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A Method for Calibration of the Counts by an Automatic Colony Counter for Mutagenicity Assay Hidetsuru MATSUSHITA*, Sumio GOTO*, Masahiro MORITA** and

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大 気 汚 染 学 会 誌J

. Japan Soc. Air Pollut. 17 (3) 177∼186 (1982)

変 異 原 性 試 験 用 自動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー

計 測 値 の 補 正 方 法 に 関 す る研 究

鶴*・ 後

藤 純

雄*

昌 宏**・林

児**

A Method

for Calibration

of the Counts by an Automatic

Colony Counter for Mutagenicity

Assay

Hidetsuru MATSUSHITA*,

Sumio GOTO*,

Masahiro MORITA** and Kenji HAYASHI**

大 気浮 遊 粉 じん な どの環 境 試 料 の変 異 原 性 を 求 め るに は,多 くの プ レー ト上 に 出現 した コ ロ ニー を 数 え る必要 が あ る。 こ の計 数 に は 莫 大 な 時 間 を 要 し,こ の 難 点 を 解 消 す るた めに 自動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー が 開発 され て い る。 しか し,市 販 の 自動 コ ロ ニ ー カウ ン ター に よ る コ ロニ ー計 数 値 は 肉 眼 に よ る場 合 と 異 な る値 を 与 え,こ の計 数 誤 差 は コ ロニ ー数 が 増 加 す るに つ れ て 大 き くな る傾 向が 認 め られ る。 これ ら の原 因 と して は,1)自 動 コ ロニ ー カ ウ ン タ ーは プ レー ト上 の重 な り合 った コ ロニ ーを1つ と数 え る, 2)コ ロニ ー数 が 増 加 す るに 伴 な い,コ ロ ニ ー粒 径 が 小 さ くな り,自 動 コ ロニ ー カ ウ ン タ ー の感 度 が 低 い 値 に 設定 され て い る場 合に は,設 定 され た 大 き さ以 下 の小 さな コ ロ ニー を検 出す る こ とが 出来 な い, こ とが 主 な 原 因 で あ る こ とが判 った 。 第1の 問 題 に つ い て は,100か ら2,000個 まで の コ ロニ ーが そ れ ぞ れ プ レー トに 一 様 に分 布 して い る と仮 定 した モ ン テ カル ロ法 に よ るシ ミュ レー シ ョンか ら,単 独 で 存 在 す る コ ロ ニ ーお よび2,3,4,…,n 個 の コ ロ ニ ーが 重 な り合 って存 在 す る数 の 出現 確 率 を 算 出す る こ とに よ り解 決 した 。 こ こで,シ ミュ レ ー シ ョンに 必 要 な コ ロ ニ ーの粒 径 は コ ロニ ー数 の 関 数 と して 実 験 値 よ り求 め た 。 算 出 され た確 率 の 関数 を 用 い て,自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー計数 値 を 目視 コ ロユ ー数 に 換 算 で き る補 正 式 を 導 い た 。 第2の 問 題 は,コ ロ ニ ー数 に 応 じて,自 動 コ ロニ ー カ ウ ン タ ー の 感 度 を 変 化 させ て測 定 す る こ とに よ り解 決 した 。 す なわ ち,コ ロ ニ ー数1,000個 まで は 中程 度 の 感 度 で,ま た,1,000個 以 上 で は よ り高 い 感 度 で計 数 す る と良 好 な 値 が 得 られ る こ とが 判 った。 これ らの事 か ら,作 成 した 補 正 式 と プ レー ト上 の コ ロニ ー の 検 出に 適 した 感 度 の選 択 とを 組 み 合 わ せ る こ とに よ り,自 動 コ ロニ ー カ ウ ン ターに よ る計 数 値 を 通 常 の 目視 コ ロニ ー数 と同 等 の値 に 良 好 に 換 算 で き る こ とが 判 った 。 1.  緒 言 大 気 浮 遊 粉 じん な どの 環 境 試料 の変 異 原 性 を モ ニ タ リ ン グす るた め に は,多 数 の 地 点 で定 期 的 に 浮遊 粉 じん を 採 取 し,こ れ ら の変 異 原 性 を 規 格 化 され た 方 法 で測 定 す る必 要 が あ る。 変 異 原 性 試 験 法 は 微 生物 を用 い るた め一 般 に,化 学 計 測 法 と比 べ て 再 現 性 が 悪 い 。 した が って, 被 験試 料 の変 異 原 性 は試 験 プ レー トへ の投 与 量 を 数 段 階 変 え て得 た試 験 の結 果 か ら求 め られ てお り,ま た,1つ の 試 料 に つ い て 代 謝活 性 化 した 場 合 と しな い 場 合 の変 異 原 性 試 験 を,通 常2∼3種 類 の菌 株 につ い て行 ってい る。 こ のた め,多 数 の 浮遊 粉 じん試 料 の変 異 原 性 を求 め るに は 非 常 に 数 多 くの試 験 プ レ ー トが 必 要 とな る。 これ に 対 して,試 験 プ レー トに 出現 した コ ロ ニー の 計数 は 通常, *国 立公衆衛生院地域環 境衛生学部 東京都港区白金 台4-6-1 **東 京理科大学理学部応用数学科 東京都新宿区神楽坂1-3

