総 括研 究 報 告書

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平 成 28 年 度厚 生 労 働 科学 研 究 費補 助 金 （ 食品 の 安 全確 保 推 進 研究 事 業 ） 食 品中 の 微 生物 試 験 法 の開 発 及 びそ の 実 効 性・ 妥 当 性評 価 に 関 する 研 究

総 括研 究 報 告書

研究代 表者 五十 君静 信 東 京農 業大学 応 用生物 科学 部

研 究 要 旨

本研究 では、食品 にお ける微 生物 試験法 のメ ソッド バリ デーシ ョン の手法 を検 討し 、 統 一 し た 方 向 性 を 持 ち 、 科 学 的 根 拠 の あ る 信 頼 性 の 高 い 標 準 試 験 法 の 作 成 を 行 う 。こ れ ま で の 研 究 班 の 成 果 で あ る 標 準 試 験 法 作 成 方 針 に 従 い 、 セ レ ウ ス 菌 、 エ ル シ ニ ア・

エ ン テ ロ コ リ チ カ 、 セ レ ウ リ ド な ど 食 中 毒 起 因 菌 毒 素 、 衛 生 指 標 菌 な ど の 標 準 試 験法 を 作 成 す る 。 今 後 リ ス ク 評 価 の 結 果 を 受 け て 作 成 さ れ る 食 品 の 微 生 物 基 準 に 利 用 可能 な試験 法と なるよ う に ISO 法 などと 互換 性のあ る妥 当性確 認さ れてい ると 認めら れる 試 験 法 を 提 供 す る 。 さ ら に 、 作 成 さ れ た 標 準 試 験 法 を 精 度 高 く 実 施 す る た め に 必 要な 導入時 の検 証、微 生物 標準品 の設 定、試 験精 度の管 理に 関する 基礎 的研究 を行 う。

食中毒 起因 細菌や 衛生 指標菌 の試 験法に 関す る専門 家 、約 20 名程 度から なる“標 準 法 検 討 委 員 会 ” を 組 織 し 、 こ れ ま で の 研 究 班 に よ り 作 成 さ れ た 標 準 試 験 法 作 成 方 針に 従 い 、 微 生 物 標 準 試 験 法 の 作 成 を 行 っ た が 、 国 際 的 に も ま だ 確 立 し て い な い 検 討 結果 の 統 計 処 理 方 法 と そ の 評 価 方 法 に つ い て は 、 実 際 の 試 験 法 作 成 の 検 討 デ ー タ を 基 に策 定 を 進 め た 。 こ れ ら の 試 験 法 策 定 過 程 は 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 ホ ー ム ペ ー ジ 上に 公開し 、一 般にも 広く 意見を 求め た。

研 究 班 の 行 う 当 該 微 生 物 の 試 験 法 策 定 は 、 そ れ ぞ れ 作 業 部 会 を 組 織 し 本 研 究 班 の 代 表 、 分 担 、 協 力 研 究 者 が 標 準 法 の 妥 当 性 確 認 に 必 要 と 思 わ れ る デ ー タ の 作 成 に あ たっ た。各 作業部 会は 、４ つのス テー ジから なる“食品 からの 微生 物標 準試験 法作 成方針 ” に従い “ 標準 法検討 委員会 ”の評 価を 受け ながら 作業 を進め た。各作業 部会 の標準 試 験法作 成は 、3年目 の 平成 28 年 には コラボ 案作成 及び 最終試 験法 の検討（ス テージ ３

