAACCAcrTeATC 

LGl(ALDCOIYGAcys!EPLD 

'TWI A:TeA Al raTTaGCGcA  TAcrrAel, C 

LPQIIERLHCLSAFSLt syS 

C AGATCMT 

PGEINRVASCLRKLGVPPLR acsCTACTerccc 

VWRURARSVRARLLSOGCRA 

 AGTA GACcMGCTcA,nclrAeTCCM 

ATCCKyLFNWAVRTKLXLTP LT 

IPAASRLDLSGWFVAGysGG 

AC, T, T  nclrcTAC 

DlyHSLSHARPRWP,,LCLLL 

TrrcTowi racGc r CCCOTGA 

Ls G+G****' R' 

Figure 2 

respectively. The sequence homology of HCV‑N also  showed its closer relationship to HCV‑1 than to HC‑J6  and HC‑J8 isolates (Table 1). HC‑J8 possessed 23% 

divergence with HC‑J6 and has been clearly identified  as a separate genotype from HC‑J6 (Okamoto et al., 

1992b) .  In order to confirm this conclusion,  phylogenetic trees were constructed base on nucleotide 

(gb] 

40 

30 

2o 

10 

Rl･to 

･9u  8doO 

27 1 8 

8d60  27]B  B520  2750  8580  2778  864o  279B  870o  281S  87GO  2830  8820  285e  R8Ro  2878  e9do  2898  9000  29le  eo60  2938  gl20  295a  9180  2978  9240  2998  9295  3ou2 

HCV 

Group 1 

l 111 b 

Group 2 

I11 a  llll2a  IV/2b 

Hcv‑N HCV‑BKHCV‑J HCV‑JTHCV‑T Hcv‑1 Hc‑J6 Hc‑J8  Figure 3 Phylogenetic trees are based on nucleotide diver‑

gence (%). Sequence of all 8 HCV strains were  campared and analyzed by the nearest neighbor  method. 

174 

divergence throughout entire sequence using nearest  neighbor method (Williams and Lance 1977) (Fig. 3). 

This result indicated that 8 HCV strains can be classi‑

fied into 2 groups: the group I contains genotype II/1b 

(HCV‑N, HCV‑BK, HCV‑J, HCV‑JT, HCV‑T) and  genotype I/1a (HCV‑1); while group 2 contains  genotype 111/2a (HC‑J6) and genotype IV/2b (HC‑J8) .  Sequence variation in the E I and N‑terminus of E2/ 

NSI envelope glycoprotein regions among 3 HCV  Nagasaki strains and 7 other HCV strains with publi‑

shed sequences 

Recently, many papers reported that hypervariable  regions existed in the N‑terminus of E2/NSI envelope  glycoprotein region of HCV genome (Hijikata et al.. 

1991; Weiner et al.. 1991; Honda et al.. 1993). In order 

175  HCv‑N LTCGFADLMC YIPLVGAPLG GAARALAHGV RVLEDGVNYA TGNLAGCSFS  Hcv‑Nl 

HCv‑N2  Hev‑ l  Hev‑BK  Hev‑ J  Hev‑ JT  Rev‑T 

!1c‑ J6  Hc‑ J8 

Hev‑N  HCv‑Nl  HCV‑N2  HCv‑ l  HCv‑BK  HCv‑ J  HCv‑ JT  HCV‑T  t!C‑J6  HC‑ J8 

HCV‑N  HCV‑NI '  HCV‑N2  HCV‑ l  HCV ‑ BX  HCV‑ J  HCV‑ JT  HCV‑T  HC‑J6  HC‑ J8 

HCv ‑ N  Hev‑Nl  Hcv‑N2  Hev‑ l  HCv ‑ BX  Hcv ‑ J  RCv‑ JT  HCv‑T  HC‑J6  Hc‑J8 

HCV‑N  HCV‑Nl  HCv‑N2  HCv‑ l  HCv‑BI< 

Hev‑ J  HCV‑ JT  HCv‑T  HC‑J6  HC‑J8 

I 

IFLLALLSCL 

v v v 

v v ^v 

GND 

El 

TTPASAYEVR NVSGIYHVTN 

I 

v Q 

I 

r Q 

: 

I  VA 

V VV V 

evpCVRENNL  S 

DS GA  GS SF 

A  S  EKVG T  END GT  WGDLCCSVF 

H 

P  YIC  P  P  P 

F P P ^P 

to know the HCV sequence diversity of the envelope  glycoprotein in local area of Nagasaki, 2 other HCV  Nagasaki strains (HCV‑N1 and HCV‑N2) were also  cloned and sequenced for the region of nt 623‑1988, aa  126‑580 (nt and aa base on the HCV‑N number) .  Alignment comparison of deduced aa sequence among 3  Nagasaki strains and other 7 HCV strains with publi‑

shed sequences were shown in Fig. 4. Two hypervaria‑

ble regions (HVR) were discovered in the N‑terminus  of E2/NSI region. HVR I (aa 384‑411) was located  directly downstream at the beginning of the E2/NS1,  whereas HVR 2 (aa 475‑480) was observed 64 aa down‑

