NO, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR), OAPI (BF, BJ, CF, 添付公開書類 : CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, _ 国際調査報告条約第条 TG).

(12) 特許協力条約に基づ て公開さ

れ

た国際出願 (19) 世界 知的所有 権機関 国際事務局 (10) 国際公開番号 Ittnensy (43)国際公開日 2010 年 9月16 日(16.09.2010)

W O 2010/103661 A l

(51) 国際特 許 分類 r J J 広小 路 上る梶井町4 6 5

A61B 10/00(2006.01) GOlN21/65(2006.01) J - 学 内 Kyoto(JP).

(21) 国際 出願 番 号 PCT/JP2009/054930 (74) 理人:特 許業務法人三 枝国際特 許 事 務所

(Sae-usa & Partners); 〒5410045 大 阪 府 大 阪市 中央区 (22) 国際 出願日 2009 年3月 13 日(13.03.2009) _{道 修町1 - 7 - 1 北浜T N K ビル Osaka (JP).}

(25) 国際 出願の言語: 日木語

(81) 定国( 表示のな 限り_{、全ての種類の国 内保}

(26) 国際公開の言語: 日木語 護 可 ) :AE, AG, AL, AM, Aの, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR,

(71) 出願人(米国を除<全ての指定国につ1 て) :京 _{CU, CZ, DE, DK, DM, Dの, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB,}

都府公立大学法人 (KYOTO PREFECTURAL PUB¬ _{GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP,} LIC UNIVERSITY CORPORATION) [JP/JP]; T _{KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS,}

6028566 京都府京都市 上京区河原町通広小 路 上 LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX,

る梶井町4 6 5番地 (JP). MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PG, PH, PL, PT,

(72) 発明者;および RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY,

TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, (75) 発明者/ 願人 (米国につ1 てのみ) :高松 哲郎

ZA, ZM, ZW.

(TAKAMATSU, Tetsuro) [JP/JP1; 〒602084 1 京都府

京都市 上京区河原町通広小 路上る梶井町4 6 (84) 指定国(表示のな 限り_{、全ての種類の広域}保 番地 京都府立医科大学 内 Kyoto (JP)_・小 貢 護 可 ) :ARIPO (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ,

(OGAWA, Mitsugu) [JP/JP1; 〒6020841 京都府京都 NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), --Lーラシア

市 上京区河原町通広小 路 上る梶井町4 6 5 番 (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU,TJ,TM), ヨーロ ツ/

地 京都府立医 科大学 内 Kyoto (JP)_・原田 義 規 (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, (HARADA, Yoshinori) [JP/JP]; 〒6020841 京都府京 GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL,

[続，冗葉 有]

(54) Title:BODY TISSUE IMAGING USING RAMAN SCATTERING LIGHT

(54)発明の名 称 ラマ ン散 乱 を用 た生体組織 イメ_{ー ジ ング}

(57) Abstract: Disclosed are a method of noninvasively imaging a tissue (in particular, a cardiac tissue) in real time and an apparatus

B therefor. A method of imaging a sample, which contains a myocar dial tissue and a blood vessel and/or a collagen-rich region, com

prising the following steps (1) to (3): (1) a step of irradiating the sample, which contains a myocardial tissue and a blood vessel and/or a collagen-rich region, with an exciting light; (2) a step of detecting Raman scattering light from the sample; and (3) a step of analyzing the Raman scattering light thus detected with the use of Raman scattering spectra specific to myocardial cells and erythro cytes and/or collagen as indications and thus imaging the same.

、心臓組織) を非 にイメー ジ ン グする 目的とする 。 本 発 1 ) b筋組織 チ領域とを含む試 該試 料からのラ ) 該 検出されたラ 球及び/ 又はコラー ク ト_{ル と を指 標 と}し む、心筋組織 と血 領域とを含む試 料 を る 。 600 800 1000 1200 1400 1600 Ram n shi ( c 1)

NO,PL, PT, RO,SE, SI, SK, TR), OAPI(BF,BJ, CF, 添付公開書類:

CG, CI, CM,GA, GN, GQ,GW, ML, MR, NE,SN, TD, _

明

細

苫

ラ

_マ

ン

散 乱

を用

_い

た生

体

組織イ

メ

ージ

ン

グ

技

術分野

０００1 本発明は、生体組織

_か

らのラ_マン散 乱スペクト_{ルを利用 して生体組織を}

_ィ

_メージン グ

す

る方法に関

す

る。また本発明は、ラ_マン散 乱スペクト_{ルを利用 した生体組織の}

ィ

メージング

す

るための装置に関

す

る。

背

景

技

術

０００2 組織

_ィ

メージングは、その組織を構成

す

る様_々な細胞

や

その他 のコンポーネント_の 分布を知る上で不可欠である。従来、心筋の組織 像を評価

す

る手段と_して心筋生検 がある。し

_か

し、心筋生検 では、標本の固定、染色が必要であり_{、そのために}リ_アルタ

ィ

ムに解析 して像 を作ること_{は不可能である。また、}心臓組織を傷

つ

けてしまう_とレ_ぢ 問題も_{ある。磁気共}

_鳴

_{画像 ( ) 法は}心臓の機能

や

構 造に関

す

る情報を得る_ため に使 用さ

_れ

_{るが、組織 像の変化に某づ}

_い

_{た情報ではな}

_い

_{。例えば、正常な心筋 細胞}

か

らなる領城と_{虚 血に}より_{心筋 細胞が壊 死して線維組織に}よ

_っ

_て置換さ

_れ

_た領城と_を 明確 に識別

す

ること_はできな

_い

_。 ０００3

一

方、ラ_マン分光法は振動型分光法の

一

形態であり_{、分子中の化学結 合の直接 の} 情報を提供

す

る。ラ_マン分光法では、人射 光により_誘起さ

_れ

_{る振動の特 典的なエネ} ルギー変化をスペクト_ルと_してプロ_ット

す

ること_ができ、こ

_れ

によ

_っ

て無染色で物質を特 定

す

ること_{ができる。}このよう_{なラマン分光法の特性 を利用 した}

_ィ

_{メージング方法}

_や

_装 置が開発さ

_れ

_て

_い

_{る(特許文献 及び}

_{2 )}

_{。医療分野におけるラマン分光法を使}

_っ

_た 最近の研究では、がん (非特許文献 )、アテローム性動脈 硬化症 (非特許文献

2 )

