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香川大学農学部学術報告 第９巻第３号 正誤表
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http://www.lib.kagawa-u.ac.jp/metadb/up/AN00038339/AN00038339_9_3_e.pdf
Notice
Technical Bulletin of Faculty of Agriculture, Kagawa University
Vol.9 No.3 Errata
URL
香川大学農学部学術報望
柿炭痘病菌によるCarbohydraseの分泌について
1′36
谷 利
Secretion of caIbohydrases by Grloeosporium Kaki．
Toshikazu TANI（Laboratory of Phytopathology）
（Received October24，1957） Ⅰ 緒 抵抗磯作の病理化学的解明には，歯と寄主原形質相互匿おける特異な反応現象の英明が重要であることほ論をまつ までもないが，原形質侵入以前における病原菌に・よる寄主細胞快便嘗の問題もまた，疾病の寄主内紅おける進展に関 係があるとおもわれる∴薗の分泌する Carbohydraseが寄主の抵凝性あるいほ歯の病院性に．関係があるとする報 （2471り も2，3みられるが，柿炭疫病薗に・ついてほまだ明らかと．されて−いない…筆者ほ炭塵病に対する柿果の抵抗性 と菌の酵素的多糖頬破壊作用との関係を究明すべく実験中であるが，菌の分泌するCaIbohydraseについて2，3の結 果をえたので，報告する次第である． 本稿を草するにあたり，指導と鞭棒をたまわった本研究室内藤中人教授，実験について種種助言と援助をあたえら れた本学農産製造学研究宴楢崎丁市助手，ならびに実験に協力せられた専攻生掘井隆司更に深謝の意を表する なお，本研究の一・部は文部省科学研究費によった記して謝意を表する Ⅱ 本菌の分泌する⊂arbohyd折aSeの種類 および作用力とPHとの関係 」L原ら（10）は，姉弟のhemicelluloseが主としてⅩyloseと glucose より構成されていると報じている。筆者も， 予備的に富者果肉熱水抽出残淀を加水分解してPaperChromatographyを試みたところ，galacturonic acid，Ⅹylo・ se卜およびglucoseのSpOtが明瞭に検出された したがって∴奉天験は一・L邑pec乞ic enzyme，Ⅹylanase，および Cellulaseを対象としておこなった． 1実 験 方 法 （1）薗の培養 可及的に天然状態に近ずけるため，柿果肉切片を培地とした．すなわち，採取直後の富有（罷病 性〉 および碁盤（抵抗闇）柿果を麹菌的に．剥皮し，15cmの厚さに棋に切断し，さらに．縦虹4分してレヤ−レ一にお さめ仁油紙で包んでコッホ兼気釜で30分間加熱して果肉細胞を死滅せしめ一．培地に供した．あらかじめ，稀薄醤油液 体培地に250Cで5日間培養した菌体（本研究室分離ユ号薗）を乳鉢で軽く磨砕し，それに殺菌水を適鼠加えて菌糸懸 濁液をつくり，接種環とした‖ これを無菌脱脂綿で前記培地の表面に塗布し，250Cで6日間培養した小 （2）酵素液の抽出 培養がおわった果肉より種子をのぞき，等重義葺の水を加えて2時間被搾放置後ブレンダー・で暦 砕してカユ状となし，圧搾濾過，遠心分離をおこなr，，て紳出汲をとったcellulaseによるCMC粘度低下の測定，液 化型polygalacturonase（PG）ならびにPr・OtOpeCtinaseの検索にほこの液を使用した．本液は多毘の糖類を含有し ているから，それを除去するために．さらに次の操作をした。すなわち，液量■の35倍畏Lに相当する95％冷ethanolを 徐徐をこ加え，できた沈澱物を遠心分離に．よってとり，それをEO％冷ethanolで数回洗姦し，最後に．95％ethanolでl 回洗条後OCCの賀空デジグ一夕中で乾燥すると，褐色粉末の粗酵素櫻品がえられた．この粉末を馴q果肉の％惑星の 水に溶解して酵素液とし，PG，Ⅹylanase，およびce11ulaseによる還元糖生成を測定した‖
（3）基質の調製 pectic acidは市販のCitrus pecti∫ユを常法（6）に′よりヱ馴ヒしたⅩylanほ稲わらよりE3比野法（12）
