当研究室は、理研バイオリソースセンターが各リソース、特に実験動物および幹細胞をより 高度なクオリティにて維持供給するために必要な遺伝関連技術開発を行うことを目的としてい る。 1. 体細胞核移植クローン技術の開発 マウスにおいて再現性が極めて低い体細胞クローン技術の効率の改善および安定化をめざす とともに、再プログラム化機構の解明をめざす。（図 1）
室長 小倉 淳郎
事業内容 Atsuo Ogura （図１）卵丘細胞 (CC) および造血幹 細胞 (HSC) クローン胚の遺伝 子発現量低下 （図 2）英国 MRC よりドライアイス簡易凍結輸送された精巣から精子細胞を回収し、顕微授精により生まれ たマウス 2. 顕微授精技術の開発 正常精子だけでなく、通常は受精能のない不動精子、形態異常精子、未成熟精子などでも受 精卵および産子を作出する顕微授精技術の開発をめざす。また、その技術の生殖工学実験系へ の幅広い応用を実施する。 （図 2）3. 効率的な胚･配偶子の凍結保存法の開発
4. 新規幹細胞の開発
ヒト再生医療のモデルに資するために、様々な動物種からの胚性幹細胞（Embryonic Stem (ES) cell）や体細胞核移植由来胚盤胞から胚性幹細胞（体細胞核移植由来 ES；ntES）細胞の樹 立を試みる。また、より効率的な遺伝子改変動物作出のための生殖幹 (Germline Stem;GS) 細胞 や胚性生殖 (Embryonic Germ;EG) 細胞の樹立をめざす。（図４） （図３）理研 BRC で行った 1768 回（587 系統）のマウス体外受精成績と受精卵の作出効率 胚および配偶子 の 凍 結 保 存 技 術 は、実験動物バイ オリソース保存の 核となる技術であ る。さまざまな条 件設定（凍害防止 剤の調製、温度設 定など）により、 効率的な凍結保存 技術とその周辺技 術 の 開 発 を め ざ す。（図 3） （図４）各種幹細胞のアルカリフォスファターゼ活性。左から、マウス ntES 細胞、ウサギ GS 様細胞、 マウス EG 細胞。 職員とメンバー構成 室長 小倉 淳郎 （平成 14 年 2 月～） 研究員 井上 貴美子 （平成 14 年 3 月～） 先任技師 持田 慶司 （平成 14 年 2 月～） 技師 越後貫 成美 （平成 14 年 3 月～） 基礎科学特別研究員 本多 新（平成 16 年 10 月～） BRC 研究協力員 廣瀬 美智子（平成 16 年 4 月～） BRC 研究協力員 毛塚 芙由子（平成 17 年 5 月～） BRC 研究協力員 中村 可奈子 （平成 14 年 5 月～） 訪問研究員 大川 美佳（平成 15 年 4 月～） 研修生（学振特別研究員） 三木 洋美 （平成 17 年 4 月～） 研修生 新免 明恵（平成 15 年 11 月～） 研修生 遠藤 圭介（平成 17 年 2 月～）
後列左から 中村、 遠藤、 本多、 廣瀬、 越後貫、 毛塚、 三木、 大川、 持田、 井上、 小倉室長 １．体細胞核移植クローン技術の開発 1）組織幹細胞を用いたクローンマウスの作製 造血幹細胞を用いたクローン産仔の作出率が、他の終末分化体細胞よりも低いことがわ かった。特に 2 細胞期における胚発生停止が顕著なことから、この時期における胚特異的 遺伝子発現の異常を疑い、これらの発現量を単一胚定量 RT-PCR により解析した。その結果、 6 つの遺伝子のうち 5 つまでが有意に発現低下しており、特に HDAC1 が卵丘細胞クロー ン胚と比べても特異的な低下を示した。HDAC1 は胚特異的遺伝子発現カスケードの重要 な遺伝子の一つであり、この発現低下が胚発生停止の原因の 1 つである可能性が高い。