ヘモグロビンの酸 素飽 和 (非特許文献

3 )

の診断などの組織診断に焦点があてら

れ

て きた。し

か

し、こ

れ

ら_の研究は、単に標的組織のラ_マンスペクト_ルを解析

_す

_るに留まり_、 病変部位 を視 覚的に識別

す

るために

_ィ

メージングを試

み

たものではな

_い

。このよう_に ラ_マン分光法を利用 した

_ィ

メージングに関

す

る研究は進めら

れ

て

_い

るものの、内臓組 織を構成

す

る様_々な細胞のコンポーネント_{を分析可能 な}

_ィ

_{メージングに応 用 した例は} 報告さ

_れ

_て

_い

_な

_い

_。

特井文献1 特開2０００ ０9号公報 特井文献2 特開2００7 4735 ０号公報 非特井文献 ak a A_・ e a ( 2００6) Cance Res V o 6 6 3 31 7

22

非特井文献2 M o z _・T e a ( 2００6) B o ed O p Vo ０21００3 非特井文献3 T o _{e s} h o _・P e a ( 2００8) App h so 1０4 18０9

7

発

明の開

ぅ_示

発

明

が

解

央

_し

よう_と

_す

る

課

足頁 ０００4

かか

る_{現 状}の下_、本発明は_、組_織(_{特に、心臓組織})_{を非侵 襲的に、且}

_つ

_、リ_アルタ イムにイメーシンク

す

る方怯及ひ装置を提供

す

ること_を目的と

_す

_る。

課

題 を

角_榊央

す

る

ための

手

段

０００5 _本発明者らは、上記探題を解決

す

_へく_{鋭首研究を重ね、}( )_{ラマン分光怯にょ}り_心 臓における心筋 細胞と_{血 球}と_を、各_々に固有 のスペクト_{ルパターンに某}

_つい

_て識別

す

ること_{か可能てあ}り_{、心筋 細胞}

_か

らなる領城と_血管と_を含

_む

_試科に

_つい

_{て、両組織} を明瞭に区別したイメーシンクか可能てあること_、(_{2 )酸素化型の赤血 球}と_{脱酸 素}ィヒ 型の赤血 球と_{を各々に固有 のラマンスペク}ト_ルに某

_つい

_て識別

_す

_ること_かてき、こ

_れ

らを明瞭に区別してイメ_ーシンク

す

ること_{か可能てあ}ること_、(3) _{心筋梗塞を起 こした} 心臓の組織

か

ら得ら

_れ

るラ_{マン散 乱光を解析}

_す

ること_にょり_{、心筋 細胞か壊 死して線} 維組織化した領城と_{正常な心筋 細胞}

_か

_{らなる領城}と_{を明瞭に区別してイメーシン}ク

す

ること_{か可能てあ}ること_{を見出した。こ}

_れ

らの知 見に某

つ

き、本発明者らは史 なる検 討を重ね、非侵 襲的、且

_つ

、リ_{アルタイムに、正常な心筋 細胞}

_か

_{らなる領城}とコラーケ ンリノチな領城と_血管と_{を視 覚的に識別可能 な状態て明瞭にイメーシンク}

_す

_ること_を 可能にし、本発明を完成

す

るに至

_っ

た。即ち、本発明は、以下の態様の発 明を提供

す

る。 ０００6 項 _・以下の工程( )

