2,4,6-トリス(2-ピリジル)-1,3,5－トリアジンを用いる微量鉄のシーケンシャルインジェクション分析

第 14号 2012年

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1ム与トリアジンを用いる微量鉄の

シーケンシャルインジェクション分析

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北 津 咲 良 十 ， 手 嶋 紀 雄 十 ， 酒 井 忠 雄 十

Sakura Kitazawat， Norio TESHIMAt and Tadao SAKAlt

Absiract F10w injection ana1ysis (FIA) was conceived by Ruzicka and Hansen on 1975 as the first generation of non-segment巴df10w chemica1 ana1ysis. FIA is a promising technique for being rapid，

reproducib1eヲ reducingreagent consumption and automated， compared with chemica1 analysis based on a

manua1 procedure. Thereafter， sequentia1 i町ectionana1ysis (SIA) was introduced on 1990 as the second generation of FIA. SIA is a versatile technique based on programmab1e f10w controlled by a computer， and its reagent consumption is 1ess than that of FIA. In the presence of a suitab1e reducing agent， iron(II) reacts with 2人6-tris(2-pyridyl)-13，，5-triazine(TPTZ) to forrn a purp1e iron(II)-TPTZ comp1ex (Amax = 593 nm). This

paper describes a SIA method for the deterrnination oftrace iron 1. 緒 マ 日 健康な成人中の鉄の総量は，約 4gであり，その約 65%が赤血球中の血色素鉄(ヘモグ、ロビン)であり，約 30%が貯蔵鉄(フェリチンとへモジデリン)として肝や 醇などの臓器内に存在する1) この他， 3~5% が筋細胞 中のミオグロピン(ヘモグロビンと同様にへムタンパク に属する)である.血清中の鉄は，トランスフェリンと 結合したトランスフェリン結合鉄であるが，その鉄量は 全体の約 0.1%に過ぎない. しかし，このトランスフェ リンは，鉄の運

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般体として造血に深く関与している.ま た，血清鉄濃度の値が低いと鉄欠乏性貧血が，高いとへ モクロマトーシス(全身の臓器に鉄が過剰に沈着する) の疑いがあるなど，血清鉄は様々な疾患と密接に関係し ている 現在，血清鉄の定量は， 2-ニトロソふλ[んn-フロロヒ。/レ -N-(3ースノレホプロピノレ)アミノ]フェノーノレ (Nitroso -十愛知工業大学工学部応用化学科(豊田市) PSAP)を用いる比色分析によって行われている2) 総合 病院などの施設には，この Nitroso-PSAP法を始めとす る種々の方法を導入した多項目・多検体自動分析計が導 入されているが，高額で一般の病院には普及していない. 1975年に Ruzickaと Hansenらめは化学分析の自動化 を達成するフロ)インジェクション分析 (FIA) 法を提 唱した.内径 0.5mm程度のテアロン管内に3 試薬溶液 を 定流速で送液し，数十から数百μLの試料溶液を注 入し，テフロン管内の流れの中で化学反応を進行させ， フローセノレ付きの検出器で FIAシグナルを検出するも のである.著者のグループでは，この FIA法により3 血清中の銅と鉄4)，あるいは鍋，鉄，亜鉛5)を同時定量 する分析システムを構築し，各種疾患との関連性につい て検討した. しかし， FIA法は試薬溶液を連続的に送液するため， 試料と未反応の試薬が廃棄される.パッチマニュアル法 に比べれば，試薬消費量は少ないものの，更なる改善が 求められていた中， Ruzickaと Marshallらのは，第二世 代の FIAとして，シーケン、ンヤノレインジェクション分

48 愛知工業大学総合技術研究所研究報告，第 14号， 2012年 Dmgra皿ofsequenceinHC

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Fig. 1 Diagram of sequence in holding coil (HC) (upper) and SIA-LOV system for the determination of iron(III)(bottom). CS， carrier water; SP， syringe pump; 2-S

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2-way selection valve; H C， holding coil; 6-S

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6-way selection valve; FC

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flow cell; D

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spectrophotometer; W， waste. 析 (SIA)法を開発した.この方法は 1回の測定に必 要な量(数十から数百μL) だけの試薬溶液と試料溶液 とをテアロン細管内で混合させ検出するため，更なる省 試薬化が進んだ7円 ) そこで本研究では， SIA法による血清鉄の分析法の確 立を指向して， 2人6-トリス (2-ピリジノレ)ー1

ム

5-トリアジ ン (TPTZ) を用いる微量鉄の SIA吸光光度法の実験諸 条件を検討したので報告する. 2.実 験 2.1. 装 置 パッチマニュアノレ法におけるスベクトノレの測定には， 日本分光製紫外a可視分光光度計(平550型)を使用し た.