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178 大 気 汚 染 学 会 誌 第17巻 第3号 (1982) 肉 眼 に よ り行 わ れ てい るた め,こ れ に 要 す る 時 間 は莫 大 な も の とな る。 例 えば,肉 眼 で 通 常 の プ レ ー ト上 の 1,000個 の コ ロ ニ ーを 計 数 す るに は 熟練 した 人 で も約5 分 を 要 す るか ら,こ の よ うな プ レー ト100枚 を 計 測 す る の に8時 間 以 上 か か る こ とに な る。 最 近,こ の よ うな 手 間 を 省 くた め の 装 置 と して,自 動 コ ロ ニー カウ ンタ ーが 市販 され る よ うに な った 。 しか し,本 装 置 は コ ロニ ー数 が 増 加 す るに つ れ て 目視 で の 計数 値 との差 が ひ ら く欠 点 を 有 して い る。 この よ うな 計数 誤 差 の補 正 に関 しては 直 線 回 帰 補 正 が な され て お り,主 と して コ ロニ ー数 の少 な い 場 合 に 適 用 され て い る1,2,3,4)。また,コ ロニ ー数 の多 い 場 合(約2,000個 まで),長 焦 点 レン ズ を用 い て プ レ ー ト面 の 一 部 を拡 大 して 直線 回 帰 補正 す る方 法 も報 告 さ れ て い る5)。し か し,こ の 方 法 で は プ レー ト面 のあ る一 部 の み を拡 大 す るた め,菌 の まき 方に よる コ ロニ ー発 生 のわ ず か な片 寄 りで も大 き な計 数 誤 差 を 生 じや す い 。 ま た,被 験 プ レー トに は コ ロニ ー数 の多 い も のや 少 な い も のが 入 り混 じ って い るた め,被 験 プ レー トに よ っ て レン ズ の交 換 が 必 要 とな り,操 作が 煩 雑 に な る とい う難 点 が あ る。 現 在,サ ル モ ネ ラ菌 を用 い る変 異 原 性 試 験 法 は 広 く一 般 に 用 い られ て お り,こ の試 験 に よ る プ レー ト上 の コ ロ ニ ー数 は しば しば1,000個 を越 え る。 こ の よ うな コ ロ ニ ー数 の多 数 の プ レー トの計 数 に ,自 動 コ ロ ニ ー カウ ン タ ーを 導 入 す るた め に は,上 記 の難 点 を 解 消 す る手 法 の開 発 が 必 要 であ る。 そ こで,本 研 究 で は,変 異 原 性試 験 に お け る コ ロ ニ ー計 数 を よ り簡 易 に 短 時 間 で 行 い得 る方法 を 作 成 す る 目的 で,自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン ター に標 準 レ ン ズ を 用 い た 場 合 の計 数 値 の 補 正 法 に つ い て検 討 した 。す な わ ち,ま ず,自 動 計 数 値 と 目視 コ ロ ニ ー数 との相 異 の 原 因 を 調 べ,そ の 主 因 の 一 つ と考 え られ た コ ロ ニー の重 な りの 補 正 方 法 を コ ン ピ ュ ー タ ー ・シ ミュ レー シ ョ ンに よ り検 討 す る と共 に,コ ロ ニ ー数 増大 に伴 う検 出感 度 の 変 化 を も考 慮 に 入 れ た 補 正 方 法 の 作成 に つ とめ た。 そ の 結 果,実 用 に 耐 え うる補 正 方 法 を 見 出 した の で こ こに報 告 す る。 2.  実 験 方 法 2.1  試験 プ レ ー ト(寒 天 平 板培 地)の 作 製 シ ャ ー レは,和 光純 薬 工 業 製(内 径:86mm)お よび Falcon社 製(内 径:88mm)の γ線 照 射 滅菌 済 の も の を用 い た。 高 圧 蒸 気 滅 菌 したVogel-Bonnerの 最 少 培 地E,グ ル コ ース2%,寒 天1.5%を 加 え て 混 合 し,こ れ を シ ャー レに30mlず つ 分 注 して 冷却 固 化 させ,試 験 プ レー トを 作 製 した 。 2.2  変 異 原 性 試 験