により分離抽出したcellulose としては市販のNa，Carboxymethylce11ulose（CMC）をもちいた小 いずれも水に
1％となるよう紅溶解あるいは懸濁して基質とした。．
鳩）作用披の調製 PG，Ⅹylanaseおよびceuulaseによる還元糖生成の測定にさいしてほ，基質2mi，酵素液2 mi，MacIIvain bufferlml，および少鼻のtoluolを混合した．PGおよびcellulaseに．よる粘度低下の測定＝こは，
第9巻第3号（1958） 13フ 基質5mi，酵素液5rr｝1，およぴMacIIvain bufferlmiを混合して調製した （5）作用条件および作用力測定法 調整後ほいずれも3〇OCに保ち，Somogyi−Shaffner・Hartmann法（5）に．より還元 力を定温し，同時にリ1000Cで一15分間加熱後同様に操作した酵素液を対照区と．して用い，その還元力を差引いて還元 糖生成酵素の作用力としたこのさい，富有培地より抽出した酵素液の還元力定鼠紅ほ2mlの作用液でことたりた が，碁盤培地のばあいほ酵素の作用力が低かったので，4mlの試料について定鼠した（第1図にほ滴定価そのままを 記載した）．．粘度低下の測定にさいしては，3COCの恒温糟中て1時間後の粘度変化をOstwaI■d粘度討で測定し，分 解率（6）を算出した． （6）protopectinaseの検索 馬鈴薯中心部の均一な組織をコルクポーラで直径lOmmの円柱に．切りぬき，30分間水 に．浸潰後ミクロトームで厚さ05mmの円仮に切断したものを，前記酵素液5mlとMacIIvain bufferlmlの中え10 枚ずつ入れて3C〉CCで基質の軟化状態を観察したり 2い 実 験結 果 果肉培地における菌の発育ほ比較的良好で，接種後4日目にほ果肉の表面全体が空中菌糸でおおわれる．肉眼的に m6 むのd扇︼0雇hq軸ロの如月Onpむ出 翳何だ0ロ叫h内切ロの如已芯npむ出 3 4 5 6 7
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3 4 5 6 7
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3 4 5 6
pH in the reaction solution Fig．l．Effect of pH on the activities of carbohydrases。（Average of 2 replications）
Note：Reducing stlgarincrease wasindicated by mlof N／200Na2S208
香川大学農学部学術押合 138 ほ富有と碁盤培地間の空中菌糸発育に．相異を認めなかったが，基中菌糸ほ富有培地のはうが発育良好であった。実験 結果ほ第1図に示すとおりであるい すなわち，本菌ほ富有および碁盤果肉培地に．おいて糖化型PG，Ⅹylanase∴糖化型Cellulase（CR）ならびに・液化 塑Cellulase（CD）を分泌する．しかしてその作用力最適pHほ．，富有培地に生産されたものでそれぞれ5」2，44， 32，および45附近，碁盤培地のものでは5．2，44，40附近，および30以下である・作用力ほ，いずれのpHに おいても，富有果肉を培地としたもののほうが、碁盤のものより高い・PfI3∼3の範囲において，PIOtOpeCtinaseお よび髄化塾PGの作用力は認められなかったので∴本薗ほこれらの酵素を分泌しないものと．いえようl Ⅱ 酵真の作用力におよぽすe七har10i沈澱処理の影響 前述のように，糖化型酵素の抽出にあたっては，混在する還元糖除去の冒的で酵素彼のetbanol沈澱処理なおこ・な わねはならないが，本処理にもとづく酵巽活性の変化が酵素の種顎笹よってこと．なるばあいも予想せられるので，処 理前における酵衆力価を推定する選科として本実験をおこなった．培養ほ富有果肉でおこない，本項に記載した以外 の実験法はすぺて前項に．したがった小 1．糖化型酵累の作用力に及ぼす影響 前項の実験に用いた酵系液を対照区と し，この酵素披をさらに35倍鼠の95％ 冷etbano巨で沈澱処理後同景の水を加え て溶液と．したものの作用力を測達した その結果ほ第1表に示すとおりである すなわち，培地より搾出した原液を1 回ethanol処理したものに．比べて，2回 処理のものは作用力が％あるいほそれ以 下に低下する小 とくiこ，CRにおいてこ