SIAシステムとして， FIAlab Instruments製 FIAlab3000 を用いた.このシステムの基本要素は， Fig. 1に示すよ うに， 2.5 mLのシリンジポンプ (SP)，2方セレクショ ンバルブ (2-SY)，試薬と試料を吸引するホーノレディン グコイル (HC)，6方セレクションバルブ (6-SY)であ る.このふSY上には，アクリル樹脂製のユニットが取 り付けられている.このユニットには，流路とフローセ ノレが精密加工技術により形成されており，化学反応を行 う場ならびに検出する場がバルブ、上に集約されている. これは， SIA】ラボ・オン・パノレブ (SIA-LOY) と呼ばれ Table 1 Operation sequence ofth巳SIA-LOYsystem S G S V port Flow ratc/ _Description tep positionμL min-1' 20(↓) Aspiration of250μL acetat巳buffer 2 3 20(↓) Aspiration of 150μLTPTZ 3 6 20(↓) Aspiration of 50μLHONH3Cl 4 5 20(↓) Aspiration of75μL Fe(ill)/Std Transportation of reaction mixture 5 2 50(↑) to detector to monitor the absorbance at 595nm a.(↓)， direction of syringe pump motion for aspiration (forward flow);(↑)， direction of syringe pump motion for 位ansportation(reverse flow) る10)分析システムである. 6-SY上のユニットには，光 ファイパーケーブルが接続されており，タングステンー ハロゲンランプ光源 (OceanOptics製， USA， LS-l型) からの光がフローセルを通過し，透過光が紫外可視分光 光度計 (OceanOptics製， USA， USB 2000型)に導か れ，吸光度が検出される以上の SIA-LOYシステムは， す べ て コ ン ピ ュ ー タ ー に イ ン ス ト ー ノ レ さ れ て い る FIAlab Ins回 日nts製の制御プログラムにより自動的に 制御される. また，溶液の pHは堀場製作所製の pHメーター (F-22 型)を用いて部定した 2.2. 試 薬 試 薬 溶 液 の 調 製 及 び 希 釈 に 用 い た 水 は す べ て ADV，必.JTEC製の超純水製造装置 (GSH-210型)により 精製された超純水を用いた 鉄(III)標準溶液:原子吸光分析用の 1000ppm鉄標準 溶液(和光純薬製)を0.01M硝酸で適宜希釈して用い

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5-トリアジン(和光純試薬工業製，MW=312.33) 0.7808gを0.01M硫酸に溶解し，同濃度の硫酸で50mL に定容した.この原液を適宜希釈して用いた. 塩酸ヒドロキシルアミン溶液 (10%w/v) 塩酸ヒド ロキシルアミン(和光純薬工業製， HONH3C，l F W =

69.49) 1.0gを水で、溶解し， 10mLに定容した. 酢酸塩緩衝液:酢酸水溶液と酢酸ナトリウム水溶液を 適宜混合し3 目的のpH緩衝液を得た りん酸塩緩衝液:りん酸二水素ナトリウム水溶液とり ん酸水素二ナトリワム水溶液を適宜混合し，pH6.0の緩 衝液を得， pHの影響を検討する実験で使用した. 2.3. 標 準 操 作 SIAシステムの動作を Table1に示す.Fig. 1に示すよ うに， 6-SVポート lに 0.01Mの酢酸塩緩衝液 (pH4.0)， ポート 2に検出器，ポート 3に 0.01

M TPTZ

溶液，ポ ート 5に鉄(III)標準溶液3 ボート 6に 10%w/v塩酸ヒド ロキシルアミン溶液をセットし，シリンジポンプにより 吸引・吐出の操作を行った. 最初に，シリンジポンプ上部の 2-SVをキャリアーの 水を吸引する方向に切り替え，シリンジポンプ内に水を 吸引する.次に 2-SVを

HC

側に切り替え，

HC

および 検出器に繋がるポート 2への流路内を洗浄する.次に， 6-SVを逐次切り替えながら，シソンジポンプの下方向 の動作により，酢酸塩緩衝液，塩酸ヒドロキシノレアミン，

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標準溶液の順に

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内へと吸引する この 際，

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内では各試薬と標準溶液が混合される.シリン ジポンプの上方向(吸引時とは逆方向)の動作により， 反応溶液を検出器へと送液し，吸収極大波長である 595 m における吸光度を観測することにより， SIAピーク を得た.