変 異 原 性 試 験 は,Salmonella typhimurium TA100お よ びTA98株6)を 用 い,プ レイ ンキ ュベ ー シ ョン法 で行 っ た7)。 す な わ ち,変 異 原 性 物 質(主 にbenzo (a) pyrene お よび2-nitrofluorenc)を 入 れ た 滅菌 試 験管 にS-9mix8) 500μl又 はNa-リ ン酸 緩 衝 液500μlを 加 え,サ ル モ ネ ラ菌 の培 養 液100μl(菌 数:約1×108)を 加 え,37℃ で 20分 間 恒 温 水 槽 で 振 盪 しなが らプ レイ ン キ ュ ベ ー シ ョン した 。 そ の後,45℃ に 保温 した ソ フ トア ガ ー2mlを 加 え て 混 合 し,こ れ を試 験 プ レー ト上 に 注 い でか ら,一 様 に 広 げ,37℃ で48時 間 イ ンキ ュベ ー トした 。 以 上 の操 作 に よ りプ レー ト上 に 出現 した復 帰変 異 株 の コ ロニ ー数 を, 肉 眼 お よび 自動 コ ロニ ー カ ウ ンタ ーに よ り計 数 した 。 2.3  自動 コ ロニ ー カ ウ ン タ ー 変 異 原 性 試 験 に よ り出現 した 復 帰 変 異 株 の コ ロ ニ ー数, 全 コ ロ ニ ーの表 面 積 お よび測 定 面 積 の 自動 計 測 に は,東 洋 測 器 社 製 コ ロニ ー ア ナ ライ ザ ーCA-7A型(以 後CA-7A型 と略 す)並 び にArtck Systcm社 製 モ デ ル880型 (以後Artek 880型 と略 す)の2機 種 の 自動 コ ロニ ー カ ウ ンタ ー を使 用 した 。 レン ズ と し ては,そ れ ぞ れ の機 種 に 備 え 付 け の標 準 レ ンズ(50mm)を 用 い た 。 2.4  コ ン ピ ュー タ シ ミ ュ レー シ ョン コ ン ピ ュー タ シ ミュ レー シ ョンは,コ ロ ニー 数 とそ の 粒 径 関 係 の実 験 的 デ ー タを 考 慮 に 入 れ,一 様乱 数 を用 い た モ ン テ カ ル ロ法9)に よ る統 計 的 な 方法 に よっ て,一 定 面 積 内に 所 定 の コ ロ ニ ーを 分 散 させ た時,単 独 で存 在 す る コ ロニ ー の数,お よび2個,3個,… …,n個 重 な り 合 って存 在 す る コ ロニ ー の数 をIBM3031型 プ ロ セ ッサ ー で算 出 した 。 3.  結 果 お よ び 考 察 3.1  自動 コ ロニ ー カ ウ ン タ ー 計数 値 と 目視 コ ロ ニー 数 との 比 較 自動 コ ロ ニ ー カ ウ ン ター を用 い て試 験 プ レー ト全 面 を 測 定 す る と,シ ャ ー レ外 壁 の反 射 光が 影 響 し,正 確 な 計 数 が 不 可 能 とな る。 この た め,自 動 コロ ニ ー カ ウ ン タ ー に よ る コ ロ ニー計 数 は通 常 次 の よ うに 行 っ てい る。 す な わ ち,ま ず 測定 部分 を試 験 プ レー ト内に 設 定 して,そ の 部 分 の コ ロニ ー数 と面 積 を測 定 す る。 次 に 試 験 プ レー ト 全 体 の 面 積 を 求 め,こ れ と測 定 部 分 の面 積 よ り視 野 率 を 算 出 し,こ の 視 野 率 よ り 自動 計 数 値 を 補 正 し,試 験 プ レ ー ト中 の 全 ゴ ロ ニー数 を求 め る。 Fig.1は,目 視 コ ロニ ー数 と,通 常 の視 野 率 補 正 に よ る 自動 計 数 値 との 関 係 を調 べ た 結 果 を 示 した も ので あ る。 こ こに は,CA-7A型 に よる 実 測 値(感 度:slope3)と

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大 気 汚 染 学 会 誌 第17巻 第3号 (1982)

Fig. 1. Difference between visual count and ordi-nary calibrated instrumental count.