～４ ）、標 準試 験法と した。

平 成 28 年 度 は 、 セ レ ウ ス 菌 試 験 法(NIHSJ-28)、 エ ル シ ニ ア 試 験 法(NIHSJ-27、 NIHSJ30TS)、セレ ウリ ド試験 法(NIHSJ-26TS)につい て、コ ラボ 案及 び最終 案の 検討（ ス テージ ３～ ４）を 行っ た。試 験法 のバリ デー ション（妥 当性確 認）に関し ては 、ISO 16140 を基に した ガイド ライ ン作成 を目 的とし 、AOACから出さ れた バリ デーシ ョン に関す る 新 し い 文 書 や 海 外 の 第 三 者 認 証 機 関 の 妥 当 性 確 認 の プ ロ ト コ ー ル な ど を 参 考 に 検 討を 進 め 、 標 準 試 験 法 の 妥 当 性 確 認 ガ イ ド ラ イ ン 案 を 標 準 試 験 法 検 討 委 員 会 で 検 討 し た。

衛 生 試 験 法 に つ い て は 、 関 連 用 語 の 整 理 、 集 落 計 数 法 、 妥 当 性 確 認 の 方 法 に つ い て検 討 を 進 め た 。 ま た 、ISO 法 と 従 来 の 国 内 の 公 定 法 と の 試 験 結 果 の 相 違 に つ い て 検 証 を 行 っ た 。 他 の 研 究 班 に よ り 進 め ら れ て い る ウ ェ ル シ ュ 菌 標 準 試 験 法(NIHSJ-29)に つ い ても、 定性 試験法 策定 を行っ た。

研究分 担者 ：

松岡英 明:東京 農工大 学大学 院

荻原博 和:日本 大学生 物資源 科学 部 鎌田洋 一:岩手 大学農 学部

2 岡田由 美子:国 立医薬 品食品 衛生 研究所

伊豫田 淳:国立 感染症 研究所

Ａ． 研究 目的

食品が 国際 的に流 通し ている こと から 、 食品の 微生 物制御 は各 国間で 共通 である ことが 重要 であり 、微 生物汚 染状 況を確 認する 微生 物試験 法は 国際的 に共 通性が あるこ とが 重要で ある 。ISO 法は その標 準的な 方法 として 示さ れてい る。 ただ、

それぞ れの 国の食 品事 情は異 なっ ており 、 必ずし も国 際的に 統一 した試 験法 のみを 用いて いる わけで はな く、多 くの 国では その国 のリ スクマ ネー ジメン トに 適する 試験法 を採 用して いる 。異な る試 験法の 妥当性 確認 を行う ため に、ISO16140 では 試験法 の妥 当性を 評価 する方 法に ついて 示され てお り、こ れに 従い科 学的 根拠の ある妥 当性 確認が 行わ れた試 験法 が作ら れてい る。

わが国 の微 生物試 験法 は、こ れま で行 われた 厚生 労働科 学研 究班の“食 中毒起 因細菌 の標 準とな る試 験法が どの 様にあ るべき か” の議論 によ り、国 際的 なレベ ルで妥 当性 確認さ れた 標準試 験法 を作成 する手 順が 示され 、そ れに従 い標 準試験 法が作 成さ れてき た。 本研究 班も その方 針を引 き継 ぎ、早 急に 対応が 必要 と思わ れる微 生物 の標準 試験 法の策 定を 行う。

厚労省 が報 告を義 務づ けてい る食 中毒菌 のうち 、セ レウス 菌、 エルシ ニア ・エン テロコ リチ カ、加 えて 食中毒 起因 菌の産 生する 毒素 、さら には 食品の 工程 管理に 利用さ れる 衛生指 標菌 試験法 など につい て標準 試験 法の策 定を 試みる

標 準 法 検 討 委 員 会 で は 、“ 食 品 か ら の 微生物 標準 試験法 作成 方針” を作 成し、

試験法 作成 手順に つい てはほ ぼ確 立して いる。 一方 、作成 され た試験 法の 妥当性 の確認 方法 につい ては 、国際 的に も現在 まだ議 論が 続いて いる 状況で あり 更なる 検討を 必要 として いる 。従っ て、 本研究 班では 妥当 性確認 の適 用方法 を中 心に議