～

(3) ( )_心筋組織と_{血管及ひ 又はコラーケンリノチ領城}と_を含

_む

_{試科に励起光を照射}

す

る_工程 ， (_{2 )核試科}

_か

ら_のラ_マン散 乱光を検出

す

る工程 ， (3) _{核 検出}さ

_れ

_{たラマン散 乱光を、心筋 細胞}と_{赤血 球 及ひ 又はコラーケンに特徴}

的なラ_マン散 乱スペクト_ルと_を指標と_{して解析 し、画像化}

_す

_る工程 を含

_む

、心筋組織と血管及_び 又はコラーゲンリ_ッチ領城と_を含

_む

_{試料をイメージン} グ

す

る_方法。 ０００7 項

2

_・ラ_マン散 乱光検_出手段により_検出さ

_れ

_た、心筋組織と_{血管及び 又はコラー} ゲンリ_ッチ領城と_を含

_む

_試料

_か

らのラ_マン散 乱光を、心筋 細胞と_{赤血 球 及び 又はコ} ラーゲンに特徴的なラ_マン散 乱スペクト_ルと_を指標と_{して解析 し、画像処理}

_す

_る工程 を含

む

、心筋組織と_血管及び 又はコラーゲンリ_ッチ領域と_を含

_む

_{試料をイメージン} グ

す

る_方法。 ０００8 項

3

・

ラ

試料が、虚血を起 こした心臓又はその

一

部である、項 又は

2

に記載の方 法。 ０００9 項

4

_・心筋 細胞に特徴的なラ_マン散 乱スペクト_ルが、シト_{クロムに起因}

_す

_{るラマン散} 乱スペクト_{ルである、請 求 項}

～

₃

_の

_い

_ず

_れか

_{に記載の方法。} ００1０ 項5_・赤血 球に特徴的なラ_マン散 乱スペクト_{ルが、ヘモグロビンに起因}

_す

_{るラマン散} 乱スペクト_{ルである、項}

～

₃

_の

_い

_ず

_れか

_{に記載の方法。} ００11 項6_・ヘモグロビ_ンに起因

す

るラ_マン散 乱スペクト_{ルが、酸素化型ヘモ}グロビン及_び 又_{は脱酸 素化型ヘモ}グロビンに起因

す

るラ_マン散 乱スペクト_{ルである、項}

₄

_に記載 の方法。 ００12 項7_・励起光が、 の波長 を有

す

る、請 求 項 に記載の方法。 ００13 項8_・(

₎

心筋組織と血管及_び 又はコラーゲンリ_ッチ領城と_を含

_む

_{領城 を含}

_む

_試 料に励起光を照射

す

る手段、( ) 前記試料

か

ら_のラ_{マン散 乱光を検出}

_す

る_手段、(

_C

) 該検_出したラ_マン散 乱光を心筋 細胞と_{赤血 球 及び 又はコラーゲンに特徴的なラ} マン散 乱スペクト_ルを指標と_{して画像処理}

_す

_{る手段、を備 える心筋組織}と_血管及び 又はコラーゲンリ_ッチ領城と_を含

_む

_{試料をイメージン}グ

す

るためのイメージング装置。 ００14 項

9

_・血管を含

む

試料

_か

ら_得ら

_れ

たラ_マン散 乱光に

_つい

て、酸素化型赤血 球に固 有のラ_マンスペクト_ルと_{脱酸 素化型 赤血 球に固有}なラ_マンスペクト_ルと_を指標と_して解 析

す

る工程を含

む

、当該試料を動脈と_静脈と_{を視 覚的に区別してイ}メ_ージング

す

る方 法。

発

明の効果

００15 本発明によれば、非侵 襲的に、且

_つ

、リ_{アルタイムに、正常な 心筋 細胞}

_か

らなる領 城とコラーゲンリ_{ッチな領 域}と_血管と_{を明確 に区別して心臓の組織をイメージング}

_す

_る ことが可能である。よ

_っ

て、本発明のイメージング方法を用

_い

ること_により_{、虚血に陥}

_っ

た心臓にお

い

て、正常に機能

す

る_領城と_{心筋 細胞が壊 死して線維化 した領城}と_を的 確 に見分 けること_が可能と_{なる。また、本発明に}より_{、心臓におけ}る_{血管の存在を明} 瞭に判別

す

ること_{ができる。}よ

_っ

_て、本発明の方法を用

_い

て、心筋梗塞を起 こした心 臓における血管の有無を調_べること_{が可能であ}り_、そ

_れ

_{を治療の手段}

_や

_{計画の決定} に役立てること_{ができる。}

図

面

の

簡

単

な

説

明

００16 図 図 は、代 表的な生きたままの心筋 細胞の細胞質と

_へ

ムタンパク質のラ_マンスペ クト_{ルの測定に関}

す

_{る。図 は、}摘出した心臓全体と光学系のセ_ッテ_ィングの模式 図を示

す

。図 は、心外膜下領城の自家蛍光イメージを示

す

。図

C

は、図 中の アスタリ_スクで示さ

_れ

た(a) 心筋 細胞(_レーザーパワー

2

０

W

、照射時間 5秒)、(

b )

還 元型シトクロム

b5

( 5０は

)

及び(c) 還 元型シトクロムc(

2 5

は

₎

のラマンスペクト ル(レーザーパワー 5

_W

、照射時間

0

秒)を示

す

。ここで、 は心筋 細胞であり 、a_・

u

・は任 意 の単位 を示

す

。 図2 図

2

は、生きた 臓の心筋 細胞と_血管のラ_マンイメージに関

す

る。図

2

は、(a) 心筋 細胞、(

b )

酸素化型赤血 球 及_び(c) 脱酸 素化型赤血 球 のラ_マンスペクト ルを示

す

。赤血 球 のラ_マンスペクト_ルは_レーザーパワー

2

_W

で照射時間

3

秒で得ら

れ

た。図

2

は、代 表的試料中で心臓 表 面

か

ら_得ら

_れ

た自己蛍光イメージを示

す

。四 角で囲ま

_れ

た領城はラ_マンイメージが得ら

れ

た領城 を示して

_い

る。図

2C

は、ラ_マンバ ンドイメージを示

す

。図

2

は、(a) 第 、(

b )

第

2

、(c) 第

3

主成分ス コアイメージ (左 :5 6

₉₆

ピクセ_ル)と各_々の主成分スペクト_{ル(右) を示}

す

_。イメージのための試料は_レー ザーパワー

2

W

で5 6ラインで照明さ

_れ

_た。そ

_れ

_ぞ

_れ

_のラインの照射時間は5秒で 全体の照射時間は

28

０秒である。スケー_ルバーは

2

０

C

は心筋 細胞を示し、 は血 管 を示し、a_・

u

_・は任 意 の単位 を示

す

。 図3 _図

₃

_は、心筋梗塞領城の代 表的な凍結 融解セクション中の心筋 細胞とコラーゲ ンのラ_マンイメージに関

す

る。図

3

は、凍結 融解セク_ションの

_へ

_マト_キシリ_{ンエオシン}

染色を示

す

。図

3

は、_マノソントリクロム染色による心筋梗塞の境 界領 城 のイメ_ーシ を示

す

。図

3C

は、図

3

のホノクスて囲ま

れ

た領城の高解像イメ_ーシを示

す

。図

3

は、図

3C

と_{同し領 城 の白色光イメーシを示}

_す

_。図

₃

_は、図

₃

_のアスタリ_スクに示

_す

線維性 の組織 (上)と_{1型コラーケンのラマンスペク}ト_ル(下) を示

す

。図

3

は、第

2

主 成分ス コアイメーシ (左) ( ０8 7 9ピクセ_ル)と_{その主成分スペ}クト_{ル(右) を示}

_す

_。こ のイメ_ーシは図

3

て示さ

_れ

た領城 を_レーザーパワー 0

W

て ０8ラ_インに照明さ

れ

ること_て得ら

れ

た。そ

れ

そ

れ

のラインの照射時間は5秒て全体の照射時間は54 ０秒 てあ

_っ

た。スケー_{ルハ ー は}5 ０は

(

)