通 常 の視 野 率 補 正 値(視 野 率:0.748)と に 対 す る 目視 コロ ニ ー数 の関 係 が 示 し てあ る。Fig.1か ら,通 常 行 わ れ て い る視 野 率 補 正 を 加 え て も,目 視 コ ロ ニ ー数 との相 異 は,コ ロニ ー数 が 増 加 す るに 伴 い大 き くな る傾 向 が認 め られ る。 一般 に ,試 験 プ レー ト内に 発 生 した コ ロニ ーの 中 に は 単 独 で 存 在 す る もの の ほ か,2つ3つ 又 はそ れ 以 上 の コ ロ ニ ーが 重 な って 存在 す る場 合 が認 め られ る。 これ ら重 な り合 った コ ロ ニ ーは,肉 眼 で は それ ぞれ 識 別 出来 る の に 対 し て,自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ーで は識 別 出来 な い。 こ の事 がFig.1に 示 した 肉 眼 実 測 と 自動 計測 と の 相 異 の主 な 原 因 の一 つ と考 え られ る。 そ こで,こ の よ うな コ ロ ニ ー の重 な り度 合 を コ ン ピ ュ ー タに よ り求 め,こ れ を 用 い て補 正 す れ ば よ り真 に 近 い 値 が 得 られ る もの と考 え られ た 。 3.2  シ ミ ュレー シ ョン に よ る補 正 方 法 の 検 討 試 験 プ レー ト内 に発 生 した コ ロニ ー重 な り度 合 を 統 計 的 に信 頼 出 来 る平 均 値 と して見 積 るた めに,以 下 に のべ るモ ン テ カル ロ法 に よ り,モ デ ル コ ロニ ー を モ デ ル プ レ ー ト内 に発 生 させ,モ デ ル コ ロニ ー の重 な り度 合 を コン ピ ュ ー タ ーに よ り算 出 した 。 3.2.1  コ ロ ニ ー発 生 の モ デ ル化 お よび一 様 乱 数 の作 成 と検定 変 異 原 性 試 験 に よ りプ レー ト内 に発 生 した コ ロニ ー の 重 な りを モ ン テ カル ロ法 に よ りシ ミュ レ ーシ ョ ンす る場 合,実 験 事 実 を 考 慮 して 次 の仮定 を し,コロ ニ ー発 生 に

Fig. 2. Relation between average diameter of colonies and visual count.

対 す る モ デ リ ン グ を 行 った 。 i)サ ル モ ネ ラ 菌(His:約1×108個)は プ レ ー ト上 に 一 様 に 分 布 し て い る。 ii)突 然 変 異 を 起 こ し てHis+と な っ た 菌 に よ る コ ロ ニ ー は,サ ル モ ネ ラ 菌(Hisつ の 中 か ら ラ ン ダ ム に 発 生 す る 。 迩)His+菌 に よ り形 成 さ れ た コ ロ ニ ー は 円 形 で あ る 。 以 上 の 仮 定 を 用 い,モ ン テ カ ル ロ 法 で コ ロ ニ ー の 重 な りを シ ミ ュ レ ー シ ョ ン す る 場 合 に は,ま ず コ ロ ニ ー の 座 標 を 定 め る た め の 一 様 乱 数 が 必 要 とな る 。 こ の 一 様 乱 数 Yi[0,1]の 作 成 は 式(1)に 示 した 混 合 合 同 法 に よ る 算 術 乱 数10)を 用 い た 。 ま た,乱 数 列 の 検 定 は,式(2)に 示 し た 頻 度 検 定 法10)を 用 い て 行 っ た 。 す な わ ち,有 意 水 準5 %〔xg2(9,0.05)=16.92〕 以 上 の 値,お よび0に 近 い 値 (0.5)を 破 棄 す る こ と に よ っ て 局 所 ラ ン ダ ム 性 の 検 定 を 行 っ た 。

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Xi:0∼2147483647ま で の乱 数 値;X0:奇 数 の初 期 値;a,b:正 の任 意 の 定 数(奇 数); 宏 乱 数 列 の数;Rc:正 の 整 数 の 最大 値

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Fi:理 論 度 数;fi:〔0,1〕 をm等 分 し た 時 の それ ぞれ の区 間 の実 現 度 数 3.2.2  数 値 実 験 円 形 プ レ ー ト(半 径rm/m)の 中 心 を2次 元 座 標(ξ, η)の 中 心 に と り,3.2.1で 求 め た 検 定 済 み の 乱 数 を, 区 間[-r,r]に 正 規 化 し,ξ,η 座 標 に 対 し,別 々 の 乱

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180 大 気 汚 染 学 会 誌 第17巻 第3号 (1982)

Fig. 3. Block diagram of simulation by MonteCarlo method with computer.