論を進 める 。妥当 性確 認に必 要と される データ 数と 統計手 法の 選択、 統計 値の解 釈、コ ラボ スタデ ィの 規模、 微生 物標準 品をど うす るかな どを 検討す る。 加えて 標準法 が整 備され た後 、食品 にお ける微 生物試 験を 行うに あた り標準 試験 法をど のよう に導 入し、 また 試験精 度を 担保し ていく かに 関して も検 討を行 う。

Ｂ． 研究 方法

約 20 人 の 食 品 微 生 物 の 専 門 家 で 構 成 する“標 準法 検討委 員 会”（親委 員会）を 組織す る。この 親委員 では 、“食 品か らの 微生物 標準 試験法 作成 方針” に従 って、

作業部 会か ら提案 され る試験 法の プロト コール 案の 検討・ 評価 を行う 。当 該微生 物の試 験法 案の提 案は 、作 業部会 が行 う。

作業部 会は 、４つ のス テージ に従 い試験 法の作 成を 進めた 。

ス テ ー ジ １ ： 当 該 微 生 物 の 試 験 法 に 関 する情 報収 集を行 い、 海外の 試験 法との 互換性 を考 慮する と共 に、今 後検 討の必 要が必 要と 思われ る箇 所を指 摘し たプロ トコー ル原 案を作 成す る。ス テー ジ２：

公開に よる 意見な どを 考慮し 、原 案の検 討事項 につ いて整 理し 、具体 的な データ を基に 試験 法のプ ロト コール の妥 当性を 検討し 、検 討デー タを 付けて 作業 部会案 として 親委 員会に 改良 した試 験法 プロト コール を提 出する 。ス テージ ３： 作業部 会案は 一定 の期間 の評 価を受 けた 後、指 摘され た問 題点等 につ いては 、追 加実験 を 行 い 修 正 ま た は 確 認 を 行 っ た 上 で 、

“コラ ボ案 ”とす る。 コラボ 案で は、試 験法 を SOP化 し、用い る培地 等の 調査を 行い、 その 組成表 を作 成する 。親 委員会 では初 年度 に検討 した “メソ ッド バリデ ーショ ンの 手法” を基 に、具 体的 なコラ ボの実 施方 法につ き明 らかに し、 コラボ 案とし て公 開する 。ス テージ ４： コラボ 案の公 開と 共に、 コラ ボ参加 希望 機関を 募り、最 終的 には 15 カ所程 度の 試験・検 査機関 、地 方衛生 研究 所、検 疫所 、大学

3 などに 協力 してい ただ き、プ ロト コール の実行 性を 評価す るコ ラボス タデ ィを行 う。コ ラボ の結果 は、 コラボ 作業 部会で 統計的 な検 討を行 う。 親委員 会は 、コラ ボの結 果と 作業の 進行 が作成 方針 に従っ て行わ れて いるか の確 認を行 った 後、標 準法と して 公開す る。

こ れ ら の 試 験 法 策 定 過 程 は 国 立 医 薬 品 食品衛 生研 究所ホ ーム ページ 上に 公開し 、 一般に も広 く意見 を求 めた。

研 究 班 の 行 う 当 該 微 生 物 の 試 験 法 策 定 は、それぞ れの 作業部 会を組 織し 進めた 。 本研究 班の 代表、 分担 、協力 研究 者が、

作業部 会を 組織し 具体 的な標 準法 案策定 の作業 にあ たった 。各 作業部 会は 、“ 食品 からの 微生 物標準 試験 法作成 方針 ”に従 い “標準試 験法 検討 委員会”の評 価を受 けなが ら作 業を進 めた 。H28 年度 の試験 法の策 定は 、作業 部会 案の検 討及 び最終 試験法 の検 討（ス テー ジ３～ ４） を行っ た。

研 究 分 担 は 、 研 究 総 括 と 標 準 法 検 討 委 員会運 営は 五十君 が担 当した 。検 討委員 会の事 務局 は岡田 が担 当した 。妥 当性評 価は松 岡が 担当し 、五 十君も 協力 した。