stream from the HVR 1. In the HVR I consisting of 28  aa, 10 aa residues were well‑conserved among 3 Nagasa‑

ki strains.  Whereas 

E2 / NSl 

only 3 aa 

HVR ^l 

were ^conserved 

HCV‑N  HCV‑Nl  BCV‑N2  HCV‑ l  HCV‑BK  HCV‑ J  HCV‑ JT  HCV‑T  HC‑J6  HC‑J8 

in this 

LLFAGV 

A  V 

R  R  H  B  H  YT IS 

HTV  YSS 

V T REA  TLAQ  SA H 

AAK RVAS S 

SAH TVA  STAHN  QEA 

TSVFTSLFS P  ATGLA FL 

GLV L 

VGV LA 

NRLV M AS  QSLV WL Q  QSV F TG  HSLA TQ  ARTL GM L  VAG AG TT 

GASQR  K  PT  K  P  P  PA 

R  K 

I 

KI  N  K: 

KI  K  K  N 

M  ST L 

DCSNSSIVYE  P 

A 

225  AVDMI I DS pe 

A I MHT  A v MHT  A A LHT  A L MHT 

A MHT 

AG M}!T  A M}!T  LQAAVLHV  LT AVLHL 

HCV‑N 

HCV ‑ N l 

!1CV‑N2  HCV‑ l  HCV ‑ BK  HCV‑ J  HCV‑ JT  HCV‑T  HC‑J6  }IC‑ J8 

425  LIN TNGSWHINRT 

VI 

v 

H  A L  X I TG M 

I SS YA  SRCWVALTPT 

M 

IPVS N 

LH IQV N 

LAARNPSVPT 

j̲ SI 

V T DGKL A 

VT I 

SI TI 

V VQQ GAL NV 

V VKHRGAL 

TD TWQ  N TWQ 

ALNCNDSL}lT 

E QA 

Q  N  Q 

EN Q _Q 

GFLAGVFYHN 

L AL TY  AL VH 

W L H _AL TH 

I AL AH  F AL AH  SL A,i  SL TH  SL TH 

KFNSSGCPER 

N  T  LATCRPIDKF 

MQ  ^N  MS S 

S LTD  MQ T  MS  ^E 

M S SS 

MS S 

MSA S EA  SS GL D 

LS 

275  TTIRRHVDLL VCAAAFCSAM 

Q 

s 

S TL L 

L  A QGL T I MV MS TL L 

RSL T MI M TA L 

325  LVSQLFTFSP RRYETVQDCN CSLYPGHVTG HRMAWDMMM1 1̲ 

I 

G 

H 

HH HW T G  HV L 

G M M M IV QHHWF  V A M IL A MV Q rINFT E  WS PTAALWS 

T 

Figure 4 

QLLRIPQAW DWAGGHWGV 

IM T A 

T MA LL I A M A 

TMILA YAM V EVII IIG A  LTMILA YAA V EL L EIIF 

I  I  I  I  I  I  I  I  I 

L  YLS 

I  S  S  S  TI 

Q I  ^LS 

37S  LACLAYYSW GNWAKVLIVM 

P 

I F A  VL 

MP WLL ^FQ F Q A 

VF IAIL ^A 

HCV‑N  HCV‑Nl  HCV‑N2  HCV ‑ l  HCV ‑ BX  HCV‑ J  HCV‑ JT  HCV‑T  HC‑J6  HC ‑ J8 

HCV‑N  HCV‑Nl  HCV‑N2  HCV‑ l  HCV ‑ BI( 

HCV‑ J  HCV‑ JT  nCV ‑ T  HC‑J6 

HC ‑ J B 

HCV‑N  HCV‑Nl  HCV‑N2  HCV‑ l  HCV ‑ BK  HCV‑ J  HCV‑ JT  HCV‑T  HC‑J6  HC‑J8 

Hev 2  SSP  AQ PS I 

TEPRDL  TEADIQ  VT 

Q 

DQK  ER  R  R  R  R  R  R  MR  MR 

VPTYTWQENE  DL  A  A  A  A  A 

DR  S  R  S  N  S 

VGNNT 

I  D  A 

G  DF  DY  L 

A  s 

580  LI 

1; 

T  H  T  V  T  V  L  L  D 

PYCWHYAPRQ  Y  T 

P  P 

P  P 

PY  XP  P 

P  P  p 

TDVLLLNNTR  rv I A 

F  F  I 

s 

s  s 

S RA  RA S 

CGIVPASDVC  AV  SCLL 

T 

vs 

QM  KS 

E  Q  Q  Q  S  RT 

PPHGNWFGCT  Q  Q  Q  Q  Q  Q  O ^S 

A 

GPVYCFTPSP 

T R V 

WMNSTGFTKT 

G  Y 

v  474  DQGwepITY  N 

A  A  RV  RI 

s  H 

ALQ E  TLE E  523  VVVWTTDRLG 

I 

G  G  G  G  G  G  G  G  G 

s  rv  S  F  F  s  F  KQ  573  CGGPpCNlcc 

Alignment of amino acid sequence among 10 HCV strains 

‑BK, HCV‑J, HCV‑JT, HCV‑T, HC‑J6 and HC‑J8) in the E1 and N‑terminus of E2/NSI regions  126‑580). Two hypervariable regions (HVR I and HVR 

‑glycosylation sites (N‑X‑S/T) are underlined. 

