は じ め に
肺炎球菌は、急性呼吸器感染症や中耳炎など市中感染 症の主要な起因菌の一つである。特に小児ではインフル エンザ桿菌とともに重要な起因菌であり、時として敗血 症､髄膜炎に進展し致命的になることもある。近年、ペニ シリン耐性の肺炎球菌の増加が数多く報告され､同時にペ ニシリンのみならず種々のβ-ラクタム系、マクロライド 系薬剤にも耐性を示し、治療上大きな問題となっている。
今回我々は当院のペニシリンおよび他の抗菌薬に対する 薬剤感受性をまとめたので報告する。
市立室蘭医誌（第２８巻 第１号 平成１５年４月）
当院における肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）の 薬剤感受性について
市立室蘭総合病院 臨床検査科
林 右 松 田 啓 子 中 村 克 司
市立室蘭総合病院 臨床検査科 病理
今 信一郎
市立室蘭総合病院 小児科
酒 井 好 幸
札幌医科大学 微生物学講座
佐 藤 清
（北海道和光純薬㈱ 訪問研究員）
横 田 伸 一 藤 井 暢 弘
要 旨
２００１年４月から２００２年１０月までに当院で分離された肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）３０３株について、１６種 類の抗菌薬に対する微量液体希釈法によるＭＩＣ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：最小発育阻止濃度）値を 測定した。３０３株の７０.６％は喀痰および吸引痰より分離された。ＰＣＧに対する感受性はＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＮＣＣＬＳ）の判定基準にしたがった。ペニシリン感性肺炎球菌（ＰＳＳＰ）は
４４.２％、ペニシリン中等度耐性肺炎球菌（ＰＩＳＰ）５０.５％、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）５.３％であり、し たがってペニシリン低感受性は５５.８％を占めた。ＰＣＧ以外の抗菌薬に対する耐性株の検出率はＣＴＸ １７.８％、ＩＰＭ １.１％、ＥＭ ７６.２％、ＣＬＤＭ ４３.０％であった。３０３株中３２株に対して行われたＰＣＲ法による耐性因子検索では、
ＰＳＳＰの１５株中１０株（６６.７％）を含む２７株（８４.４％）にpbpの変異を認めた。mefEおよびermAMの保有を認め た株は３２株中３０株（９３.８％）であった。当院分離菌はペニシリン以外の薬剤にも耐性化が進行していた。
キーワード
ＰＲＳＰ、ＰＩＳＰ、微量液体希釈法、ＰＢＰｓ遺伝子変異、マクロライド耐性遺伝子
対象および方法
１．使用菌株
２００１年４月から２００２年１０月までの間に各種臨床材料よ り分離された肺炎球菌で、可及的に重複を避けた３０３株を 対象とした。また莢膜を構成する多糖体が特有なｍｕｃｏｉｄ ｆｏｒｍを示したムコイド株は２４株である。検査材料別の内
訳は、喀痰および吸引痰２１４株（７０.６％）、咽頭粘液５２株、
鼻腔内１７株、耳漏１０株、血液２株、髄液１株、その他７ 株である。
２．薬剤感受性試験
日本化学療法学会標準法１）に準拠した微量液体希釈法 により、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ（ＰＣＧ）、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（ＡＢＰＣ）、
ｃｅｆａｚｏｌｉｎ（ＣＥＺ）、ｃｅｆｏｔｉａｍ（ＣＴＭ）、ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ（ＣＴＸ）、 ｆｌｏｍｏｘｅｆ（ＦＭＯＸ）、ｃｅｆａｃｌｏｒ（ＣＣＬ）、ｃｅｆｄｉｔｏｒｅｎ（ＣＤＴＲ）、 ｉｍｉｐｅｎｅｍ（ＩＰＭ）、ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ（ＭＥＰＭ）、ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（ＥＭ）、
ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ（ＣＬＤＭ）、ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ（ＭＩＮＯ）、ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ
（ＬＶＦＸ）、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ（ＶＣＭ）、ＳＴ合剤を用いて最小発育 阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。測定はドライプレート 栄研 ＤＰ２４（栄研化学）を用いた。培養液はミュラーヒントン ブイヨン 栄研 （栄研化学）に所定量のストレプト・ヘ モ・サプリメント 栄研 （栄研化学）を添加した。培養 は３５℃、好気条件下で１８〜２４時間行い、ＭＩＣは目視にて 判定した。
測定法の移行期間のため、センシ・デｲスク オキサシリ ン（ＭＰＩＰＣ：日本ベクトン・デｲﾂキンソン）の感受性デ ｲスク法の阻止円も参考として測定した。
３．判定基準
測定したＭＩＣ値は、ＮＣＣＬＳの基準２）に従い、ペニシ リンに対する感受性から、０.０６３μｇ/ 以下をペニシリ ン感性肺炎球菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ Streptococcus pneumoniae：ＰＳＳＰ）、０.１２５μｇ/ 〜１μｇ/ を中等度 耐性肺炎球菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ-ｒｅｓｉｓｔａｎｔ S.