2

０は

(C

， ，

)

てある。

C

は心筋 細 胞を示し、 は線維化した組織を示し、

C

は、コラーケンを示し、a_・

u

_・は任首の卓 位 を示

す

。 図4 図

4

は、生きたまま調製さ

_れ

た心筋梗塞領城における心筋 細胞とコラーケンのラ マンイメーシを示

す

。図

4

は、第

2

主成分ス コアイメーシ (6０ 5 ０ピクセ_ル)と_同し代 表的な試科の白色光イメーシと_{の融合 写真を示}

_す

_。トノト_て示さ

_れ

_たラインは心筋 細 胞の輪 郭 を示して

_い

る。図

4

は、第2主成分スペクト_ルを示

_す

_{。試科はレーザーパ}ワ ー

W

て6 ０ラインに照明さ

_れ

た。そ

れ

そ

れ

のラインの照射時間は5秒て全体の 照射時間は

3

００秒てある。

C

、心筋 細胞。 は線維化した組織を示し、スケー_ル ハ ー は

2

/ てある。

発

明を

実

施

す

る

ための最

良

の形

態

００17 以下、本発明を祥 細に説 明

す

る_か、本発明は、以下に説 明さ

_れ

る_{特定の実施形態} に限定さ

_れ

_{るものてはな}

_い

_{。また当業者てあ}

_れ

_{は、以下に説 明}

_す

_{る実施形態の各 要} 素を本発 明の範囲内にお

い

て容易に変 更

す

ること_{か可能てある。} ００18

一

実施形態にお

い

て、本発明は、以下の工程 ( )

