新技術説明会　様式例

(1)

ファイバープローブラマン分光分析法による

脂肪、皮脂等のその場分析技術

関西学院大学理工学部生命科学科

准教授佐藤英俊

(2)

光分光分析の基礎

励起電子 状態E₂ 基底電子 状態E₁ v’=0 v’=1 v’=2 v’=3 v”=0 v”=1 v”=2 v”=3 J’=0 J’=1 J’=2 J’=3 J’=4 J”=0 J”=1 J”=2 J”=3 J”=4 E1, E2,・・・・電子エネルギー準位 v’=0, 1, 2,・・・, v”=0, 1, 2, ・・・振動エネルギー準位 J’=0, 1, 2,・・・, J”=0, 1, 2,・・・回転エネルギー準位

IR

UV-Vis

• 振動準位

（赤外）

（ラマン）

仮想準位

h

n

h(

n

-

n

_R

)

蛍光／励起光＝～1/10

ラマン光／励起光＝～1/10

7

Raman

(3)

3 ラマン分光分析

特徴

1. 振動分光

• 分子の指紋

_{→分子を見分ける}

2. 水の影響が尐ない

• 生体は水が多い

_{→生体測定}

3. 可視・近赤外光を利用

• 光ファイバーが使える

_{→その場測定}

短所：暗い（光が尐ない）

• 強いレーザー光が必要

→イメージ測定が困難

蛍光／励起光＝～1/10

ラマン光／励起光＝～1/10

7

試料に光を当てる

→

異なる波長（エネルギー）の光に変わる

(4)

光による生体分析システム

ラマンプローブ カメラレンズ 光源体内計測用ラマンプローブ２種（世界最細径）他に米国２機関，シンガポール１機関が外径約２mmのプローブを開発

Hollow optical fiber Ball lens

0.6 mm

0.62 mm

マルチモーダル分光診断内視鏡（マウス用；オンライン分析への応用が可能）ハイパースペクトラルイメージプローブ生きたがん組織の無標識画像化に成功

光バイオプシーシステム

（実験動物用として開発）先端計測分析技術・機器開発事業（JST; H16～21）数ヶ月で発症する各種疾病モデルマウスでの研究を実現→ 研究の高速化

(5)

ラマン分光分析応用のターゲット

化粧品

1.リアルタイム皮膚分析によるオーダーメイド化粧品

2.頭皮の診断，治療（皮脂分析）

3.加齢臭等，皮脂に関する分析

食品

1.生鮮/冷凍の判別

2.牛肉の品質分析

ラマン分光システム

長所：高い分析能力

短所：高価

• 高付加価値への応用

• オンラインでの利用

(6)

ラマン分光法の生体応用

1. 生細胞の分析

2. 組織保存の影響の分析

3. 脂肪分析と牛肉分析への応用

(7)

顕微ラマンによる生きた肺がん細胞の無標識・無侵襲判別分析（

532 nm）

_abcde

Y. Oshima, et al., J. Biomed. Opt. 15, 017009-1 (2010).

800 1000 1200 1400 1600 1800 800 1000 1200 1400 1600 1800 a b c d e 1659 1583 1449 1340 1312 1257 1127 1003 747 ₇₈₅ 1605 1618 852 642 620 1086 1031 ₁₁₇₅ 1209 Raman shift (cm-1₎ R el at ive inte nsi ty (a.u.) 720 1421 830 1577 936

Excitation WL：

532nm

Power @ sample: 10mW

Exposure：60s

a. Normal lung cell b. Adenoma (AD) c. Squamous carcinoma (SQ) d. Small cell carcinoma (SC) e. Large cell carcinoma (LC)

AD：腺腫

SQ：扁平上皮がん

LC：大細胞がん

SC：小細胞がん

NC：正常

(8)

SC SC AD AD AD AD AD SQ _SQ SQ SQ SQ LC LC LC LC LC SC SC SC

PC 1 (44.4%)

PC

2 (20.