pneumoniae：Ｐ I ＳＰ）、２μｇ/ 以上をペニシリン耐性肺 炎球菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ S.pneumoniae：ＰＲＳＰ）と 分類した。
４．ＰＣＲ法による耐性因子検索
ＰＣＲ法による遺伝子検索は、千葉ら３）の方法により 検索した。自己融解酵素遺伝子（ａｕｔｏｌｙｓｉｎ）：３１９ｂｐは肺 炎球菌のみ増幅される。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ-ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＢＰｓ）
遺伝子をコードするＰＢＰ１Ａの構造遺伝子（pbp1a）：２６３ｂ ｐ、ＰＢＰ２Ｂの構造遺伝子（pbp2b）：１４７ｂｐ、ＰＢＰ２Ｘの構 造遺伝子（pbp2x）：１９７ｂｐはペニシリン系薬剤に感受性の 正常ＰＢＰｓ株のみ増幅される。菌体内へ取り込まれたマク ロライド薬を菌体外へ排出する機構を保有する蛋白を コードする遺伝子（mefE）：４０２ｂｐとアデニンメチラーゼ でマクロライド薬の作用点である５０Ｓリボゾームへ結合を 阻害する酵素をコードする遺伝子（ermAM）：２２４ｂｐはマ クロライド耐性遺伝子保有菌株のみ増幅する。
結 果 １． PCG感受性試験成績
１９９６年にペニシリン耐性肺炎球菌研究会４）に無作為に 送付された当院の肺炎球菌株のペニシリン感受性成績は、
４６株中３８株（８２.６％）がＰＳＳＰ株で、ペニシリン耐性株
（ＰＩＳＰとＰＲＳＰ）は８株（１７.４％）にすぎなかった。しか し今回調査された３０３株のペニシリン感受性成績は、ＭＩＣ 値よりＰＳＳＰは１３４株（４４.２％）、ＰＩＳＰは１５３株（５０.５
％）、ＰＲＳＰは１６株（５.３％）であり、ペニシリン耐性株 は１６９株（５５.８％）であった（図１）。年齢別ペニシリン
感受性では、ＰＩＳＰとＰＲＳＰを併せたペニシリン耐性率は、
１歳以下で６４.６％、１歳台で６４.７％、２歳台で６１.３％、
３歳台で５３.１％、４歳台で６９.０％であり、６０歳台で５６.５％、
７０歳以上で５５.９％であった（図２）。
２．その他の薬剤感受性試験成績
ＰＣＧ以外の抗菌薬に対する薬剤感受性分布を図３ａ,３ｂ に、ＭＩＣ９０を表１に示した。
ＡＢＰＣのＭＩＣ９０は２μｇ/ でＰＣＧに比べて一管程度高い 傾向が認められた。ペニシリン耐性株は０.２５以下から ４μｇ/ に分布した。
セフェム系第一世代のＣＥＺのＭＩＣ９０は２μｇ/ で、ペニ シリン耐性株は０.１２以下から４μｇ/ 以上に分布した。
第二世代のＣＴＭのＭＩＣ９０は４μｇ/ 、ＦＭＯＸのＭＩＣ９０は ２μｇ/ で、ペニシリン耐性株は０.１２以下から４μｇ/ 以 上に分布した。第三世代のＣＴＸの耐性株は５４株（１７.８
％）で、ペニシリン耐性株は０.１２以下から２μｇ/ に分布 した。これらセフェム系注射薬の感受性は耐性側に広く 分布した。
経口セフェム系薬のＣＣＬのＭＩＣ９０は１６μｇ/ 以上で、
ＰＲＳＰ株は全て１６μｇ/ 以上の高度耐性であった。ＣＤＴＲ のＭＩＣ９０は０.５μｇ/ で、ペニシリン耐性株のほとんどが
図１．ＰＣＧ感受性成績
図２．年齢別ＰＣＧ感受性成績
０.２５から１μｇ/ に分布した。
カルバペネム系薬のＩＰＭとＭＥＰＭは、ほとんどが０.２５ μｇ/ 以下に分布し、ペニシリン耐性株は０.０６以下から ０.５μｇ/ に分布した。
マクロライド系薬のＥＭの耐性株は２３１株（７６.２％）で 耐性側に広く分布した。ＣＬＤＭの耐性株は１３０株（４３.０％）
で、感性と耐性の明瞭な二峰性を示した。
テトラサイクリン系薬のＭＩＮＯのＭＩＣ９０は８μｇ/ 以上 で耐性側に広く分布した。