数 を 発 生 さ せ ξi2+ηi2≦r2な る 円 内 の 条 件 を 満 足 す る 一 対 の 乱 数 を 作 り,こ れ を 用 い て モ デ ル コ ロ ニ ー の 位 置 (ξi,ηi)を 定 め る 。 た だ し,i=1,2,3,…,nで,こ れ は プ レ ー ト内 の コ ロ ニ ー の 番 号 を 示 す 。 ま た 本 実 験 で は コ ロ ニ ー の 発 生 総 数nは100,200,300,… …,2,000と し た 。 こ の よ うに し て 位 置 の 定 め られ た モ デ ル コ ロ ニ ー に は, そ の 粒 径(dn)と し て,次 の 実 験 に よ る 実 測 値 の 平 均 値 を 与 え た 。 す な わ ち,変 異 原 性 試 験 に よ り発 生 さ せ た 試 験 プ レ ー ト内 の 復 帰 変 異 コ ロ ニ ー の 総 コ ロ ニ ー 面 積 を 自動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー(感 度:slope3)で 求 め る と 共 に,コ ロ ニ ー 数 を 肉 眼 で 計 測 し,両 測 定 値 か ら コ ロ ニ ー1個 当 た り の 平 均 粒 径 を 求 め る 作 業 を 種 々 の 試 験 プ レ ー トに つ い て 行 い,コ ロ ニ ー の 数 と 平 均 粒 径 と の 関 係 を グ ラ フ上 に プ ロッ ト し た 。Fig.2に そ の 結 果 を 示 す 。 コ ン ピ ュ ー タ ー に は 実 測 値 を ス ム ー ジ ン グ し た 値,す な わ ちFig.2の 点 線 に 対 応 す る 値 を コ ロ ニ ー 粒 径(dn)と し て 与 え た 。 以 上 の 操 作 に よ り 円 形 プ レ ー ト内 に 発 生 さ せ たn個 の コ ロ ニ ー 〔gi(ξi,ηi,dn);i=1,2,…,n〕 の うち 任 意 の2 個 の コ ロ ニー(gs,gt)が 重 な る 条 件 を 式(3)で 判 定 し た 。

(3)

コ ロ ニ ー の 重 な り をn個 の す べ て の コ ロ ニ ー の 組 合 せ に 対 し て 判 定 し,コ ロ ニ ー が 単 独 で 存 在 す る数(N1), 2個 重 な っ た 数(N2),お よ びk個 重 な っ た 数(k=3,4, … ,k)Nkを 求 め た 。Fig.3に は そ の 計 算 手 順 を 示 す ブ ロ ッ ク ダ イ ヤ グ ラ ム を 示 した 。

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大 気 汚 染 学会 誌 第17巻 第3号 (1982)

Nt N1 N2

Fig. 4. Appearance frequency of N1, N2 and Nt in a plate containing 2000 colonies which are obtained by the 150 times computer simulations.

Fig.4は,モ デ ル コ ロ ニ ー 数 を2,000と し,モ ン テ カ ル ロ法 に よ る 数 値 実 験 を150回 繰 返 し て 行 っ た と き に 得 られ たN1,N2お よ びNtに 対 す る 度 数 分 布 を ヒ ス トグ ラ ム で 示 した も の で あ る 。 こ こ で,Ntは 単 独 お よ び 重 な り合 っ て 存 在 す る コ ロ ニ ー の 総 計(N1+N2+N3+…) を 示 す 。 こ のNtは,試 験 プ レ ー ト内 の2,000個 の コ ロ ニ ー の うち,相 互 に 重 な り合 っ て い る コ ロ ニ ー は 自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー で は1つ と 計 測 し,か つ コ ロ ニ ー の 重 な りは ラ ン ダ ム に 発 生 す る と し た 場 合 の 数 とそ の 分 布 に 相 当 す る 。 モ ン テ カ ル ロ 法 に よ る 数 値 実 験 を,モ デ ル コ ロ ニ ー 数 100,200,300,…,2,000個 に 対 し て,そ れ ぞ れ150回 ず つ 繰 返 し て 行 っ た 結 果 をTable1に ま と め て 示 す 。 こ こ に は,Nt,N1,N2… の 数 の 平 均 値 と 標 準 偏 差 を 示 し て あ る 。 ま た,Fig.5に はNt,N1,N2,N3お よ びN4 の 数 の 平 均 値 と モ デ ル コ ロ ニ ー 数 と の 関 係 を 示 す 。 Tablelお よ びFig.5よ り,モ デ ル コ ロ ニ ー 数 を 増 加 さ せ る と,コ ロ ニ ー 同 士 の 接 触 数 が 増 し,そ の た めNt の 数 と モ デ ル コ ロ ニ ー 数 の 差 が 増 加 す る こ と が 判 る 。 Ntの 数 とFig.1に 示 し た 自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー に よ る 通 常 の 視 野 率 補 正 計 数 値 と の 関 係 をFig.6に 示 す 。 こ こ で は,モ デ ル コ ロ ニ ー 数 は 目視 コ ロ ニ-数 と 同 じ で あ る と仮 定 し てNtをFig.5か ら 求 め た 。Fig.6か ら, 通 常 の 視 野 率 補 正 計 数 値 と 現 の 数 は ほ ぼ 一 致 し た 値 を 示 す こ と が 判 る。 以 上 の 事 実 は,自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー の 主 な 計 数 誤

Fig. 5. Relation between numbers of input colonies and average numbers of N1, N2, N3, N4 and Nt which are obtained by the MonteCarlo simulation.