Tablel‖Effect ofIepIeCipitation with ethanol On the enzymic activities
（Average of2replications） TntWinOl
Enzyme fpHi㌔蕊乙㌘Ction
PG J
52 5・55 2 40ⅩyaSe 3 ec
The figures representing reducjng sugarincrease were indicated bymiof N／2CC）Na2S203小
の傾向はいらじるしいが，いずれの酵素 とも，CDにおけるように（下記）2回の処理で作用力が消滅するようなことほなかった 2CDの作用力におよぼす影響 供試培地より抽出した原液を対照とし，1匡Iethanol沈澱処理の粗酵素粉末を原液の与も鼠の水で溶解した酵素液に ついて分解率を測定した．．結果ほ欝2図に示すとおりである．すなわら，ethan01処理区ほ原液の3倍に濃縮されて いるすこかかわ らず，CMC の液化力が極 端に低下す るethanoI 処理を2匝l繰 返したもの は，2時間後 においても完 全に液化力を もの宕︼U已叫一再瑚ns餌∃Unpむ出 む如已再点じき−SOUSちちβ再出 I 2 Time of reaction（hrsh）
Fig 2．．Effect of time as wellas ppt．， Fig．3・Effect of time on the activities
withethanolontheactivityof
ofPG，Ⅹylanase，andcellula・示さなかっ
cellulase of the CD type
Se Of the CR type た鴇Indicated by mlof N／200Na2S20台
Ⅳ 酵素作用と作用時間の関係
富有培地のものから，Ⅱの方法で作用披を調製し，作用力の最適pH下で各酵素を処定時問300Cで反応させた結果 ほ，第2図および第3図のとおりである‖すなあち，PG，Ⅹylanase，およぴCRほ，いずれも作用時間5
第9巻第3号（195∈∋） 139 は30時間たってもなおその傾向はみられない，−・カCDほ，最初の○，5時間が液化作用もっとも強く，以後ほ急速に． 緩慢になってくる． Ⅴ 考 察 植物病原菌の牲産するCarbohydIaSeに関してほ，とくに木材腐朽菌や嬰凋性病嘗を起因する菌類などについて， 近時かなり多くの報告がみられる炭娼屑菌類においても，Gわ即S♪0デ云“∽ゐαぴα点α∽査（15），Gわβクー5都府〟∽Jαβプ∠cクー la（11），Gloeosporiumolivarum（17），およびGlomerella cingulaia（16）がCe11ulaseを生産し，Colletoirichumlage一 刀α㌢査び研（1叶およびCβJJ♂わわ・去cんぴ？乃S♪￡邦αC去α〆17）ほ生産しないまた，G彪αぴαたα∽査（18），GJα♂才去c∂7α（11），G c∠搾g〟才一
ata（16），Clagenarium（16）およびColletoわ・ichumphomoides（16）がpectic enzymeを生産するGloeo．sPorium kaki （9）についてほ，菌の侵入過程において−穿入管が角皮下層の多糖類を酵素的に分解することがわかっているにすぎない が，本実験の結果よりすれば，PG，Ⅹylanase，CRおよびCDを外生酵素として生酪する従来，Cellulaseの基質と してほ，濾紙片あるいほ綿繊維などを水に不溶のまま用いた例が多く，そのために酵素作用の検出も生成された還元 療の定員によるものであった筆者ほ本実験遂行中に，たまたま，増車彼の培地搾汁原液にCMCを溶解して数時間 放置すると液のヨ−ド呈包皮応がいちじるしく変化することを知ったそこで，溶披の粘度変化を・測定したところ， 短時間で急激に低下することが明らかになり，液化型Cel！ulaseの存在を推定するにいたった．cellulase把よるCeト 1ulose溶液の液化現象ほLEVZNSONら（12）Kより詳細に研究されているが，それによれば，CellulaseのCMCに対する 液化および糖化作用ほ同一・酵素に・よるものと．