ニューキノロン系薬のＬＶＦＸのＭＩＣ９０は２μｇ/ で、
１μｇ/ をピークとした一峰性の分布であった。
ＶＣＭは３０１株（９９.３％）が感性株で、０.２５μｇ/ を ピークとした一峰性の分布であった。
ＳＴ合剤のＭＩＣ９０は３８／２μｇ/ で、９.５／０.５から ３８／２μｇ/ を中心に分布した。
セフェム系薬のＭＩＣ累積分布ではＣＤＴＲのＭＩＣが最も 低い値を示した（図４）。セフェム系以外の薬剤のＭＩＣ累 積分布ではカルバペネム系薬のＭＩＣが最も低い値を示し た（図５）。
図３ a．各薬剤の MIC 分布
図３ b．各薬剤の MIC 分布
表１．各抗菌薬に対する薬剤感受性
図４．セフェム系薬の MIC 累積分布
３．ＰＣＲ法による耐性因子の検査成績
図６にＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡバンドの位置を示した。
ＰＢＰｓ遺伝子変異とマクロライド耐性遺伝子の有無が検査 された３２株（１、１１、１４、１７は対象外の株）の成績を図７ に示した。３２株中６株はムコイド株である。
ＰＣＧのＭＩＣは、pbp1a単独ではすべて０.０６μｇ/ 以下 の感性を示した。pbp2x単独では０.５μｇ/ 以下で、９株 中３株（３３.３％）が耐性を示した。pbp1aとpbp2xの変異 では２μｇ/ のＰＲＳＰの１株を含む７株中５株（７１.４％）
が耐性を示した。pbp2xとpbp2bの変異では１株が０.５μｇ/
の耐性を示した。すべて変異を示した６株は０.５μｇ/ 以 上の耐性を示した（図８）。
セフェム系注射薬のＭＩＣは、遺伝子変異の数が多くな ると第一世代から第三世代のいずれかのセフェム系薬が 耐性を示した。経口薬であるＣＣＬはpbp1aとpbp2x､特に
pbp2xに変異があると耐性となる傾向を示した。ＣＤＴＲは
pbp1aとpbp2xの２遺伝子変異で耐性を示した（図９）。 図５．セフェム系薬以外の薬剤の MIC 累積分布
図６．ＰＣＲ法で増幅されるバンドの位置
図７．ＰＣＲ法による耐性遺伝子検索
図８．ペニシリン感受性と PBPs 遺伝子 変異の関係（n=32）
図９．セフェム系感受性と PBPs 遺伝子 変異の関係（n=32）
ＥＭのＭＩＣは、mefEとermAMの２遺伝子の保有が認め られなかった２株は０.０６μｇ/ 以下の感性を示した。mefE 単独では１２株すべてが０.２５μｇ/ 以上を示した。ermAM 単独では１６株すべてが０.２５μｇ/ 以上を示し、１６株中１０株
（６２.５％）が２μｇ/ 以上の耐性を示した。mefEとermAM の保有を認めた２株は２μｇ/ 以上の耐性を示した（図１０）。
ＣＬＤＭのＭＩＣは、遺伝子の保有が認められなかった２ 株は０.０６μｇ/ 以下の感性を示した。mefE単独では１２株 中１０株（９１.７％）が０.０６μｇ/ 以下で、２株が０.１２μｇ/
の感性を示した。ermAM単独では１６株中３株が０.０６μｇ/
以下で、２株が０.１２μｇ/ の感性を示し、１１株が２μｇ/
以上の耐性を示した。mefEとermAMの保有を認めた２ 株は２μｇ/ 以上の耐性を示した（図１１）。
考 察
１９９８年４月に施行された「感染症の予防及び感染症の 患者に対する医療に関する法律（感染症新法）」にペニシ リン耐性肺炎球菌感染症が指定されている。耐性の判断 基準は、ペニシリンのＭＩＣが０.１２５μｇ/ 以上、または オキサシリンの感受性デｲスク（ＫＢ）の阻止円が１９ｍｍ
