複合糖質を可視化する

岡山 医学会 雑 誌 第117巻 May2005, pp.35-39

総

説

複合糖 質 を可視化す る

大 塚 愛 二

岡山大学大学院医歯学総合研究科 人体構成学 キ ー ワ ー ド:複 合 糖 質.組 織 化 学,プ ロ テ オ グ リカ ン,電 子 顕 微 鏡,光 学 顕 微 鏡 は じ め に 複 合 糖 質 は,糖 鎖 と蛋 白質 や 脂 質 な どが結 合 して複 合 分 子 を構 成 して い る もの で,そ の 生理 作 用 につ い て は広 範 囲 に及 ん で い る.本 稿 で は,私 た ちが 手が け て きた鉄 コロ イ ド法 と高分 解 能 走 査 電 顕 観 察 法 を中心 に, 複 合 糖 質 の可 視 化 の手 法 につ いて 紹 介 した い. 光学顕微鏡による観察 光 学 顕 微 鏡(光 顕)で 糖 質 を 観 察 す る に は,古 典 的 な 方 法 と し て は,PAS反 応 な ど が あ る.こ れ は,糖 に 含 ま れ る ア ル デ ヒ ド基 とSchiff試 薬 と の 反 応 に 基 づ い て い る.ま た,硫 酸 基 や カ ル ボ キ シ ル 基 を 含 む 糖 質 の 場 合,荷 電 基 に 対 す る静 電 的 結 合 を利 用 す る 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド法1)や 塩 基 性 色 素 の ア ル シ ア ン ・ブ ル ー 染 色 法 な どが あ る.類 似 の も の と し て,高 鉄 ジ ア ミ ン2,3)や カ チ オ ン 化 フ ェ リチ ン4)を用 い る 方 法 が あ る.カ チ オ ン 化 金 コ ロ イ ド法5)が あ る が,光 顕 下 に 確 認 す る た め に は 銀 増 感 が 必 要 で あ る.特 異 的 な検 出 方 法 と し て は,単 糖 ま た は オ リ ゴ糖 に 特 異 的 に 結 合 す る 蛋 白質 の レ ク チ ン を用 い る方 法 や 抗 体 を 用 い た 免 疫 組 織 化 学 染 色 が あ る.プ ロ テ オ グ リ カ ン の よ う に 糖 鎖 と蛋 白質 と が 組 み 合 わ さ っ て 巨 大 な分 子 を作 っ て い る 場 合,コ ア 蛋 白質 や 結 合 蛋 白 質 を標 的 と し て 解 析 を 進 め る こ と が で き る6-8).何 を染 め て い る の か,何 を 見 て い る の か が 問 わ れ る こ と に な る 場 合,化 学 的 修 飾 や 特 異 的 な 酵 素 に よ る 消 化 に よ っ て 染 色 結 果 が ど う変 化 す る か を確 認 す る 必 要 が あ る. 