している本実験の結果においては，作用力の最適pH，あるいほeth・ anol処讐に・よる不活性化などの′r銅ミ，両酵那甘で一・致しなかったので，一億粘度低下型と還元植生成型の酵素を区 別して記述したlこ・の点に・ついてほ今後更に・追求してみたい植物病原菌の分泌するCellulaseのCe11ulose液化作 用についてこほ，Cβ㌢α≠0Sf∂∽βJJααJ研狩）や P」S♂〃ゐ椚￠那SSOJα”αCβ〝′祝∽（8）などによるもののはかほあまり知られ ていないようであるが，水溶性のCeuuloseに誘導した基質をもちいて−液化型Cellulaseを探索するならば，他の菌類 でもかなり発見されるのでほなかろうかと思う・したがって，CDの分泌がGゐ（‘たよの特殊性であるかどうかは，な お今後に残されている問題であろう木蘭の特殊性ほむしろ／他の多くの糸状菌に．確認されて−いる液化型PG（また ほpectin depolymerase）およびprotopectinaseを分泌しない点にあると考える（紋化型PGとPrOtOpeCtinaseは 同一・の酵素であるともいわれている（19））． 木南のPGおよびⅩylanaseを富有機地と碁盤培地から抑出したばあい，その作用力最適pHは同じであったが， Cellulaseでは培地によって異なる結果を示したすなわち，富有培地に生産されたときのCRがpH3h2であるのに 対し∴詳盤培地よりのものほ．pH4“0であった・また，富者培地のCDが45の最適pH値を示すに対し，碁盤のそれ は30以下であったこの現象についてほ現在解明中であるが，おそらくほ或種の阻害物質が碁盤増地より抽出した 粗酵素液に爽雑しているためにおこったものと推定されるなお，拾物病原糸状菌の分泌するⅩylanaseについて報 告された最適pHはあまi）みあたらないが，CocんJ壱0∂〃JαSタ柁￡γα∂♂α几捉S（1）では6∼7，Cんα♂ね〃2よα∽gわ∂βS〝∽（18）では 6・5とされているから，本蘭ほ．ニれよりやや低い結果となっている富有，碁盤の両培地とも本蘭が分泌する酵素の 種類ほおなじであったが，その作用力にほかなり顕著な差異がみられた・すなわら，躍病性品種の富有で生成された 酵素のはうが艦抗娃品種の碁盤のものよりも全般的に作用力ほ強いようであり，とくに両者の羞はPGにおいていち じるしかったけ しかし，この程果からただちに，これら酵素の生成鼠が富有培地において大であるとするのほ，抽出 過程における酵素の欠活ほ別としても，前述のように．酵素液中に混在している不純物の存在が無視出来ない現在の段 階においてほ，尚早であろうしかしながら，確病性品種の培地より抽出した酵素液のはうが，抵抗性品種のものよ りも強力な酵素作用を示すという事実ほ，これを抵抗詮機作の一・因と結びつけて考えるとき，興味ある現象といえよ う． 摘 要 l」柿炭田偶蔚ほ祁果肉培地において，糖化型polygalacturonase、Ⅹylanaseおよび糖化型ならびに液化型の2 Cellulaseとを分泌するlしかしてその作用力最適pHは，富有培地K，生塗されたものでほ5．2，44，3．2，および4。5 附近に，また碁盤培地のものでほ．512，4。4，4。5附近，および3‖○以下にある．液化型polygalacturonaseとPrOtO・ pectinaseほ分泌されないようである。 2pOlygalacturonase，Ⅹylanase，および糖化型Cellulaseは2回のethanol沈澱処理によって作用力を減少する が，なお活性が保たれているに反し，液化型Cellulaseほ1回の処理でいちじるしく作用力が減退し，2匡lの処理によ
1《） 香川大学農学部学術報告 って完全に失箔する 3polygalacturonase，Ⅹylanase，および糖化塾Cellulaseほ5時間におよぷまで酵素作用の低下をみないが，液化 型Cellulaseの作閂ほ05時間以後急速におとろえる 4．．各酵素とも，抵抗性品種の碁盤果肉に．培養したもののはうが，すべてのpHにおいて作用力が劣るようである 引 用 文 献 （1）浅田泰次：日植病報，21，191∼193（1956）
（2）㌧