以下とされている。感染症の起因菌と判定された場合に は、４類感染症として届出が必要になる。一方、ＮＣＣＬＳ の判定基準はオキサシリンのデｲスクの阻止円直径１９ｍｍ 以下を耐性菌の可能性ありとして、微量液体希釈法によ るＰＣＧのＭＩＣを測定することが提唱されている。これま で当科では、肺炎球菌を始め栄養要求の厳しい菌につい ては、ＭＩＣを測定することが困難であった。しかしなが ら、ＰＲＳＰによる重症感染症は、１９８８年の有益ら５）の報 告以来相次いで報告されており、デｲスク法では治療薬選 択に答えきれないとの判断から、２００１年より微量液体希 釈法の本格導入に踏み切りデータの蓄積をおこなってき た。この結果から、約５年間でペニシリン耐性株が１７.４％
から５５.８％と３倍以上増加していることが明らかになっ た。佐藤らは６）近畿地区の９医療施設で分離された肺炎 球菌２３５株について、ペニシリン耐性株は５３.２％（ＰＩＳＰ は４２.６％、ＰＲＳＰは１０.６％）検出されたとし、１９９９年の 調査を５％上回る成績となったと報告している。当院の 成績は、佐藤らの報告と同様の耐性率を示し、ペニシリ ン耐性株がさらに増加する可能性が示唆された。ペニシ リン耐性肺炎球菌を把握するためには、肺炎球菌分離を 確実にしなければならない。我々は、小児科材料で咽頭 粘液の５.４４％、吸引痰及び喀痰で２６.０４％に肺炎球菌を 検出したことを報告した７）。またデータとして示していな いが、吸引痰（喀痰を含む）と咽頭粘液が同時に提出さ れた５７例で、吸引痰から３１.５８％、咽頭粘液から８.７７％
の肺炎球菌が検出された。したがって、肺炎および下気 道感染症が疑われる場合には、安易な咽頭粘液の検査は 避け、吸引痰（または喀痰）を採取するか後鼻腔採取す ることが非常に重要である。
ペニシリン耐性株は、その他の抗菌薬にも耐性傾向を 示すことが多く、治療薬の選択上極めて重要である。生 方ら８）は、β - ラクタム系薬の耐性機序としてＰＢＰ１Ａは 細胞壁立体構造の構築、ＰＢＰ２ＡとＰＢＰ２Ｘは隔壁合成、
ＰＢＰ２Ｂは菌の解離に関与しているとし、ペニシリン系耐 性にはpbp1aとpbp2b遺伝子が、セフェム系耐性にはpbp1a とpbp2x遺伝子の変異が関与し、これらの遺伝子の変異が 重なると耐性度が上昇するとしている。株数は少ないが、
我々の成績も同様の傾向を示した。
また、３２株中６株がムコイド株で、ＰＣＧのＭＩＣはすべ て０.０６μｇ/ 以下であった。６株中４株にpbp2x単独変 異が認められ、３株がオキサシリンの感受性デｲスク法で 阻止円が１９ｍｍ以下であったことは興味深い結果であっ た。
マクロライド系抗菌薬の耐性機序として、ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ による耐性化やｍｅｔｈｙｌａｓｅによる耐性化が知られている８）。 ＥＭ耐性は、mefEとermAMの２つの遺伝子が耐性化に関
与していたが、ermAMの保有がより耐性傾向を示した。一 図１０．EM 感受性とmefE・ermAM遺伝子
変異の関係（n=32）
図 11．CLDM 感受性とmefE・ermAM 遺伝子変異の関係（n=32）
方、ＣＬＤＭはmefE遺伝子のみの保有では感性を示し、
ermAM遺伝子が耐性化に関与していた。これはマクロラ
イド系抗菌薬の耐性にはermAM遺伝子が重要であること を示している。また、ＣＬＤＭの感受性検査がＥＭで代用 されない理由もここにあると思われた。
千葉ら３）はセフェム系薬に比べカルバペネム系薬の殺 菌効果は明らかに優れていたと報告している。我々の成 績でも、ＩＰＭのＭＩＣ９０は０.１２μｇ/ で、ＭＥＰＭのＭＩＣ
９０は０.２５μｇ/ と１６薬剤中最も有用な成績を示した。
石田ら９）はキノロン系７薬剤の感受性を調べ、４例の キノロン耐性肺炎球菌を報告している。このうち３例は キノロン剤投与歴があり、投与中の２例のうち１例は投 与中止により耐性菌は消失し、投与が継続された１例は 耐性菌が検出され続けたとし、キノロン系薬剤は容易に 耐性化する可能性が示唆されたとしている。当院では眼 科に入院中の６８歳男性の１例にＬＶＦＸのＭＩＣが８μｇ/