透過型電子顕微鏡による観察 透 過 型 電 子 顕 微 鏡(透 過 電 顕)で 観 察 す る に は,適 度 な 電 子 密 度(電 子 線 の 通 りに く さ)を 持 っ た もの で 染 め る 必 要 が あ る.糖 質 を よ く染 め る も の と し て ル テ ニ ウ ム ・レ ッ ドな ど が 知 られ て い る.電 顕 レベ ル で の PAS反 応 に 相 当 す る も の と して,PAM反 応 が 知 られ て い る.酸 性 基 を検 出 す る方 法 と し て,陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド法9-11),高 鉄 ジ ア ミ ン 法2,3),カ チ オ ン化 金 コ ロ イ ド法5),カ チ オ ン 化 フ ェ リチ ン 法4)な ど が あ る.糖 鎖 の 特 異 的 検 出 に レ ク チ ン を用 い る 場 合,金 コ ロ イ ド を標 識 物 質 と し て 用 い る.急 速 凍 結 デ ィー プ ・エ ッ チ ン グ ・ レ プ リカ 法 に よ っ て,複 合 糖 質 に 他 の 物 質 を 結 合 させ ず に 観 察 す る試 み が な さ れ て い る12). 走査型電子顕微鏡 による観察 走査 型 電 子顕 微 鏡(走 査 電顕)で 複 合 糖 質 を観 察 す る試 み は,高 分 解 能 走 査 電 顕 の 開発 に伴 っ て な され て 平 成17年2月 受 理 〒700-8558 岡 山市 鹿 田 町2-5-1 電話: 086-235-7088 FAX: 086-235-7095 E-mail:[email protected] ◆ プ ロ フ ィ ー ル ◆ 医学 部 の 学 生時 代 か ら解剖 学 教 室 に 出入 り し,学 生7∼8人 位 でLangmanのMedical Embryologyを 輪 読 した り,実 験 の 手伝 いの 真 似事 を した り,今 で は正 式 なカ リキ ュ ラム に な って い る教 室 配属 の は し りの よ うな もの をや っ て い ま した.大 学 院 に 入 っ てか らは,脈 管 系 の研 究 と顕 微 鏡 の 医生 物 学 応 用の 研 究 を主 なテ ー マ と して き ま した. そ うい う中 で,複 合 糖 質 の組 織 化 学 やGlycocalyxの 走査 電 顕 観 察 も試 み て き ま した.今 後 も方 法論 の 改 良 を加 え な が ら,人 が まだ見 て いな い景 色 を見 る こ とに挑 んで 行 きた い と思 って い ます. ― 昭 和55年 岡 山大 学 医 学部 卒 業 ―