7%

)

a

AD AD AD AD AD SQ SQ SQ SQ SQ LC LC LC _LC LC SC SC SC SC SC

PC 1 (44.4%)

PC

3 (15.

1%

)

b

■

AD

■

SQ

■

LC

■

SC

主成分分析（PCA）による判別

がん細胞種の判別に成功！

(9)

顕微ラマンによる生きたがん細胞の無標識・無侵襲判別分析（785nm）

800 1000 1200 1400 1600 Raman shift (cm-1₎ Intens ity (a .u. ) LC：大細胞 SQ：扁平上皮 CT：正常 SC：小細胞 AD：腺

Excitation :

785nm

Laser power : 50mW

Expose time : 30sec×3times

Normalized at 1440cm

-1 -1 0 1 2 3 - 100 - 50 0 50 100 150

PCA Score Plot (PC1 vs PC3)

PC1

LC SQ CT SC AD PC3 -2 -100 -50 0 50 100 -1.3 -0.8 -0.3 0.2 0.7 1.2 LC SQ

PCA Score Plot (PC1 vs PC3)

PC1

(10)

Variables (cm-1₎ Load in g s (a. u .) 1200 1400 1600 1800 800 1000 1660 1440 1 1 2 9 749 PC1 PC2 PC3

ローディングプロット：主成分の検証

800 1000 1200 1400 1600 Inten si ty (a .u .) PC1 PC3 Variables (cm-1₎ 800 1000 1200 1400 1600 Inten si ty (a .u .) PC1 PC3 Variables (cm-1₎

532nm

785nm

Cytochrome (Resonance)

多くの判別分析技術があるが，

PCAおよびPLSのみが，ローディン

グプロットにより分析根拠を明らか

にすることができる。

(11)

ラマン分光法による試料鮮度の分析

Fresh Frozen -80 ℃ Ethanol 4℃ Formalin Ethanol 25℃ RNAlater ラット脳 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 PC1 PC2 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 PC3 PC2 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 -0.1 0 0.1 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0 0.1 0.2 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1

PC1

PC2

PC3

ラット：筋肉, 胃，肝臓

1 day, 1 week

(12)

食品脂質の分析

食習慣によるがん化率の増加

•乳がん

•大腸がん

疫学的調査

日本人 < 日系ハワイ人 < アメリカ人

食習慣と脂肪と疾病の関係

牛肉の格付け分析（神戸牛 = A-5）

飼料の違い（トウモロコシ，米，牧草・・・）

体内部位による違い

格付けによる違い

P

C

2 (

1.5 %)

PC 1 (97.5%)

1₁ ₁ ₁₁ 1 1 1 2 ₂ 2 2 2 22222 ₂ 3 3 3 33 3 3 3 3 3

B2

A3

A5

P

C

2 (

1.5 %)

PC 1 (97.5%)

1₁ ₁ ₁₁ 1 1 1 2 ₂ 2 2 2 22222 ₂ 3 3 3 33 3 3 3 3 3

B2

A3

A5

ラマン分光法による分析結果

• 格付けAとB：オレイン酸-ステアリン

酸濃度の違い

• 脂肪（トリアシルグリセロール）の構

成成分による違い

脂肪分析

• 飼料＝食習慣

• 格付け＝蓄積脂肪

• 食習慣→疾病

(13)

モデル皮膚内不飽和脂肪酸のラマン分析

Raman shift (cm

-1

₎

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Re

l.

Int.

培養皮膚モデルの

真皮層のにスクアレ

ン（不飽和脂肪酸）を

注射器で注入してラ

マン測定を実施

Raman shift (cm

-1

₎

Re

l.In

t.