：J∂fd，22，51（ユ．95フ）（講演要旨）． （3）BECKMAN，C．H“：タカ．γねクαれ，46，605∼609 （1956） （4）DAMlE，Ⅴ小P。：．／0〟㌢．J乃d重α乃β0才．5￠C．，31， ユミ∼55（1952）〔貯g〝．AAわJ昭ycoJ，31，623∼624 （ユ952）〕 （5）江上不二大地：標準生化学実験，25，東京，文光 蛍（ユ953）． （6）福本芳一郎：赤堀四郎編，酵素研究法，2，165， 東京，朝倉語店（1956） （7）広江勇，西村珊：日権柄柁，18，94（1953）（講 演要旨）． （8）HusAIN，A，，KEL、MAN，A．：Ph．ytopath．，47， ユエ1∼］＿12（⊥95フ）． （9）鋳方末彦：粧の重要寄生性病害に関する病理並に 治病学的研究，12フ（】168，東京，養賢堂（1942）n 00）北原増雄，竹内庖光，辻勝治：栄養と食糧，8，ユ39 ∼ユ．42（1955）． （11）北島博：日植柄報，15，102（1951）（講拭要旨）‖ （12）LEVINSON，H”S．，REESE，E．T．：Jour．Gen．P・I 如扇扉．，33，601｛−628（1950）。 （13）西田吃二：江上不二大編，多糖新化学，13，諌京， 共立出版（1955ト 摘 大石親男：日植病報，18，フフ（1952）（講潰婆旨）‖ 舶）小沢洒二郎：農学研究，40，⊥10（−112（1952）．． （16）ScHMITTENNER，A‖F．：タカ．γね♪αfん‖，42，4フ4 （1952）．． （17）瀬戸房太郎：日植病報，5，30e∼31．7（1936）． （18）SoRENSEN，H．．：アJα花才α㌢鋸桝，5，1∈∋3∼193 （1952）〔β査oJ．A∂ざわ・，，26，29158（1952）〕‖ （1功 武田晃，林修一，宇佐糞四郎，小沢潤二郎：農学 研究，38，43∼45（．1948）． R e s u m 畠l‖ The p‡eSent PaPer deals with the experimentalresults on the secretion of carbohydIaSeS by GloeoS♪0− rium kahiwhich was c11ユtl甘ed on kakifruits
2．The fungus was董ound to secrete polygalacturonase（PG）capable of converting pectic acidinto 工e
ducingSugar，Ⅹylanase，and 2 types of cellulase，iecapable of hydrolyslng SOdium carboxymethyl Ceuu王ose as measured by the amount of reducing s11garS Obtained（CR）and of depolymerizingit＼CD）
In the case o董the enzymes pIOduced on t†Fuyu”medium，OPtimalpH for their activities was 5．2，44
3h2，and45respectively，While that on†亡Goban”medium was5．2，44，40，and below3．0respectively Neither ot1iquefying PG or protopecti工1aSe COuld be detected at pH range from3to8
3，．By taking reprecipitation with ethanol，CD was completely deprived ofits activity，While the activi− ties of xyianase and CR could be stilldetected．
4．The enzymic activities of PG，Ⅹyianase，and CR did not decrease eveilifincubated for5hr’S，but remarkable decIeaSein CD activity was董ound withinlhour ofincubation
5小In allthe pH value tested，the activities of allthe enzymesin question were moreintensivein the Cultur・e Of”Fuyu”（SuSCeptlble var．）thanin that of“Goban”（resistant var）。This may suggest that the secretion of carbohydrases by the calユSalfungus would be closely correlated with the disease resis・ tance o壬the host against the pathogen