き た13,14).これ ら は,必 ず し も好 結 果 を 得 て い なか っ た. 近 年,我 々 は,小 腸 上 皮 細 胞 の 刷 子 縁 を 覆 う糖 衣 の 三 次 元 構 築 を観 察 す る こ と に 成 功 した15). 陽性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド法 陽性 に荷 電 した鉄 コロ イ ドを用 い て組 織 中の 陰性 荷 電部 位 の酸 性 ム コ多糖 類acid mucopolysaccharides (glycoseaminoglycan)を 検 出 す る 方 法 は,古 くHale 反 応1)と し て 知 ら れ て き た.こ れ に は,多 くの 変 法 が 開 発 さ れ た が,と くに 妹 尾(本 学 第 一 病 理)ら は,カ コ ジ ル 酸 緩 衝 液 を用 い て 中 性 域 か ら 酸 性 域 ま で安 定 な 染 色 用 鉄 コ ロ イ ド液 を開 発 し た9).さ ら に,村 上 ら は,抱 水 ヒ ドラ ジ ン ・カ コ ジ ル 酸 緩 衝 液 を 用 い て 改 良 し,極 微 粒 子 で 安 定 域 の 広 い(pH0.8∼7.6)コ ロ イ ド液 を 開 発 し た10).ま た,親 水 性 樹 脂 に 包 埋 し た 電 顕 用 超 薄 切 片 を 染 め る 方 法 を考 案 し た11).こ の 染 色 法 を用 い て,腎 組 織10,16,17),中枢 神 経 組 織18-22),軟 骨23),末 梢 神 経 組 織24), 腹 膜 ・胸 膜 ・心 膜(体 腔 膜)17,25,26),リ ン パ 性組 織27)な ど の 組 織 化 学 的 検 索 を行 っ て き た.そ の い くつ か を 紹 介 す る. 中 枢 神 経 組 織 で は,成 体 の 脳 ・脊 髄 の 一 部 の 神 経 細 胞 の 周 囲 にpH1.5の 強 酸1生域 で も染 ま る被 膜 が 存 在 し て い る こ と が 確 認 さ れ た(図1).酵 素 消 化 法 と レ ク チ ン を 併 用 し た 解 析 を行 っ た 結 果 を も と に,硫 酸 化 プ ロ テ オ グ リ カ ン複 合 体 が コ ラー ゲ ン 様 リ ガ ン ドを 介 して 膜 糖 蛋 白 質 に 結 合 し て い る モ デ ル を 提 唱 して い る21).こ 図1陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド染 色(pH1.5)(プ ロ シ ア 青 反 応) お よ び 抗calbindin-D-28K免 疫 染 色(DAB反 応)の 二 重 染 色 を行 っ た ラ ッ ト内側 小 脳 核 神 経 細 胞(n)の光 顕 像 神 経 細 胞 体 と樹 状 突 起 が 鉄 コ ロ イ ドに よ く染 ま るプ ロ テ オ グ リ カ ン に 網 目状 に 覆 わ れ て い る(太 い 矢 印).抗calbindin-D-28 K抗 体 陽 性 部 分(細 い 矢 印)は,小 脳 皮 質Purkinje細 胞 の軸 索 終 末 シ ナ プ ス ボ タ ン で,プ ロ テ オ グ リカ ン神 経 周 囲 網 の 網 目 の プ ロ テ オ グ リ カ ン 複 合 体 は,神 経 細 胞 の 周 囲 に 網 目 状 を な し て お り,そ の 網 目 の 中 に シ ナ プ ス ボ タ ン が す っ ぽ り と収 ま っ て い る こ と を,鉄 コ ロ イ ド染 色 と免 疫 染 色 の2重 染 色 で 明 らか に し(図1)20),シ ナ プ ス 周 囲 柵(perisynaptic barrier)と 呼 ん で い る21).近 年,こ の プ ロ テ オ グ リカ ン を コ ン ドロ イ チ ナ ー ゼ な ど で 分 解 し て や る と,シ ナ プ ス の 可 塑 性 が 高 ま る こ とが 明 ら か に さ れ て い る28).す な わ ち,こ の シナ プ ス 周 囲 柵 は,完 成 した シ ナ プ ス を 安 定 化 させ,シ ナ プ ス 間 の 微 小 環 境 を保 持 す る働 きが あ る と考 え ら れ る. 体 腔 漿 膜,す な わ ち 腹 膜 ・胸 膜 ・心 膜 の 表 面 は 中 皮 細 胞 に 覆 わ れ て い る.そ の 自 由 表 面 に はpH1.5の 強 酸 性 域 で も 陰1生に 荷 電 す る(解 離 す る)酸 性 基 を 豊 富 に もつ こ と は 以 前 か ら知 られ て い た.こ の こ と は 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド染 色 に よ っ て 確 か め ら れ(図2A),さ ら に メ チ ル 化 ・ケ ン 化 な どの 化 学 修 飾 や レ ク チ ン の 応 用