3

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結果と考察 3.1. 吸収スベクトル 鉄(III)は適切な還元剤の共存により鉄

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に還元され， この鉄

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は，

TPTZ

と 1:2組成の赤紫色のキレートを生 成する11) パッチマニュアル法により，このキレートの 吸収スベクトルを以下の手順で、測定した. 10ppmの鉄 (III)標準溶液 0，2， 4， 6， 8， 10 mLをそれぞれ 50mL メスフラスコにとり， 10 %w/vの塩酸ヒドロキシノレアミ ン溶液 1mL， 1 Mの酢酸塩緩衝液 (pH4

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_{溶 液 5mLを加えて，水で、 50mLに定} 容した.よく振り混ぜ、たのち，吸収スベクトノレを測定し た.結果を Fig.2に示すーこの結果より，以下の SIAに よる検討では，吸収極大波長である 595mにおける吸 光度を測定することとした. 3

ユ

各試薬と試料のHC内への吸引顕(シーケンス) の影響 HC 内に試薬と試料を吸引する順序についての検討 を 行 っ た 試 薬3種と試料の合計4つの溶液を吸引する ので，その組み合わせは24通りとなる これらすべて の検討結果をTable2に示す目その結果， 2ppmの鉄(III) を測定した際の吸光度と鉄(III)標準溶液の代わりに水 を用いる試薬空試験値との差 (net) が， Table 2内の(2) に示される"酢酸塩緩衝液，塩酸ヒドロキシノレアミン， TPTZ，鉄(III)標準溶液"の順に吸引した場合に最一大とな った.従って，以降の検討では， Fig.1の上部に示され るシーケンスを選択した. 3.3. pHの影響 吸引する酢酸塩緩衝液の pH を 3.5~6.0 の範囲で変化 させ， 2 ppmの鉄(III)を定量する際の吸光度への影響を 調べた.pH 3.5~5.5 は酢酸塩緩衝液を， pH 6.0はりん 酸塩緩衝液を用いて調整した.結果を Fig.3に示す.こ の結果より， netの値が最も高かった pH4.0を選択した. 3.4. TPTZ濃度の影響 吸引する

TPTZ

溶液の濃度を 0.001~0.02

M

の範囲で 変化させた.結果を Fig.4に示す. netの値は， 0.01M のときに最大となったので，

TPTZ

濃度は， 0.01

M

を選 択した. 3.5‘ TPTZ溶液の吸引体積の影響 吸引する TPTZ 溶液の体積を 50~200μL の範囲で変 化させた.結果を Fig.5に示す この結果より， netの 値が最も良好で、あった 150μLを選択した. 0.9 0.8

。

.7 350 4DO 450 500 550- -600 -50 6 7{){) 7SQ 800 -Wavelengthfnm -Fig. 2 Absorption spectra of iron(II)-TPTZ complexes.CFe(III) in ppm: (1)， 0; (2)， 0.4;(3)， 0.8; (4)， 1.2; (5)， 1.6; (6)， 2.0.CTPTZ， 2.5 X 10-3 M;

C

A田tateBuffer， 0.1 M (pH 4.5)， CHONH3Cb 1 %w/v.

50 愛知工業大学総合技術研究所研究報告，第14号， 2012年 Table 2 Absorbance values of various sequence for SIA determination of iron(III)

0.7 0.6 E Z55 σ3 ul 百0.4 U U f f i0.3 A 』 ~ 0.2 .0 <(0.1

。

Sequence of aspiration (l)Buffer-TPTZ-Std. -HONH3Cl (2)Buffer-TPTZ-HONH3Cl-Std. (3)Buffer-Std.ーHONH3CI-TPTZ (4)Buffer-Std. -TPTZ-HONH3Cl (5)Buffer-HONH3CI-TPTZ-Std. (6)Buf

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HONH3Cl-Std. -TPTZ (7)TPTZ目Std.-HONH3CI-Buffer (8)TPTZ-Std.ーBuffer-HONH3Cl (9)TPTZ-HONH3Cl-Buffer-Std. (10)TPTZ-HONH3Cl-Std. -Buffer (ll)TPTZ-Buffer-Std. -HONH3Cl

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2)TPTZ-Buffer-HONH3Cl-Std. (13)Std. -HONH3Cl-Buffer-TPTZ (14)Std. -HONH3CI-TPTZ-Buffer