A 

A  A 

ASMD  s :D 

(HCV‑N, HCV‑Nl, HCV‑N2, HCV‑1, HCV 

(aa  2) are shown by boxes. Potentral N 

v v 

RRA RRK 

Table 2  HCV genotype classification including HCV‑N from this study and 15 entire  HCV strains which have been reported by Sakamoto et al. (1994) . 

Group  Group 1  Group ²  Group 3 

Genoty pe  I/1a  lc  ^{II/1b  III/2a  IV/2b}  V/3a 

HCV‑ J 

HCV‑BK 

HC‑ J4/83 

HCV‑1  ^HC‑ J4/91 

HCV strains  HCV‑H  HC‑G9  HCV‑ JT  ^{HC‑ J6  HC‑ J8}  NZL1 

HC‑ J1  HCV‑T 

HCV‑ JK1  HC‑C2  HCV‑N 

Geogra phic  Area 

U.S.A. 

Japan  Indonesian 

Japan China Taiwan 

Japan  Japan  New 

Zealand 

region when a total 10 HCV strains were corrrpared. In  the HVR 2 consisting of 6 aa, none of the aa were  conserved among 3 Nagasaki strains. This hypervar‑

iability was also observed when a total 10 HCV strains  were compared simultaneously. In the E1 and N‑termi‑

nus of the E2/NSI regions, 2 well conserved aa  sequences were observed among 10 HCV isolates: G‑H 

‑R‑M‑A‑W.TD‑M‑M (aa 315‑323) and W‑F‑G‑C‑T‑W 

‑M‑N (aa 549‑556). Although 14 N‑glycosylation sites  (N‑X‑S/T) were identified in HCV‑N, one of them  (NNS at aa No. 475‑477) was unique to this strain and  not present in 2 other Nagasaki strains and 7 other HCV  strains with published sequences. Instead, HCV‑Nl and  HCV‑N2 possessed another N‑glycosylation site (NFS  or NSS at aa No. 250‑252). This glycosylation site is  found also in HCV‑BK, HCV‑J, HCV‑JT, and HCV‑T 

(Fig. 4). Altogether, only 9 N‑glycosylation sites were  conserved in the E1 and N‑terminal of the E2/NS1  regions among 10 HCV strains shown in Fig. 4. 

DISCUSSION 

Relationship between genotype and geographic area  of HCV strains including HCV‑N was shown by their  sequence comparison using the classification by Sa‑

kamoto et al. (1994) (Table 2). The sequence homology  indicated that HCV‑N strain did not possess its local  genotypic character, and similar to HCV‑BK, HCV‑J  and HCV‑JT strain which were isolated from other  areas of Japan. All these strains apparently belong to  the sarne genotype II/1b of group 1. This genotype also  included HC‑J4/83; HC‑J4/91; HCV‑JKI of Japanese  HCV strains, HC‑C2 of Chinese HCV strain and HCV 

‑T of Taiwan strain. The genotype lc of group 1 

includes HC‑G9 which was derived from Indonesian  strain. While, the genotype I/la of group I includes  HCV‑1 and HCV‑H which were derived frorn' American  strains. Although another HC‑JI was Japanese strain, it  was supposed to have originated from the US, because  HC‑JI was derived froin a Japanese haemophiliac who  developed hepatitis C after receiving US‑made factor  VIII (Okamoto et al.. 1992a) . In group 2, HC‑J6 and HC 

‑J8 belong to the 111/2a and the IV/2b genotype, respec‑

tively. Both of them were Japanese strains. In group 3,  NZLI that carne from New Zealand belongs to V/3a  genotype (Table 2). Simmonds et al. (1993b) have  classified 6 major genotypes of HCV from 76 HCV  isolates, which were almost worldwide collection, using  phylogenetic analysis of the NS5 region. The 76 HCV  isolates contained entire sequence of HCV‑1, HCV‑H, 

HCV‑J, HCV‑BK, HCV‑T, HCV‑JT, HC‑J6 and HC 

‑J8 strains and other partial sequence of HCV strains. 

From this classification, only genotype 4, 5 and 6 showed  highly restricted geographical distributions, being  apparently confined to Egypt, South Africa and Hong  Kong respectively (Simmonds et al.. 1993b). 

Two hypervariable regions have already been obser‑

ved in the N‑terminus of the E2/NSI region. The  number of con erved aa in the HVR I among 3 Nagasa‑

ki strains were higher than among a total 10 strains  including 3 Nagasaki strains and 7 other HCV strains  with published sequences. The numbers of conserved aa  (5 aa/28 aa) among HCV strains of genogroup I (HCV 

‑N/HCV‑1/HCV‑BK/HCV‑J/HCV‑JT/HCV‑T) were 

higher than those (3 aa/28 aa) among 10 HCV strains  which included genogroup 2 (HC‑J6 and HC‑J8). This  result may give us an idea that aa conservation in the  HVR I of the sarne genotype or genogroup of HCV are