～

(3) を含

む

、心筋組織と_血管 及ひ 又はコラーケンリノチ領城と_を含

_む

_{試科をイメーシン}ク

す

る方怯てある。 ( )心筋組織と_{血管及ひ 又はコラーケン}リノチ領城と_を含

_む

_{試科に励起光を照射}

す

る_工程 ， (

_{2 )}

核試科

か

ら_のラ_マン散 乱光を検出

す

る工程 ， (3) 核検出さ

_れ

_{たラマン散 乱光を、心筋 細胞}と_{赤血 球 及ひ 又はコラーケンに特徴} 的なラ_マン散 乱スペクト_ルと_を指標と_{して解析 し、画像化}

_す

_る工程。

００19 本実施形態における、イメージング対象は、心筋組織と血管及_び 又はコラーゲン リ_ッチ領城と_を含

_む

_{試料である。好まし}く_{は、当該試料は心臓の全体又は}

_一

_部である 。本発明の方法 は、主と_{して正常な心筋 細胞}

_か

らなる領城と_{心筋 細胞が壊 死した領} 城と_{を明瞭に区別}

_す

_ること_{ができるため、虚血に陥}

_っ

_{た心臓の診断に役立てるこ}と_が できる。このよぅな観点

_か

ら、イメージングに供

す

る試料は、虚 血 を起 こした心臓の全 体又は

一

部である。具体的には、虚血により_{狭心症、心筋梗塞、心不全、及び不整} 脈を起 こした心臓である。心臓の

一

部をイメージングの対象と

_す

る場合、その部分 は 当業者が適宜決定

す

ること_{ができる。例えば、心電図}

_や

_{の結 果}

_か

ら決定さ

_れ

_た 部位 をイメージング

す

ることができる。 ００2０ コラーゲンリ_ッチ領城と_{ほ、心筋 細胞が壊 死して網維化した結 果、正常に機能}

_す

_る 心筋 細胞

か

ら成る領城と_{比較してコラーゲンの存在比率が高}

_い

_{領城 である。線維化} の程度に関

す

る定義に

_つい

ては、議論のあるところではあるが、本発明にお

_い

ては にお

_い

て心室壁内5 ０ 以上が線維に置換さ

_れ

て

_い

るところをコラーゲンリ_ッチ 領城と_定義

_す

_ること_{ができる。よ}

_っ

_{て、コラーゲン}リ_ッチ領城と_は、心臓にお

_い

て心筋 細胞が脱落し、心筋組織がその機能を失

_っ

た領城 である。こ

れ

に対 し、正常領 城と_は 心臓にお

い

て正常な心筋 細胞が機能して

_い

る領城 を意 味

す

る。また、血管と_は心筋 内を走行

す

る_{任 意の血 管 を意 味し、動脈及び静脈の}

_い

_ず

_れ

も含 ま

れ

る。特に、心筋 細胞 近傍に存在

す

る小血管のイメージングは組織 細胞_レベ_ルの代謝を見る上で重 要である。 ００21 該試料は、心筋組織と_血管と_を含

_む

_ものであ

_っ

_{ても、心筋組織}とコラーゲンリ_ッチ領 城 を含

む

ものであ

_っ

てもよ

_い

。好まし

_い一

実施形態にお

_い

て、該試料は、心筋組織、 血管及_びコラーゲンリ_{ッチ領城 を含}

_む

_{。また、他の実施形態にお}

_い

_{て、該試料は、血} 管とコラーゲンリ_{ッチ領城 を含}

_む

_ものであ

_っ

_てもよ

_い

_{。該試料には、心筋組織、コラー} ゲンリ_{ッチ領城及び血管の他に、他の細胞}

_や

_{組織が含 ま}

_れ

_て

_い

_てもよ

_い

_。例えば、炎 症 細胞、脂肪組織が含 ま

れ

てもよ

_い

_。 ００2 2 本実施形態のイメ_ージング方法は、上記のよぅな試料に励起光を照射

す

る工程を 含む。励起光は、試料に照射

す

ること_によ

_っ

_て試料を構成

す

る物質 に固有 のラ_マン 散 乱光を生じる_レーザ光である。励起光は、当該技術 分野にお

_い

て使用さ

_れ

る任 意

の励起光を使用

す

ること_{かてき、心筋 細胞}と_血管とコラーケンと_を識別

_す

_{るために適} したラ_マンスペクト_{ルを得る観点}

_か

_{ら適正選 択}

_す

_ること_{かてきる。よ}

_っ

_{て、励起光の波} 長は特に制限さ

_れ

な

_い

か、好ましく_は

_へ

_{ム蛋白の共㎎波長4００}

～

_{6００ てあ}り_、より 好ましく_は5００

～

_{6００ てある。特に好まし}く_{は、5 32 の}

_Gレ

_ーザを使 用

す

ること_{かてきる。} ００2 3 試科に励起光を照射

す

るための手段は、ラ_マン分光怯にお

_い

て通常用

_い

ら

れ

る、 レーザ光を発

す

る手段てあ

れ

は特に制限なく_使用

_す

_ること_{かてきる。} ００2 4 本実施形態のイメ_ーシンク方怯は、次

_い

て、試科

か

ら発

せ

ら

_れ

るラ_マン散 乱光を検 出

す

る工程を含

む

。ラ_マン散 乱光を検出

す

る手段は、ラ_マン散 乱光を検出し、そ

れ

を 画像化処理

す

るための信号に変換

す

ること_{か可能 なものてあ}

_れ

_{は特に制限}さ

_れ

_す

_、 当核分野にお

_い

て公知 の検出手段を適正選 択して使 用

す

ること_{かてきる。例えは、} 受光素子か_マトリ_{クス上に配列}さ

_れ

_た工リ_{アセンザを検出手段}と_{して使 用}

_す

_ること_かて きる。より_{具体的には、画素かアレイ状に配置}さ

_れ

_{た二次元C C を}ラ_マン散 乱光の 検出手段と_{して好適に使 用}

_す

_ること_{かてきる。} ００2 5 好まし

_い

実施形態にお

_い

ては、試科

か

らのラ_マン散 乱光は、その検出に先立

_っ

て、 タイクロイノクフ_ィルタ等により_励起光と_{同し波長 を有}

_す

_{る反射 光}と_分離さ

_れ

_{る。さらに} 、分離さ

_れ

_たラ_マン散 乱光は、回折格子

や

ブリ_スム

_か

ら成る分光素子によ

_っ

_{て光 の波} 長に応 して空間的に分光さ

_れ

_る。分光さ

_れ

_たラ_マン散 乱光は上述のよぅな検出手段 に_お

_い

てラ_マンスペクト_ルを表

す

信号に変換さ

_れ

、パーソナ_ルコ_ンピ

_ュ

ータ等の解析 手段に出力さ

_れ

_る。 ００2 6 本実施形態のイメーシンク方怯は、さらに検_出さ

_れ

_たラ_マン散 乱光

_か

ら得ら

れ

たス ペクト_ル情報を、パーソナ_ルコンピ

_ュ

ータ等の解析手段に記惜さ

_れ

た心筋 細胞、赤血 球及ひ 又はコラーケンに特徴的なラ_マンスペクト_ルを指標と_して解析さ

_れ

_、画像化 さ

_れ

_{る。解析及ひ画像化は、当核技術 分野に公知 のソフ}トウ

_ェ

アを用

_い

てパ ーソナ_ル コンピ

_ュ

ータ等によ

_っ

て処理さ

_れ

る。例えは、 (Ma hwo _ks社)を用

_い

て解 析し画像化

す