差 は コ ロニ ー の重 な りに よ る こ とを 強 く示 唆 す る と共 に,コ ン ピュ ー タ シ ミュ レー シ ョンを用 い て 自動 コロ ニ ー カ ウン タ ー計 数 値 を 補 正 す る こ とが 可 能 で あ る事 を示 して い る。

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182 大 気 汚 染 学 会 誌 第17巻 第3号 (1982)

Table 1. Numbers of single colobies and clusters of colonies which are obtained by the MonteCarlo simulation.

3.3  補 正 式 の 作 成 お よび そ の 検 討 自動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー計 数 値 か ら 目視 コ ロ ニー数 を 求 め るた め に は,Fig.5のNtの 曲 線 を用 い て 換 算 して も よいが,補 正 式 を 作成 し,こ れ を用 い て電 子 卓 上 計 算 機 な ど に よ り算 出 した ほ うが は るか に能 率 的 で実 用 的 で あ る。 そ こで,こ の 補 正 式 の作 成 方 法 の検 討 を行 った 。 3.3.1  補 正 式 の作 成 補 正 式 の 作 成 に あ た って,直 接Nt曲 線 か らモ デ ル コ ロ ニ ー数 を 求 め る 近 似 式 を 導 き 出 す こ とが 困難 で あ っ た た め,統 計 的 見 地 か ら,確 率Pを 用 い る方 法 を 検 討 し た 。 す な わ ち,コ ロ ニ ーの重 な りに対 す る確 率Pは 次 式 (4)で 示 され る。

(4)

こ こ でNj,nはn個 の コ ロ ニ ー を 発 生 さ せ た と きj個 重 な り合 っ た コ ロ ニ ー の 数 で あ り,Nt,nはFig.5のNt

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Table 2. Reliability of the calibration equation.

Fig. 6. Relation between ordinary calibrated instrumental count and Nt.

の数 に相 当す る。 この確 率Pj(n)とPt(n)を 発 生 コ ロ ニー数 に対 して プ ロ ッ トす る とFig.7が 得 られ る。Fig.7か ら発 生 コ ロニ ー数500以 下 と500以 上 で はPt(n)曲 線 の パ タ ー ンが 異 な り,前 者 は 指 数 近 似,後 者 は 直線 近 似 出 来 る こ とが 判 る。 そ こ で,次 式(5)に よ る最 小 自乗 法 を こ ころ み 実 験 式 を 求 め た 。

(5)

こ こ で,nは 発 生 さ せ た コ ロ ニ ー 数 で あ る 。 最 小 自乗 法 に よ る 係 数 α,β は そ れ ぞ れ αI=0.985, βI=-1.57× 10-4お よ び αII=-7.895×10-5,βIi=0.95が 得 られ た 。 こ の 実 験 式 を 用 い て,自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー 計 数 値 か ら 目視 コ ロ ニ ー 数 を 算 出 す る 補 正 式(6)を 導 き だ し た 。 こ の 時n=500以 下 の 場 合 は 指 数 関 数 で 表 示 さ れ て い る の で,n=500以 上 の 場 合 の 関 数 の タ イ プ に 統 一 す る た め に テ ー ラ ー 展 開 し,βI2≪1か ら 第2頃 以 下 を 無 視 し た 。 ま た,自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー 計 数 値 か ら 目 視 コ ロ ニ ー 数 を 算 出 し う る よ うに,目 視 コ ロ ニ ーに 対 し て 陽 関 数 と し 更 に,自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー の 視 野 率 の 変 動 を 考 慮 し て 補 正 式(6)を 求 め た 。

(6)

こ こでkは 視 野 率,xは 自動 コ ロ ニー カ ウ ンタ ー計 数 値 で,x/kはFig.6のNtnに 相 当す る,ま たyは 算 出 した 目視 コ ロニ ー数 であ る。 3.3.2  補 正 式 の検 討 モ デ ル コ ロ ニ ー数(目 視 コ ロ ニ ー数 に相 当)を 補 正 式 (6)か ら正 し く算 出 出来 るか否 か を調 べ た 。 す なわ ち,

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184 大 気 汚 染 学会 誌 第17巻 第3号 (1982)

Fig. 7. Appearance probability of colonies in each state versus number of input colonies in the MonteCarlo simulation.

Fig. 8 Relation between visual counts and instru-mental counts calibrated by the present

cali-bration equation.

Instrument: Colony Analyzer CA-7A; sense 3.

