Title
Interleukin-2 augmented activation of tumor associated
macrophage plays the main role in MHC class I in vivo induction
in tumor cells that are MHC negative in vitro( 内容の要旨
(Summary) )
Author(s)
欧陽, 観峰
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第660号
Issue Date
2006-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14472
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氏 名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 欧 陽 観 峰(中華人民共和国) 博 士(医学) 甲第 660 号 平成18 年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当
Inter]eukin-2augmented activation of tumor associated macrophage
p]ays the main ro]ein MHC classIk7Vivoinductionin tumor celLs that are MHC negative k7Vitro
(主査)教授 高 見 剛 (副査)教授 柴 田 敏 之 教授 高 橋 優 三 論文内容の要旨 腫瘍組織に浸潤する免疫担当細胞の中でマクロファージ(TAM)は最も多数を占め,IL-10分泌等により抗腫 瘍免疫反応を抑制する方向に働くとされている｡ インターロイキン2(IL-2)はT細胞の生存に関わる因子として当初同定されたが,腫瘍免疫においては直接 作用(NK細胞,1ymphokineactivatedkiller;LAK細胞,細胞障害性丁細胞等の増殖と活性化)並びに間接作 用(主要組織適合抗原複合体;MHC分子及び接着分子を血管内皮細胞,T細胞,腫瘍細胞,抗原提示細胞に発 現誘導)を示すことが知られている｡本研究では,腫瘍拒絶モデルとしてIL-2cDNA導入マウスB16悪性黒色腫 (B16メラノーマ)を作成し,腫瘍に対するTAMのMHC分子誘導能について解析した｡ 【材料と方法】 1)遺伝子導入B6メラノーマ細胞の作製:IL-2cDNAはマウス肺細胞より調整した全RNAをRT-PCR法で増幅 し,クローニングベクターに導入して単離した｡次いでpcDNA3.1hyg哺乳類用発現ベクターに組み換えて B16メラノーマにLipofectamine試薬を用いて導入し,ヒグロマイシン加培地で選択したのち限界希釈法でI L-2産生クローン(B16/IL-2)を樹立した｡陰性対照には,空のベクターを導入したB16/mockを同様の手 順で作製して用いた｡ 2)ELISA:Iし2及びIFNγの測定は,反応部位が異なる2種類の抗IL-2或いは抗インターフェロンγ(IFNγ) 抗体を用いたサンドイッチ法で測定した｡すなわち,精製抗体でコーティングしたイムノブレートを準備し, ①サンプル,②ビオチン化抗IL-2或いは抗IFNγ抗体,③アビジン化ペルオキシダーゼ,④TBM発色基質 を順次反応させ,マイクロプレートリーダーで測定した｡各操作間の洗浄には,0.05%Tween-20/PBSを使 用した｡ 3)腫瘍増殖の測定:B16/IL-2或いはB16/mockの1×106個をC57BL/6(B6)マウス背部皮下に接種し,経時的 に腫瘍の長径と短径を計測した｡ 4)T,NK,マクロファージ除去マウスの作成:腫瘍移植3或いは5日前よりB6マウス腹腔にCD4,CD8, NKl.1,CDllb,アシアロGMl(aGMl)の各精製抗体を隔日投与し,T,NK,マクロファージ夫々を除 去したB6マウスを作成した｡当該細胞の消失は,処理後の牌細胞をフローサイトメトリー(FCM)で解析 して確認した｡ 5)TAM及び腫瘍細胞の分離:腫瘍接種後12日目に摘出した腫瘍組織を細切,酵素処理後,磁気ビーズ法でCD llb陽性細胞をTAM分画として回収した｡同様に,磁気ビーズ法でCDllb,CD4,CD8,DX5,B220陽 性細胞を除去し,腫瘍細胞分画とした｡分画したTAM3Ⅹ106個/mlの48時間培養上澄,並びに,IL-2 (100ng/ml)添加及び非添加48時間培養上澄を調整し,上澄中のIFNγ濃度をELISAで測定した｡
-69-6)細胞膜及び細胞内抗原等の解析:各細胞の表面形質や細胞内サイトカインはFCMで解析した｡アポトーシ ス細胞の検出は,Via ProbeとAnnexin Vの二重染色で行った｡ 【結果】 1)培養B16/Ⅰし2及びB16/mockはMHC分子を発現していないが,生体内ではB16/mockで弱い,B16/IL-2で 強いMHC分子発現が観察された｡生体内におけるB16/IL-2のMHC分子発熱ま,aGMl,CDllb抗体処理 B6マウスで強く抑制され,CD4,CD8及びNKl･1抗体投与マウスでは発現抑制はみられなかった｡B16/ mockのMHC分子発現はaGMl,NKl.1,CD8処理マウスで抑制された｡ 2)TAMを解析すると,F4/80陽性マクロファージの多くにaGMl抗原が陽性であった｡ 3)IFNγ産生はB16/mockに比しB16/IL-2腫瘍組織から分画したTAMで強く,試験管内培養ではB16/IL-2由 来TAMはIL-2添加で高濃度のIFNγ分泌が誘導された｡ 4)TAMのIL-2受容体の構成は,B16/IL-2群ではCD122とCD132が陽性の中親和性で,B16/mock群ではCD25, CD132陽性の低親和性であった｡ 5)B16メラノーマ細胞を試験管内でIFNγ処理すると,アポトーシスに陥る細胞がみられた｡ 【考察】 従来,腫瘍細胞を攻撃･傷害する細胞はN郎田胞とキラーT細胞があげられてきた｡本研究ではB16/IL-2を用 いた腫瘍拒絶モデルの解析から,①B16/mock腫瘍組織ではT及びNK細胞が腫瘍細胞のMHC分子の発現に関与 していること,②B16/IL-2腫瘍内ではTAMが腫瘍細胞のMHC発現を誘導し,③TAMのMHC発現誘導には TAMが産生するIFNγが関与していること,④TAMが産生するIFNγはB16メラノーマを傷害すること,が新 たに示された｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 欧陽観峰は,マウスB16メラノーマモデルを用いた研究により,IL-2存在下の腫瘍内浸潤マクロファー ジ(TAM)は,腫瘍にMHC分子の発現を誘導するとともに腫瘍傷害活性を持ち,この作用はTAMが産生する IFNγに負うという新たな知見を得た｡この知見は臨床応用可能な新たな治療法の開発につながるものであり, 免疫学,免疫病理学,腫瘍治療学の発展に少なからず寄与するものと認められる｡ [主論文公表誌]
Interleukin-2augmented activation oftumorassociated macrophage plays themainrolein MHC ClassIin uiuoinductionin tumor cells that are MHC negativein uitro
INTERNATIONALJOURNAL OF ONCOLOGY(in press).