ること_{かてきる。} ００2 7 心筋 細胞に特徴的なラ_マンスペクト_ルと_は、心筋 細胞に対 して励起光を照射して得 ら

_れ

る、心筋 細胞に固有 のラ_マン散 乱光のスペクト_{ルてある。同様に、赤血 球に特徴}

的なラ_マンスペクト_ルと_{は、赤血 球に対 して励起光を照射して得ら}

_れ

_{る、赤血 球に固} 有のラ_マン散 乱光のスペクト_ルであり_、コラ_{ーゲンに特}徴_的なラ_マンスペクト_ルとは、コ ラーゲンに励起光を照射して得ら

_れ

る、コラーゲンに固有なラ_マン散 乱光のスペクト ルである。赤血 球は、酸素化型赤血 球と_{脱酸 素化型 赤血 球}と_の

_い

_ず

_れ

_であ

_っ

_てもよ

い

。試料に含 ま

れ

る_血管に

_つい

_て、動脈

_か

_静脈

_か

_を識別

_す

る場合は、酸素化型赤血 球及_び脱酸 素化型 赤血 球に特徴的なラ_マンスペクト_{ルを各々の指標}と_{して使 用}

_す

る ことができる。 ００28 心筋 細胞に特徴的なラ_マンスペクト_ルを指標と_して解析

_す

ると_は、心筋 細胞に特徴 的なスペクト_ルと_合致

_す

_{るラマンスペク}ト_ルを示

_す

_{ラマン散 乱光が得ら}

_れ

_る

_か

_否

_か

_によ

っ

て、そのラ_{マン散 乱光を発}

_す

る試料中の部位が心筋 細胞である

_か

判定

す

るとレ_ぢこ と_{である。同様に、試料中の特 定 の部位が血管に相当}

_す

_る

_か

_どぅ

_か

_は、試料

_か

_らのラ マン散 乱光が赤血 球に固有 のラ_マンスペクト_ルを示

_す

_か

_否

_か

_によ

_っ

_て判定さ

_れ

_る。コ ラーゲンリ_{ッチ領城に}

_つい

_{ても同様に、コラーゲンに特徴的なスペク}ト_ルを示

_す

_ラマン 散 乱光を放

つか

否

_か

によ

_っ

_て判定さ

_れ

_る。 ００29 心筋 細胞に特徴的なラ_マンスペクト_ルの

_一

_{例は、実施例}

₍

_図

₎

_に示さ

_れ

_{る。図 に} 示さ

_れ

るよぅに、心筋 細胞を の_レーザ光で励起した場合のラ_マンシフト

₇₅

c

3

０

c

、及_び

58

2

c

におけるピークを指標と

_す

ることができる。実施例 に記載さ

_れ

るよぅに、前記のラ_マンシフト_{のビークパターンは、心筋 細胞中のシ}ト_クロ ムに起因

す

るも_{のである。酸素化型赤血 球 及び脱酸 素化型 赤血 球に特徴的な}ラ_マ ンスペクト_ルの

_一

_{例は、実施例}

2

(

_図

_{2 )}

_に示さ

_れ

る。図

2に

示さ

_れ

るよぅに、酸化型赤 血 球を の_レーザ光で励起した場合のラ_マンシフト

₃₇

c

582

c

_及 び

637

c

におけるピークを指標と

_す

ること_{ができる。また、還 元型赤血 球 を}

₅₃

2

の_レーザ光で励起した場合のラ_マンシフト

355

c

545 c

及_び

6

０

。

におけるピークを指標と

_す

ることもできる。こ

_れ

らのラ_マンシフトのビークパタ_ーンは 、赤血 球中の

_へ

モグロビンの存在に起因して

_い

る。コラ_{ーゲンに特}徴_的なラ_マンスペ クト_ルの

_一

_{例は、実施例}

3

(

_図

_{3 )}

_に示さ

_れ

る。本発明では、こ

れ

らのスペクト_ルを使用

す

ること_により_{、正常な心筋組織と血管とコラーゲン}リ_{ッチな領域とを明瞭に区分 けし} てイメージング

す

ること_ができる。

００3０ イメージングの対象と_{なる試料全体}

_か

_ら得ら

_れ

_{るラマンスペク}ト_{ルの分布は、解析手} 段と_{して主成分分析 を用}

_い

_て実施さ

_れ

_る。 ００31 主成分分析 は多変呈解析 の

_一つ

であり_{、複数の観測変数}

_か

_ら、そ

_れ

_{を要 約}

_す

_る合 成変数

(

主成分と_呼ぶ

)

_を作り_出

_す

_{分析 法である。従}

_っ

_{て、ラマンスペク}ト_{ルの解析 に} お

_い

ては、イメージング対象

_か

ら得ら

_れ

る複数のラ_マンスペクト_ル

_か

_{ら、その試料の}

_い

く

_つか

_{の成分を特徴づけるスペク}ト_{ル形体を抽 出}

_す

_{る目的で使用}

_す

_ること_{ができる。} 主成分 の計算原理と_{しては、(1) 全ての変数を標 準化}

_す

_る、(2)情報のロスを最小限 に

す

る_{ために、主成分 の分散値が最大にな}るよぅ_{に、主成分 の軸を設定し、さらに主} 成分 同上の相関を

0

に

す

る、(3) 決 定さ

_れ

_{た主成分 の分散が大き}

_い

_{順に第 主成分、} 第

2

主成分、第

3

主成分と

_す

_{る、(4) 主成分の軸 に対応}

_す

_る重

_み

_{係数を最小 二乗法} を用

_い

て計 算

す

る。このよぅ_{にして得ら}

_れ

_た主成分スペクト_ルに対

_す

_{る、個々のラマン} スペクト_ルの得点

(

_{主成分ス コア}

)

_{を計 算し、この値をプロッ}ト_し画像化

_す

_る。 ００32 以上に説 明した、試料_への励起光の照射、試料

_か

らのラ_マン散 乱光の検_出、検_出 さ

_れ

たラ_マン散 乱光のラ_マンスペクト_{ル信号への変換、及びラマンスペク}ト_ルの解析 及_び画像化とぅ

_一

_{連の工程は、例えば、特開}

₂

_００

₇

₄₇₃₅₇

_に記載さ

_れ

_る方法

_や

市販さ

_れ

_て

_い

るラ_マン分光イメージング装置

(

例えば、ナノフオ トン社製のラ_マン顕微 鏡

)

を用

_い

て行ぅ_こと_{ができる。} ００33

一

実施形態にお

_い

て本発 明は、ラ_マン散 乱光検_出手段により_検出さ

_れ

_た、心筋組 織と_{血管及び 又はコラーゲン}リ_ッチ領城と_を含

_む

_試料

_か

らのラ_マン散 乱光を、心筋 細胞と_{赤血 球 及び 又はコ}ラーゲンに特徴的なラ_マン散 乱スペクト_ルと_を指標と_して 解析 し、画像処理

す

る工程を含

む

、心筋組織と_{血管及び 又はコラーゲン}リ_ッチ領 城と_を含

_む

_試料をイメ_ージング

す

る方法である。本実施形態の方法 は、ラ_マン散 乱光 と_して得ら

_れ

る情報を解析処理して、当該 光の発信源である試料を画像と_して表示

_す

る_{方法である。}本実施形態における方法は、上述

す

る実施形態の説 明に従

_っ

て実施

す

ること_{ができる。} ００34

一

実施形態にお

い

て、本発明は、

(

₎

心筋組織と_{血管及び 又はコラーゲン}リ_ッチ 領域と_{を含む領域を含む試料に励起光を照射}

_す

_る手段、

(

)