モ ンテ カ ル ロ数 に よ るNtの 数 を 式(6)のxに 代 入 し, これ よ り得 られ たyを モ デ ル コ ロニ ー数 と比 較 した 。 そ の結 果 をTable2に 示 す 。 Table2か ら,補 正 式(6)か ら求 めた 補 正 値 は モデ ル コ ロ ニ ー数 に対 して す べ て1%以 内 に あ る こ とが 判 る。 一方 ,モ ン テ カル ロ法 に よ って 得 られ たFig.5中 のNt の数 は 平 均 値 で あ り,こ の 値 はTable1に 示 す ご と く 常 に 統 計 的 変 動 を伴 な っ て い る。 こ の 変 動 はTable1 に 示 した 平均 値Ntと 標 準 偏 差 σtの値 か ら判 る よ うに か な り小 さ い。 例 え ば,n=2000の 場 合,平 均 値 か ら

Fig. 9. Effect of sensitivity on the calibrated instru-mental count. ±5%以 内 の計 数 値 は 数 値 実 験 試 行 回数150回 の うち97 %以 上 の割 合 で 出現 す る こ とが 判 る。 これ らの結 果 か ら,補 正 式(6)は 自動 コ ロ ニー カ ウ ン ター の補 正 に有 用 であ る と考 え られ る。 3.4  補 正 式 の 実 測値 へ の 適 用 補 正 式 の 有用 性 を検 討 す るた め に,補 正 式(6)を プ ロ グ ラ ム電 子 卓 上 計 算機 に 入 れ,こ れ を 用 い てFig.1に 示 した 自動 コ ロニー カ ウン タ ー計 数 値 を 補 正 して み た 。 そ の結 果 をFig.8に 示 す。Fig.8か ら,補 正 値 は,計

(9)

rig. 10. Relation between visual counts and the in-strumental counts calibrated by the present method. 数 値 の大 きな 部 分 で 若 干 目視 値 よ り低 い 値 を 与 え るが, こ の 図 とFig.1と の対 比 か ら 通 常 の視 野 率補 正 値 の場 合 よ り大 幅 な 改 善 が な され て い る こ とが 判 る。 特 に,コ ロ ニ ー数1,000以 下 の場 合,式(6)に よ る補正 は十 分 使 用 し うる と判 断 され た 。 一方,コ ロ ニ ー数 が1 ,000以 上 の 場 合 の 補正 値 が 目視 コ ロ ニ ー数 よ り若 干 低 い 値 を 与 え た 原 因 を種 々 検 討 した 結 果,コ ロニ ー カ ウ ン タ ー の検 出 感 度 の影 響 が大 きい と 推 定 され た 。 何 故 な ら,現 実 の コ ロ ニ ーは 半 球 状 で あ り, そ の径 は コ ロニ ー数 が 増 す に つ れ て小 さ くな るか ら吸 光 度 は コ ロニ ー数 が 大 き くな るほ ど減 少 し,ブ ラ ン ク との 差 が 小 さ くな り,小 さな コ ロ ニ ーは カ ウ ン トしな くな る 可 能 性 が あ るた め であ る。 そ こで,式(6)に よ る補 正 値 に 及 ぼ す 自動 コ ロ ニー カ ウ ン タ ー の感 度 の影 響 を 調 べ た 。そ の結 果 をFig.9に 示 す 。Fig.9か ら,自 動 コ ロニ ー カ ウン タ ー の感 度 を 上 げ る と コ ロ ニ ー計 数 値 が 増 加 す る こ とが 判 る。 また,コ ロ ニ ー数1,000付 近 まで はslope3で の補 正 値 が 肉眼 に よ る計 数値 と よ く一 致 し,コ ロ ニ ー数1,000付 近 以 上 で はslope2で の 補正 値 が最 も良 い結 果 を あ た え る こ とが 判 る。 こ の結 果 を 確 か め るた め に,変 異 原 性 試 験 を 行 った 多 数 の プ レー ト上 の復 帰 変 異 コ ロ ニ ー数 を 肉 眼 で 計 測 す る と共 に,CA-7A型 自動 コ ロニ ー カ ウ ン タ ー を用 い て, コ ロニ ー数1,000ま で はslope3,そ れ 以 上 で はslope2 で計 数 し,こ の値 を式(6)に よ り補 正 した 。 そ の結 果, Fig.10に 示 す よ うに 補 正 計 数 値 は 目視 コ ロ ニー数 と よ く一 致 す る ことが 判 った 。 また,Fig.10に は,Artek 880型 自 動 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ーに よ り感 度:sense4.8で 計 数 し,こ れ を 式(6) に よ り補正 した 結果 も併 せ て示 して あ る。CA-7A型 の 場 合 と同 様,目 視 コ ロニ ー数 と よ く一 致 した 値 を 示 す こ とが 判 る。 以 上 の 結 果 か ら,変 異 原 性 試 験 に よ り得 た 復 帰 変 異 コ ロ ニ ーは,コ ロニ ー数 に応 じて感 度 を切 りか え て 自動 コ ロ ニ ー カ ウ ン ター で計 測 し,こ れ を補 正 式(6)で 補 正 す れ ば,肉 眼 に よ る計数 値 と同等 の値 が 得 られ る事 が 判 っ た 。 自動 コ ロ ニー カ ウン タ ー で の計 測 時 間 は 秒 の単 位 で あ る。 した が って,本 法 は大 気 浮 遊 粉 じん の変 異 原 性 モ ニ タ リン グな ど,多 試 料 の変 異 原 性 を定 期 的 に 測 定 す る のに 極 め て有 効 な 手 法 とな る もの と思 わ れ る。 な お,本 研 究 の 費用 の一 部 は厚 生 省 が ん 研 究 助 成 金 お よび 文 部 省 環 境 科学 特別 研 究 補 助 金に よ っ て まか な わ れ た 。 関 係 各 位 に 深 謝 の 意 を表 し ます 。 (受稿1981. 12. 25)