試験法 プロ トコー ルの 作成は 、セ レウス 菌（荻原 が担 当）、食中 毒菌毒 素セ レウリ ド 試 験 法(鎌 田 が 担 当)、 エ ル シ ニ ア ・ エ ンテロ コリ チカ（岡 田 が担当 ）、衛 生指 標 菌（伊 豫田 淳が担 当、五十君 、（ 一財 ）食 品分析 セン ター 、（一 財）日本冷 凍食 品検 査セン ター が協力 ）衛 生指標 菌は 集落計 数法の 作業 部会を 組織 した。 各作 業部会 は“食 品か らの微 生物 標準試 験法 作成方 針”に 従い 、試験 法作 成を進 める 。４つ のステ ージ で検討 を進 めるが 、そ れぞれ のプロ トコ ール案 は、 国立医 薬品 食品衛 生研究 所の ホーム ペー ジ上に 公開 し、広 く意見 を求 める。H28 年度に 、ス テージ ４まで 進め た。

これに 対応 し“標準 試 験法検 討委 員会 ” は H28年度 に６ 回開 催し、そ れぞ れの標 準試験 法策 定が適 切に 行われ てい ること

を確認 する と共に 、微 生物試 験法 の妥当 性確認 の手 法を ISO 16140を基 に AOAC のバリ デー ション ガイ ドライ ン、 海外の 第三者 認証 機関が 示し ている プロ トコー ルなど を参 考とし 検討 し、ガ イド ライン 原案の 検討 を開始 した 。

他 の 研 究 班 で 食 品 微 生 物 に 関 す る 試 験 法の作 成を 行う場 合は 、その 研究 班と協 力し“ 食品 からの 微生 物標準 試験 法作成 方針” を基 に“標 準試 験法検 討委 員会”

が標準 試験 法の作 成の 方向性 を示 した。

平成 28 年 度は 、特 定非 営利活 動法 人食の 安全を 確保 するた めの 微生物 検査 協議会 が中心 とな って進 める ウェル シュ 菌試験 法につ いて は、定 性法 につい て作 業部会 案から コラ ボ案作 成（ ステー ジ３ ）の検 討を行 った 。

Ｃ． 研究 結果

食品微 生物 の専門 家 19 名で構成 する

“標準 試験 法検討 委員 会”を 組織 した。

この委 員会 は試験 法案 を検討 し、“ 食品か らの微 生物 標準試 験法 作成方 針” に従い 標準試 験法 策定に あた った。 汚染 指標菌 の標準 試験 法は、ISO 法の酵 素基 質培地 を用い た大 腸菌試 験法 につい て検 討し、

その試 験法 案の作 成を 行った 。衛 生指標 菌・バ リデ ーショ ン合 同作業 部会 から提 出され た資 料を基 に妥 当性確 認に 関する 方法論 に関 する議 論を 進めた 。

それぞ れの 標準試 験法 案プロ トコ ール の作成 は、 作業部 会単 位で進 めた 。セレ ウス菌（荻 原 、岡田 、五十君 ）、エ ルシニ ア（岡 田）、衛 生指標 菌（伊豫 田、五 十君 、 日本食 品分 析セン ター 、日本 冷凍 食品検 査協会 ）の 試験法 案に ついて 各作 業部会 で検討 を行 った。 その 検討内 容に ついて は各作 業部 会の分 担研 究報告 書を 確認し ていた だき たい。 標準 試験法 検討 委員会 は“食 品か らの微 生物 標準試 験法 作成方 針”に 従い 、試験 法策 定を進 めた （五十 君は総 括お よび検 討委 員会運 営）、事務局

（岡田 ）と 共に試 験法 の検討 を進 めた。

4 妥当性 確認 に関す る検 討（松岡、五十 君）

は衛生 指標 菌作業 部会 との合 同作 業部会 を開催 し、AOAC イン ターナ ショ ナルの 示した ガイ ドライ ンや 海外の 第三 者機関 による 妥当 性確認 に関 する文 書を 参考に 議論を 進め 、標準 試験 法のバ リデ ーショ ンガイ ドラ イン案 を作 成した 。