A

B

図2A:陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド染 色(pH1.5)を 施 し たマ ウ ス の 腹 膜 中 皮 細 胞(m)の透 過 電 顕 像.微 絨 毛 を含 む 自 由 表 面 に 顕 著 な鉄 コ ロ イ ド沈 着 が 見 ら れ る.B:図2Aと 同 じ 領 域 か らFeに 特 異 的 な 特 性X線 が 検 出 され,沈 着 物 が

複合 糖 質 の可視化:大 塚 愛二

A

_B

C

図3  マ ウ ス 小 腸 の 絨 毛 上 皮 細 胞 の 刷 子 縁 表 面 糖 衣 層 の 高 分 解 能 走 査 電 顕 に よ る観 察 A:グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド固 定 後,pH7.0の 緩 衝 液 で 洗 浄 し,オ ス ミウ ム 後 固定 した も の.糖 衣 は剥 脱 し,微 絨 毛(v)の表 面 が 露 出 し, 膜 蛋 白質 と思 わ れ る 小 顆 粒 構 造(矢 印)が 見 え て い る.B:洗 浄 緩 衝 液 をpH9.0に し た 場 合.糖 衣 の 一 部 が 保 存 さ れ て い る(矢 印) が,多 くの微 絨 毛 先 端(v)が 露 顕 して い る.C:pH11.0の 緩 衝 液 で 洗 浄 し た場 合.糖 衣 層(矢 印)が 保 存 さ れ,乾 燥 処 理 を含 む 試 料 作 成 過 程 に よ く耐 え て,剥 脱 し て い な い.糖 衣 は や や 太 くな っ た顆 粒 状 の 部 分 とそ れ をつ な ぐフ ィ ラ メ ン ト状 の 部 分 が あ り,隣 り合 う微 絨 毛 に 由 来 す る 部 分 も互 い に 連 結 し細 密 な 叢 状 を呈 す る.A,B,C×200,000.

な どに よ りその本 態 が シア ロ ム チ ン で あ る こ と を証 明 した25,26).光顕 的 に鉄 コ ロ イ ドの沈 着 を証 明す るには三 価 の鉄 に特 異 的 な プ ロ シア青 反 応 を用 い るが,電 顕 的 に は 通 常 電 子 密度 の 高 い微 粒 子 と して 認 識 され る.鉄 で あ る こ とを証 明 す るに は,特 性X線 に よ る分 析 を試 み る と よ くわ か る(図2B)(未 発 表).シ ア ロ ム チ ン 糖 衣 に よ って覆 わ れ た漿 膜 中皮 細 胞 層 は,そ の豊 富 な 陰性 荷 電 に よっ て互 い に反 発 し合 い,滑 らか な動 きを 保 障 し癒着 を防 い で い る もの と考 え られ る. 高分 解 能 走 査 電 顕 観 察 高分 子化 合 物 の複 合糖 質 を走査 電 顕 で 直接 観 察 す る 試 み は,高 分 解 能 走 査 電 顕 の 開発 に伴 っ て な され て き た.我 々 は,最 近,腸 管 上 皮 細 胞 自由表 面 に見 られ る 糖 衣glycocalyxの 超 微 構 造 を三 次 元 的 に観 察 す る こ とに成 功 した15).通常 の試 料 処 理 方 法 では剥 離 脱 落 しや す い糖 衣 を,固 定 後 の洗 浄 に 用 い る緩 衝 液 のpHを ア ル カ リに調 製 す る こ とに よ って 良好 に保 存 す る こ とが で きた(図3).従 来 の 透過 電 顕像 で は隣 り合 う微 絨 毛 に 由来 す る糖 衣 は結 合 して い ない とい う説 が あ ったが, こ の高 分 解 能 走 査電 顕観 察 に よ って 隣 り同士 互 いに完 全 に連 結 して三 次 元 的 な 細 密 な網 状 を呈 す る こ とを明 らか に した.こ の こ とは,病 原体 な どの侵 入 を防 ぎ, 消 化 管 内腔 か ら一 定 の微 小 環 境 を もっ て腸 管 上皮 細 胞 を保 護 す る とい う機 能 的 意義 が あ る と考 え られ る. ま とめ と展 望 以 上,我 々 の 取 り組 み も含 め て,複 合糖 質 の 可視 化 方 法 につ い て概 説 した.方 法 につ い て は,多 くの方 法 が考 案 され て お り,目 的 に か な っ た方 法 で ア プ ロー チ す るべ きで あ ろ う.生 きた細 胞 で観 察 す る方 法 につ い て は,ま だ不 十 分 な面 が 多 く,今 後 の研 究 が待 た れ る. 糖 質 系(グ リ コー ム)は,ゲ ノムープ ロ テオ ー ム系 の次 の 段 階 に あ り,そ の 多様 な分 子 構 造 と機 能,病 態 に お け る変化 つ い て は不 明 の点 が 多 く,今 後 の研 究課 題 を 多 く含 ん で い る. 文 献

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複 合糖 質 の可視 化:大 塚 愛 二

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