870cm-1 過酸化脂質 酸化剤濃度 8mM 4mM 2mM 1mM 0.8mM 0mM 1800 1600 1400 1200 1000 800 600

リポソームに埋め込んだリノール酸の酸化剤

による酸化と過酸化脂質の発生

(14)

蛍光イメージを用いた無染色組織観察

500

400

300

200

100

0

500

400

300

200

100

0 狭帯域励起・検出光を用いた蛍光イメージ

皮下腫瘍モデル切片

(15)

自家蛍光イメージによるリアルタイム組織観測

tumor in a live mouse

Fluorescent image

Ex. 313 nm (sp. res. 6 nm) Obs. 500 nm (sp. res. 40 nm)

Selective excitation of

collagen rich tissue

5 4 3 2 1 0 cm 5 4 3 2 1 0 cm 5 4 3 2 1 0 cm 5 4 3 2 1 0 cm

32 scale-image

Microscope image of

stained tumor tissue

Interstitial fibrosis

Cytoplasmic tissue

Normal image of tumor

in live mouse

mm

Optical Biopsy System

Ex. 250-600 (sp. res. 6 nm)

(16)

従来技術との比較

細胞

免疫染色：侵襲性高い

ターゲット以外の変化は見えない

操作が複雑で時間がかかる

GFP：遺伝子改変（ヒト，食品には不可）

組織

顕微鏡観察：固定・染色等に時間がかかる

脂質

LC, GC：トリアシルグリセロールの抽出，分解（複雑操作と低精度）

他の分光分析技術との比較

赤外分光法：水分を含む試料（生細胞，組織）の分析が困難。ファイバプローブを用い

る計測が困難。

近赤外分光法：水分を含む試料（生細胞，組織）の分析がやや困難。微小試料（細胞

など）の分析が困難。

(17)

新技術の特徴・従来技術との比較

生体試料のラマン分光分析

高い分析（判別）能力

リアルタイム分析

無侵襲分析

無標識分析

微小領域（試料）分析

欠点：一点観測

自家蛍光イメージングでカバー

(18)

ラマン分光法を利用するために何が必要か

目的に応じたラマンシステムの導入

励起波長，顕微orラマンプローブ，試料ステージ，システム

構成，etc.

データ解析前処理

波数補正，強度補正，バックグラウンド補正，ノイズ補正，

新技術説明会 様式例

ファイバープローブラマン分光分析法による

脂肪、皮脂等のその場分析技術

関西学院大学 理工学部 生命科学科

准教授 佐藤 英俊

光分光分析の基礎

IR

UV-Vis

• 振動準位

（赤外）

（ラマン）

仮想準位

h

n

h(

n

-

n

R

)

蛍光／励起光＝～1/10

ラマン光／励起光＝～1/10

Raman

3

ラマン分光分析

特徴

1. 振動分光

•

分子の指紋

→分子を見分ける

2. 水の影響が尐ない

•

生体は水が多い

→生体測定

3. 可視・近赤外光を利用

•

光ファイバーが使える

→その場測定

短所：暗い（光が尐ない）

•

強いレーザー光が必要

→イメージ測定が困難

蛍光／励起光＝～1/10

ラマン光／励起光＝～1/10

試料に光を当てる

→

異なる波長（エネルギー）の光に変わる

光による生体分析システム

0.6 mm

0.62 mm

光バイオプシーシステム

ラマン分光分析応用のターゲット

化粧品

1.リアルタイム皮膚分析によるオーダーメイド化粧品

2.頭皮の診断，治療（皮脂分析）

3.加齢臭等，皮脂に関する分析

食品

1.生鮮/冷凍の判別

2.牛肉の品質分析

ラマン分光システム

長所：高い分析能力

短所：高価

• 高付加価値への応用

• オンラインでの利用

ラマン分光法の生体応用

1. 生細胞の分析

2. 組織保存の影響の分析

3. 脂肪分析と牛肉分析への応用

顕微ラマンによる生きた肺がん細胞の無標識・無侵襲判別分析（

532 nm）

abcde

Excitation WL：

532nm

Power @ sample: 10mW

Exposure：60s

AD：腺腫

SQ：扁平上皮がん

LC：大細胞がん

SC：小細胞がん

NC：正常

新技術説明会　様式例

関西学院大学理工学部生命科学科

准教授佐藤英俊

_R

_{→分子を見分ける}

_{→生体測定}

_{→その場測定}

_abcde

多くの判別分析技術があるが，

牛肉の格付け分析（神戸牛 = A-5）