標準試 験法 検討委 員会 の事務 局は 、岡 田が担 当し、19 名 の専 門家委 員と 2 名の 行政官 で構 成した 。平 成 28 年度 ６回 の検 討委員 会を 開催し た。 各作業 部会 が機能 し、標 準法 策定が 順調 に行わ れて いるか を評価 した 。他の 研究 班等で 検討 中のウ ェルシ ュ菌 標準試 験法 ついて 諮問 を受け 評価し た。 これら の試 験法の 検討 状況を web へ公開し た。

セレ ウス 菌試験 法作 業部会（荻 原担 当）

は、ISO 7932 : 2004を中心に 検討 を進め た。米国 FDA か らは 、BAM 法と して 試 験法が 示さ れてい る。 国内の 一般 的な方 法も含 め、各試 験法の 比較を 行う ために 、 各方法 の比 較表の 作成 を行っ た。 問題点 や評価 点を 探究し 、最 も適切 な試 験法の 検討を 行う ことと した 。国際 的に 互換性 の あ る セ レ ウ ス 菌 試 験 法 と し て ISO 7932 : 2004 を 基 礎 と す る 標 準 試 験 法 (NIHSJ-28)を 作 成 し た 。 さ ら に 日 本 で 入 手可能 な B. cereusの選択培 地に ついて 、 供試菌株 42 菌株 を用 いて選 択培 地の有 効 性 並 び に 評 価 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、B.

cereus 選 択 培 地 間 に は 、B. thuringiensis 除き 、他の 供試 菌株 と B. cereus と明確 な 判別が 可能 なこと から 良好な 選択 性を有 した。 さら に検出 菌数 につい ても 各選択 培地間 に有 意な差 は認 められ なか った。

これら の培 地は特 徴を 理解し て使 用する こと により B. cereus を有 効に 検出 でき るもの と推 察され た。

エル シニ ア試験 法作 業部会（岡 田担 当）

では、ISO 10273 とハ ーモナ イズ した定 性 法(NIHSJ-27)の 策 定 を 行 っ た 。 現 在 日 本国内 では 、食品 から 本菌を 検出 するた めの告 示法 、通知 法等 が定め られ ていな

いため 、国 際的 な試験 法と互 換性 のある 、 食品か らエ ルシニ アを 分離す るた めの標 準試験 法を 策定す る必 要があ る。 国際的 標 準 試 験 法 と 互 換 性 の あ る 食 品 か ら の Yersinia 試 験 法 と し て 、 昨 年 度 の 検 討 で 最 も 所 要 時 間 が 短 か っ た ISO 10273： 2003 を 基 礎 と し た 標 準 試 験 法 案 を 作 成・検 討す ること とし たが、 研究 協力機 関によ る検 討から 、PMPブロスを 用い て 4℃で培養 す るY. pseudotuberculosis の試 験 法 と し て BAM に 記 さ れ て い る 方 法

（2004 年 版 食 品 衛 生 検 査 指 針 に も 記 さ れてい る方 法）が 最も 分離率 が優 れてい たため 、NIHSJ-30TS として推 奨試 験法を 策定し た。

衛生 指標 菌作業 部会 （伊豫 田担 当）で は、衛 生指 標菌・ 菌群 として は、 一般生 菌数と 、大 腸菌群 、腸 内細菌 科菌 群など の検討 を行 った。ISO 試験法 と国 内の従 来法に つい て、バ リデ ーショ ン作 業部会 と合同 で検 討を進 めた 。

バリ デー ション 作業 部会（ 松岡 ・五十 君担当 ）は 衛生指 標菌 作業部 会と 合同で 検討し た。 セレウ ス菌 等、4 種類 の微生 物及び 微生 物由来 毒素 の各標 準試 験法の 作成に 際し て、妥 当性 確認ガ イド ライン に基づ き検 討を進 めた 。また ガイ ドライ ンの基 とな った ISO 16140が改訂 され た ことか ら、 その和 訳を 作成し 分析 した。