前記試料

_か

らのラ_マン 散 乱光を検出

す

る_手段、

(

_{C )}

該検出したラ_マン散 乱光を心筋 細胞と_{赤血 球 及び 又}

はコラーゲンに特徴的なラ_マン散 乱スペクト_ルを指標と_{して画像処理}

_す

_{る手段、を備} える心筋組織と血管及_び 又はコラーゲンリ_ッチ領城と_を含

_む

_{試料をイメージング}

_す

るためのイメージング装置である。本発明のイメージング装置における (

₎

励起光照 射手段、( )ラ_マン散 乱光検出手段、及び(_{C )画像処理手段は、某本的には当該技} 術 分野にお

_い

て公知 のラ_マン分光法を領したイメージング装置にお

_い

て用

_い

ら

れ

る 手段をそのまま又は適宜改良を加えて使用

す

ること_{ができる。好まし}く_は、(

₎

_励起 光照射手段及_び( ₎ラ_マン散乱光検出手段は、外科手術時に心臓に対してレーザ 光の照射し、心臓

_か

らのラ_マン散 乱光を検出

す

ると

_い

ぅ観点

_か

ら、

_い

ず

れ

も細長

_い

ア ームの先端で_レーザ光の放出及_びラ_マン散 乱光の検出ができる形 状を有

す

る。

実

施

例

００3 5 _{以下、実施例 を参照して本発 明を更に具体的に説 明}

す

_{るが 、本発明は以下の特 定} の実施例に限定さ

_れ

るものではな

_い

。 ００3 6 _試験例 ガ

，

_{硫柚突み祀}

_刊

十

ガ

，

_{臓モデルの調製} 後述

す

る実施例 で使用 した検体は、次のよぅ_{にして作成}さ

_れ

_{た。心臓全体の検体}( 二 2 )は、 ００ 酸素供給下で全身麻酔の下、若

_い

成体ウ_ィスターラ_ット(体重2 5０ ００、雌)

_か

_ら取り_出さ

_れ

た。下大静脈

_か

ら_塩化カリ_{ウム (０ 2 )を投 与して心} 筋 細胞の収縮を止めた後、心臓

か

ら_の

_す

_{べての血 管 を結 紮し}、血液で冠 状 血 管 を満 たして心臓を摘_出した。心臓はタイロード溶 液(4oC

_{7 4)}

に静置し摘_出後の代謝 分解 を最小限にした。酸素化型の血液 及_び脱酸 素化型の血液 は、各_々3匹のラ_ット の左心房及_び

石

心房

_か

ら得た。 ００3 7 心筋梗塞は3 3匹のラ_ット_{の左下行冠 状動脈を完全に結 紮}

_す

_ること_で作製さ

_れ

_た。2 8 日後に2０匹の生存ラ_ット

_か

ら心臓を慎 重に摘出した。 2個の心臓を即座に液体空 素で凍 結し、検証まで Cで保 存した。残る8

_つ

の心臓は生きたまま調製さ

_れ

_た。 凍結ザ_ンプルは5 は の厚さのセクションにクリオスタット( _E C A

w e z e

e man ) でスライスした。ラ_マン分析 のザンプ_ルは0_・ 7 の厚さ_の石英ガラス(Ma s n a m、 大 阪、日本)に載

_せ

ら

_れ

、 のP S(

₇

4 ) で湿

_っ

た状態に保た

れ

た。_ヘマト キ_シリ_ン

_ェ

_{オシン染色}と_マッソントリ_{クロム染色を用}

_い

_{て切 片 の組織を確認 した。生き} た心臓は横 方向に切ら

れ

梗塞領城は肉眼で確認さ

_れ

_た。そ

_れ

ら_は

～

2 の厚さ

のスライスに切断さ

_れ

_{た。生きた試科を用}

_い

_た後述の試験は、摘出後 時間以内に完

了

した。

００3 8 宝怖 例 心筋 細胞_の細胞

_宵

_のラ_マンスペクト_ル

生きたまま調製さ

_れ

た損傷のな e x

v

voL臓の心外膜下

_か

ら得ら

れ

た心筋 細胞の 細胞_{質 の}ラ_マンスペクト_ルを_レーザーラ_マンコ_ンフ

_ォ

ーカ_ル顕 版_鏡(RA MAN _Nan

opho on、大 阪、日本)_を用

_い

_て側定した。取り_出さ

_れ

た心臓を顕微鏡のステ_ーシ上の 石英某盤の上に置

_い

た後、心筋 細胞を確甜

す

る_{ために、自家蛍光画像を利用 した。} 自家蛍光は、3 3 ０

～

波長て励起し、4 2 ０ 波長以上て検出した(図 ) こ

れ

により_{心筋 細胞を同定し、焦点を合わ}

_せ

_た後、フイ_ルターを変 更しラ_マンスペクト ルを採取した(図 C )。_レーザー強度は W、照射時間は5 秒 てあ

_っ

た。使用 した 顕微鏡の構 造 は

a ada

Y e a 2 ００8

oc

P E Vo 6853 6853０8に図示さ

_れ

て

_い

る。心筋 細胞のラ_マンスペクト_ルは、レ_ぺ

_つか

の_ラ マンハントを含

み

、主と_{して6 ００} 643 69 ０751 1００3 113０ 117 1 13０7 ₁336 1356 1396 14 5 ０ 1582 1657 2854 及_ひ2932 Cm