1) W.A.

Goss, R.N.

Michaud,

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Evaluation of an automated colony counter, Appi.

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2) D. Clive, Jo-Anna F.S. Spector: Laboratory

pro-cedure for assessing specific locus in culture L5178Y

mouse lymphoma cells, Mutation Res., 31, 17-29

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3) M. J.

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L. Lininger,

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Adaptation

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colony

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5) 坂 本 豊, 永 藪 治, 山本 清, 菊 池 康 基: 自動 colony counterの 復 帰 変 異 試 験 へ の応 用― コ ロ ニ ー 計 数 の 自動 化 と問題 点―, 第8回 日本 環 境 変 異 原 学 会 講 演 要 旨集, 61 (1979)

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9) 宮 武 修, 脇 本 和 昌: 乱 数 と モ ン テ カ ル ロ 法, 森 北 出 版, pp.4-58 (1978)

10) 渋 谷 政 昭: 擬 似 乱 数 の 生 成, 数 学, 15, 68∼71 (1963)

A Method for Calibration

of the Counts by an Automatic

Colony Counter for Mutagenicity

Assay

Hidetsuru MATSUSHITA*, Sumio GOTO*,

Masahiro MORITA** and Kenji HAYASFII**

*

Department of Community Environmental Sciences, National Institute of Public Health; 4-6-1, Shirokanedai, Minato-ku, Tokyo 108 JAPAN

**

Department of Applied Mathematics, Faculty of Science, Science University of Tokyo; 1-3, Kagurazaka, Shinjuku-ku, Tokyo 162 JAPAN

In a survey of mutagenicity of environmental substances such as airborne particulates, counting of revertant

colonies in many test plates is needed.

This counting requires many hours.

In order to overcome this difficulty,

several automatic colony counters have been developed.

However, these commercially available colony counters

give different values from those by the ordinary eye counting.

This discrepancy become remarkable when

numbers of colonies in a plate become large.

We found that this discrepancy is mainly due to the following

facts : a) Colonies overlapped each other in a plate are counted as one by a commercial colony counter.

b)

Sizes of colonies become smaller as numbers of colonies increase.

Colony counter can not detect small colonies

under a given size when the counter is set at a low sensitivity.

The first problem was solved through MonteCarlo simulation method.

This is, appearance probabilities

of single colonies and colony clusters in which 2, 3, 4,..., and n colonies overlapped each other were computed

for 100 to 2000 colonies spread uniformly in a plate.

Diameters of colonies were determined experimentally

as a function of number of colonies in a plate.

These diameters were used for the computation of appearance

probability.

Probability function thus obtained was used for the derivation of calibration equation which can

convert number of colonies by a commercial colony counter to that by the ordinary eye counting.

The second problem was solved by the alternation of sensitivity of the counter according to the colony's number

in the plate.

This is, it was found that colonies up to 1000 were detected satisfactorily at a middle sensitivity,

and colonies over 1000 were at a more high sensitivity.

It was proved that number of colonies counted by a commercial colony counter was effectively converted to

the practically same value as that by the ordinary eye counting by the combination use of the calibration

equa-tion and the choice of sensitivity suitable to detect colonies in a plate.

Key Woeds: Mutagenicity test, Salmonella typhimurium TA100 and TA98, automated colony counter,

Monte-Carlo method, computer simulation, calibration equation

Fig.  1.  Difference  between  visual  count  and  ordi- ordi-nary  calibrated  instrumental  count.
Fig.  3.  Block  diagram  of  simulation  by  MonteCarlo  method  with  computer.
Fig.  4.  Appearance  frequency  of  N1,  N2  and  Nt  in  a  plate  containing  2000  colonies  which  are  obtained  by  the  150  times  computer  simulations.
Table  1.  Numbers  of  single  colobies  and  clusters  of  colonies  which  are  obtained  by  the  MonteCarlo  simulation.
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参照

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