ウェル シュ 菌標準 試験 法の評 価を 行い、

NIHSJ-29 を ステ ージ ３とし た。海 外の第 三者機 関に よる妥 当性 確認の ガイ ドライ ンを比 較検 討し、AOACイン ター ナショ ナ ル が 新 規 に 提 案 し た ガ イ ド ラ イ ン と ISO 16140 を比較 しな がら妥 当性 確認に 必要な 内容 をまと め、 標準試 験法 のバリ デーシ ョン ガイド ライ ン案を 作成 した。

微生物 試験 法の合 理的 な妥当 性確 認のた めに重 要な 、オン サイ ト調製 型の 生菌標 準物質 に関 しては 、広 範囲の 菌種 に適用 できる 見通 しを得 た。 パリで 開催 された ISO TC34/SC9に参加 し、ISO 策定の 議論 に 加 わ っ た 。 ま た 、 米 国 で 開 催 さ れ た

5 AOAC INTERNATIONAL の 年 次 大 会 に 参加し た。

これ らの 試験法 に関 する情 報提 供を、

学会等 のシ ンポジ ウム や講演 会及 び関連 雑誌の 総説 で行っ た。

Ｄ． 結論

食品に おけ る微生 物標 準試験 法の 妥当 性確認 の手 法を検 討し 、統一 した 方向性 を持ち 、科 学的根 拠の ある信 頼性 の高い 標準試 験法 プロト コー ル作成 を進 めた。

セ レ ウ ス 菌 (NIHSJ-28)、 エ ル シ ニ ア (NIHSJ-27、NIHSJ-30TS)、 ウ ェ ル シ ュ 菌 試 験 法(NIHSJ-29-ST3)な ど の 標 準 試 験 法 の策定 を進 めた。 海外 の第三 者機 関のガ イドラ イン を比較 検討 し、妥 当性 確認に 関する 考え 方を整 理し 、妥当 性確 認ガイ ドライ ン案 をまと めた 。微生 物試 験法の 合理的 な妥 当性確 認の ために 重要 な、オ ンサイ ト調 製型の 生菌 標準物 質に 関して は、広 範囲 の菌種 に適 用でき る見 通しを 得た。

Ｅ． 健康 危害 情報 該当 なし 。

Ｆ． 研究 発表 論文発 表

なし

学会発 表

1. 荻原博 和, 上村 真理 子, 吉川夏 未, 岡 田由美 子。

Bacillus cereus

2. 斉藤美 佳子 、高谷 周督、 五十 君静信 、 松 岡 英 明 ： 生 菌 標 準 物 質 を オ フ サ イ ト で 利 用 す る た め の 一 時 保 存 法 ． 第 43 回日本防 菌防 黴学 会年次 大会、 東 京（2016.9.26）

書籍

1. 食品衛 生検 査指針 微 生物編 2015。

公益社 団法 人日本 食品 衛生協 会

講演・ 研修 会等

五十君 静信 。食品 の微 生物試 験法 の標準 化。JASIS セミ ナー 2015.9.4 幕張 メッ セ

五十君 靜信 。食 品衛生 検査指 針 微生 物編 改定と 今後 の工程 管理 に適し た試 験法の 選 び 方 。 食 品 開 発 展 記 念 セ ミ ナ ー 2015.10.8 東京ビ ック サイト

五十君 靜信。2015年に 改訂さ れた 食品衛 生検査 指針 の方向 性 と HACCP 義務化 へ 向 け て の 検 査 体 制 の 考 え 方 。 日 水 2015 年 度 食 品 衛 生 検 査 セ ミ ナ ー 。2015.10.9 東京

Ｇ．知 的所 有権の 取得 状況 該当な し。

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