を示した。ニューキノロン耐性の肺炎球菌は、今後継続 して追跡が必要と思われる。
本邦においてＶＣＭは肺炎球菌治療薬の承認はまだ得ら れていないが、欧米においてはＰＲＳＰによる化膿性髄膜炎 の治療薬として使用されている。ＶＣＭのＭＩＣは０.２５か ら０.５μｇ/ の感性域にピークを示したが、ＭＲＳＡ治療 薬として使用頻度が増えていることから今後注意が必要 と思われた。
結 語
肺炎球菌に対し１６薬剤のＭＩＣ値を測定し、室蘭地方に おいてもペニシリン耐性株の増加が認められた。またペ ニシリン以外の薬剤にも多剤耐性が進行していることが 明らかとなった。これらの耐性菌に対し、微量液体希釈 法によるＭＩＣ測定は、デｲスク法では得ることができな かった多くの薬剤感受性情報を臨床に活用でき、薬剤耐 性状況の把握などに有用であった。今後、ＢＬＮＡＲ（β- ｌａｃｔａｍａｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ａｍｐｉｃｉｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Haemophillus influenzae）などの耐性菌を含め、栄養要求の厳しい細菌 のＭＩＣ測定が益々重要と思われ、専用機器による培養条 件の一定化、ＭＩＣ値の自動読み取り、オンライン化によ る結果取り込みが行えるシステムが早急に導入されるこ とが望まれる。
本論文の要旨は、第６８回室蘭地区会研修会、第７８回北 海道臨床衛生検査学会にて発表した。
謝辞 耐性肺炎球菌に関してご指導いただきました北里 大学北里生命科学研究所感染情報学研究室 生方公子教 授に深謝いたします。
文 献
１）日本化学療法学会ＭＩＣ測定法改訂委員会：微量液体 希釈法によるＭＩＣ測定法（微量液体希釈法）―日本 化学療法学会標準法―．日本化学療法学会雑誌 38： 102-105，1990．
２）National Committee for Clinical Laboratory Standards：
Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. M100-S8(Vol.18,No.1). National Committee for Clinical Laboratory Standards,Villanova, PA, 1998. ３）千葉菜穂子，小林玲子，長谷川恵子，生方公子，紺
野昌俊：肺炎球菌に対するカルバペネム系薬の抗菌 作用の比較．日本化学療法学会雑誌 5 0：1 6 1 - 170,2002．
４）紺野昌俊，生方公子：ペニシリン耐性肺炎球菌．協 和企画通信，東京，1997．
５）有益修 , 目黒英典，白石裕昭，菅又久美子，比留間藤 昭，阿部敏明：βラクタム剤が無効であった肺炎球 菌髄膜炎の１例．感染症学雑誌 62：682-683,1988. ６）佐藤かおり，島川宏一，小松方，浦敏郎，木下承皓，
山崎勝利，西尾久明，鷲津良道，山下和成，中村竜 也，和田恭直，豊川真弘，幸福知己，相原雅典：近 畿地区で分離されたStreptococcus pneumoniaeの抗菌薬 耐性状況とPBP遺伝子変異について．感染症学雑誌 76：254−262，2002．
７）林右、松田啓子：当院で分離された肺炎球菌のMIC について．第７８回北海道臨床衛生検査学会講演集 68，
2002．
８）紺野昌俊，生方公子：改訂 ペニシリン耐性肺炎球 菌．協和企画通信，東京，1999．
９）石田雅己，渡辺英明，長田昌美，福井裕子，上田誠，
古郷功，瀧井昌英：北九州市立５病院における肺炎 球菌の検出状況 −ＰＣＧとキノロン系抗菌剤の感 受性分布−．感染症学雑誌73：1116−1122，1999．