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5)Std. -Buffer-TPTZ-HONH3Cl (16)Std.-Buffer目HONHsCI-TPTZ (17)Std-TPTZ-HONHsCI-Buffer (18)Std.ーTPTZ-Buffer-HONHsCl (19)HONHsCl-Buffer-TPTZ-Std. (20)HONHsCl-Buffer-Std.-TPTZ (21)HONHsCI-TPTZ-Std.-Buffer (22)HONHsCI-TPTZ-Buffer-Std. (23)HONHsCl-Std. -Buffer-TPTZ (24)HONHsCl-Std. -TPTZ-Buffer 3 4 5 6 pH Fig. 3 Effect of pH on the absorbance. 2.0 ppm Fe(III) 0.0157:l::0.000212 0.563土0.00610 0.127土0.00108 0.0626土0.000429 0.0455土0.000485 0.186土0.00126 0.0780土0.000173 0.0270士0.000418 0.0348土0.000722 0.0828士0.000318 0.0838土0.00269 0.0624士0.001335 0.0446土0.00296 0.0772土0.000907 0.186土0.00448 0.0464:l::0.000565 0.0539士0.000821 0.0415土0.000295 0.0836土0.00135 0.0692:l::0.000551 0.0605土0.000343 0.0758士0.000473 0.0663土0.00217 0.0740土0.000416 blank net 0.144土0.00646 0.128土0.00665 0.0103土0.000372 0.552士0.00574 0.0275土0.000396 0.0994土0.00095 0.0438士0.000709 0.0188土0.000285 0.0235土0.000495 0.0220土0.000505 0.0220土0.000113 0.164士0.00135 0.00830土0.000626 0.0697土0.000492 0.0186土0.000153 0.00844土0.00844 0.0104土0.0000702 0.0244土0.000654 0.0359土0.000404 0.0469土0.000715 0.0265土0.000547 0.0573土0.00324 0.0128土0.000569 0.0496土0.00135 0.0296土0.000423 0.0150:l::0.00382 0.00608土0.000159 0.0712士0.00104 0.0177土0.000257 0.169:l::0.00458 0.0298士0.000323 0.0165土0.000529 0.0122:l::0.0000337 0.0418土0.000794 0.0125土0.00117 0.0290土0.00131 0.034HO.000838 0.0495士0.000516 0.0323土0.00252 0.0369土0.00306 0.00552士0.000278 0.0550土0.000292 0.0199土0.000153 0.0503土0.000436 0.0113土0.000153 0.0550:l::0.000689 0.0100土0.000450 0.0640土0.000798 。 司5 0.45 EE臼A 凶 CU33 935 糧 自3 a 署

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o 20 40 60 80 100 120 Volurγ目。firon(IIIJI !ll Fig. 7 Effect of aspiration volume of iron(III) standard solution. 3.6. 酢酸塩緩衝液の吸引体績の影響 吸引する酢酸塩緩衝液の体積を 150~400μL の範囲 で変化させた.結果をFig.6に示す.この結果より， 250 μLを選択した. 3.7‘ 鉄'(111)標準溶液の吸引体積の影響 吸引する鉄(III)標準溶液の体積を1O ~100μL の範囲 で変化させた.結果をFig.7に 示 す 吸 引 体 積 が75μL を超えると， net値が減少したので，鉄(III)教授ン溶液 の吸引体積として75μLを選択した. 3.8. 検量線 以上の最適条件下において，鉄(III)の濃度を変化させ

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シグナノレを得た

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、ングFナノレの吸光度を鉄(ill)濃 度に対しプロットし，検量線を作成したところ，鉄(III) 濃度が 0~2.0 ppmの範囲で，相関係数0.999と直線性 の良好な結果が得られた 1時間当たり 24検体の測定 が可能である. 4.結 言 ここで堤唱した SIAは， 1田の定量に必要な試薬と試 料の数百μLをHCに吸引し，逆方向へ吐出する際に試 薬と試料が混合され，検出器に導入される方法である. この操作は全てPCで制御されるため， FIAと違い全自 動化されており，人為的誤差は極めて少ない.TPTZの SIAへの導入は初めてであり，独自のプロトコールを提 案 し た 本 法 は3 環境・生体試料への多検体分析に有用 である. 文 献 1)刈米重夫，日本臨休 ('85年秋季増刊)43 (1985) 532 2)松尾収二監修，前川芳明編集

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改訂3版臨床検査デ ィクショナリーヘp.l11ラ(2004)，(メディカ出版) 3)J.Ruzicka， E. H. Hansen， Anal.Chim. Acta 78 (1975) 145. 4) S. Gotoh， N. Teshima， T. SakaiラK.Ida， N. Ura: Anal. Chim. Acta， 499， 91 (2003). 5) N. Teshima， S. Gotoh， K. Ida， T.Sakai: Anal. Chim. Acta， 557ヲ387(2006). 6)J.Ruzicka， G. D. Marshall， Anal.Chim. Acta 237 (1990) 329 7)酒井忠雄，手嶋紀雄，ぶんせき 2001(2001) 289. 8) T. Sakai， N. Teshima， Anal.Sci. 24 (2008) 855 9)手嶋紀雄，酒井忠雄，ぶんせき 2010(2010) 281. 10) J. Ruzicka， Analyst 125 (2000) 1053. 11) P. F. Collins， H. Diehl， G. F. Smith， Anal.Chem 31 (1959) 1862.