・

てある( ) その中て 7 51(v 5 mode) 113０(v 2 2 mode) 及 ひ 1582 (v g mode) Cm か

へ

ムタンパク質の中心にあるボルフイリン環

か

ら生した 特定の振動モートと_考えら

_れ

_る。ヘムタンパク質の中ても、還 元型_のシトクロム

b 5

及 ひc のピークか心筋 細胞のピークとよく_対応

_す

_る。シトクロム

b 5

及ひc は、代 表的な

_へ

ムタンパク質て電子吸収帯の

_一つ

てあるぽ ハ ントを52 ０

～

波長にも

つ

。ミオ ク ロヒンは本実施例の条件下ては心筋 細胞のスペクト_ルにほと_んと_寄与して

_い

_な

_い

と 考えら

れ

る。な

せ

なら、光乖離現象によ

_っ

てオキ_シミ_{オク ロヒンのラマンスペク}ト_ルを 得ること_か難し

_い

ことと、テオキ_シミ_{オク ロヒンはスペク}ト_ルのパターンに違

_い

かある

_か

ら_てある。 ００3 9 実施例2 生きたe x

v

voガ

，

_臓の心筋 胞と _{管 の}ラ_マン細織イメーシ シトクロムのラ_マンスペクト_ルは、_ヘモク ロヒンのラ_マンスペクト_ルと多く_{の共通 点を有}

す

る。ヘモク ロヒンによる心筋 細胞のシトクロムの検_出に

干

渉

す

る可能性 を除外

す

る ためには、心臓組織中の二

_つ

の

_へ

ムタンパク質を分別

す

る必要かある。酸素化型及 ひ脱酸 素化型 赤血 球は、そ

れ

そ

れ

左心房及ひ右心房

_か

ら、ヘパリ_ン入り_シリ_ンシに 採取した。そ

れ

そ

れ

少呈を石英某盤 上に摘下し、自家蛍光画像て赤血 球 の形態を

確認 し、 。図2 は心筋 細胞、酸素化型赤血 球 及_び脱酸 素ィヒ_{型赤血 球に 。こ}

_れ

_{らの特徴的なラ} マンバンドは よく_対応

_す

_{る。特に 4モード(酸素化マーカーバンド、135 ０}

₁₃₈

_{０Cm レンジ)及び} v gと v ０モード(15００

165

０Cm レンジ)に対応 したバンドである。こ

れ

らのラマン バンドは赤血 球 中の

_へ

モグロビン

_か

ら生じて

_い

る。図2 Bは心外膜下の心筋 細胞と_そ の近傍の小血管の 日家蛍光画像である。自家蛍光は、3 3０

～

波長 で励起し 4 2０ 波長以上で検出した。図2 Cは図2 で示さ

_れ

_た心外膜下傾城

か

ら得ら

れ

た そ

_れ

ぞ

_れ

の特徴的なラ_マンバンドでのラ_マンバンドイメージを示して

_い

る。心筋 細胞を 表

す

1 13 ０(v 2 2) Cm

・

とオキシヘモグロビンを表

す

1582 (v 9 )及び 1637 (v ０)Cm とは、_{別 々}にイメージさ

_れ

得るが、デオキ_シヘモグロビ_{ン単独 でイ}メージ

す

ることは、 オキ_シヘモグロビ_ンの1582 Cm でのバンドの裾 の部 分で邪魔さ

れ

るため不可能であ る。オキ_シ及びデオキ_シヘモグロビ_ンの両者が 1545 Cm のバンドを指標と

す

ることで 画像ィヒ_さ

_れ

_る。 スペクト_{ルの差典 を同定し、同定}さ

_れ

た多数のバンドを化_学マッピングのために使 用

す

るため、同じ領城

か

ら得ら

れ

た5264 (56 _{9 4}ピクセ_ル)個のラ_マンスペクト_ルに

つい

て主成分分析(P C ₎が行 わ

れ

た。P C は、MAT _AB (Ma hwo _ks Na ck Ma s s)とNanophoton ソフトウ

_ェ

アを用

_い

て行 わ

_れ

、大きなイメージデ ータの中

_か

ら意味の ある内在

す

る変数を同定した。そ

れ

ぞ

れ

の主成分( C )スペクト_ルに対応

_す

_{る Cス コ} アを、イメージ中の個_々のラ_マンスペクト_ルにお

_い

_{て計 算した。その}ス コアを正と_負で 分離し、空間情報を与えプロ_ット_{し、画像化を図}

_っ

_た。このス コアイメージはイメージ処 理ソフトウ

_ェ

ア( m a g e J Na ona n s u e s O ea h)を用

い

て行

っ

た。第 主成分が 心筋 細胞のスペクト_{ルを抽 出し、そのス コ}アイメージは心筋 細胞そ

れ

自体の存在を示 した。第2主成分ス コアイメージと主成分スペクト_ルに示さ

_れ

るよう_{に、還 元型のb 及び} c_型シトクロム(75 1及_び 1 13 ０Cm

・

)を含んで

い

る心筋 細胞と

へ

モグロビン(1545 15 8 2 16 ０1，及_び 1637 Cm ) (図2Db)で満たさ

れ

た周りにある 、さな血管を同定

す

ることが できた。興味深

_い

こと_{に第3主成分ス コ}アイメージと主成分スペクト_ルは典なる状態の

へ

モグロビンを表して

_い

た。オキ_シ(137 1 1582 ，及_び 1637 Cm

・

)及びデオキシ(1355