ド ナー細胞における HDAC1 の発現量を調べたところ、造血幹細胞は他の体細胞に比べて低 かった。HDAC1 が造血幹細胞の未分化性維持に重要であることから、その発現パターン が核移植後にも維持されているのかもしれない。（細胞運命情報解析技術開発サブチーム と共同研究） 2）異種間核移植クローン胚の作出 核移植クローンの成功には良質な卵子が必要であるが、動物種によっては雌の個体差 などにより卵子の品質を安定化させることが困難である。この問題を解決する一つの方法 は、比較的均一な卵子を採取できる動物種の卵子の代用である。そこで、ウサギの卵子を 用いてカニクイザルの体細胞の核移植クローンを試みた。卵丘細胞、胎仔線維芽細胞、卵 管上皮細胞、白血球を用いたところ、いずれの細胞種でも 50-70% が 2-4 細胞期に分割し たが、胚盤胞への発生率は 1% であった。そこでサル細胞質を卵子に導入したところ、胚 盤胞への発生は有意に改善した (P < 0.005)。 年次計画と成果
2. 顕微授精技術の開発･応用 1）新規不妊原因遺伝子の探索 ENU 投与雄個体（G0 世代）の次世代（G1）雄で、造精・精子機能に障害がある個体の 精子あるいは精子細胞を用いて顕微授精することにより G2 世代を作製した。G2 世代に G1 世代で観察された生殖関連の異常が遺伝しているか確認することにより、新規不妊原因遺伝 子の探索を試みた。G1 世代 4 ラインの雄を用い顕微授精したところ、2 ラインで G2 世代が 得られた。現在のところ不妊の遺伝性は観察されていない。今後、違うラインでもさらに検 討を行う。（城石協力研究グループと共同研究） 2）長期簡便凍結保存を行った雄性生殖細胞を用いた産仔獲得 雄性生殖細胞の簡便凍結保存法の確立を目的として、マウス精巣および精巣上体を組織 状態で凍結チューブに入れディープフリーザー保存を試みた。組織融解後、分離した精巣上 体精子、精巣内精子、精子細胞をマウス未受精卵に顕微注入したところ、全ての雄性生殖細 胞より産仔が得られた。最長 1 年間凍結保存した精巣由来の精子および伸長精子細胞からも 産仔獲得に成功した。さらに液体窒素保存が不要な点を利用して、英国 MRC にて簡便凍結 したマウス精巣をドライアイスにて空輸したのちに顕微授精したところ、高率（胚移植あた り 10-65%) に産仔が得られた。本法により、凍結保存技術や液体窒素のない施設でも受精能 を保持した状態での凍結保存が可能である事が明らかになった。またドライアイスによる輸 送が可能であり、ドライシッパーおよび煩雑な手続きが不要な簡便輸送を可能にする技術で あることが明らかになった。 3）顕微授精技術を利用したマウス GS 細胞の解析 マウス GS 細胞から派生した多分化能を示す ES 細胞様の細胞 (mGS 細胞）をマウス胚盤 胞期胚に注入してキメラ胚を作製し胚移植した。得られた雄キメラの精巣から細胞の単離を 行い、蛍光指標によって mGS 細胞由来円形精子細胞を選別してマウス未受精卵に顕微授精 した。胚移植の結果、全身が蛍光に発色する産仔が得られた。このことにより mGS 細胞の 生殖系列への分化能が確認された。また、長期間浮遊条件下で培養したマウス GS 細胞を精 子形成不全マウスの精巣に移植することで形成された円形精子細胞を用いて顕微授精を行う ことにより、産仔が得られた。このことは、GS 細胞が長期間の浮遊培養条件下においても 精子分化能を保持することを示しており、精原幹細胞の増殖・分化の解析および利用という 観点で大きな進展と言える。（京都大学篠原隆司教授と共同研究） 4）卵子体外成熟系の改善による一次精母細胞産子の作出 未成熟卵子を顕微操作する際にはそれをとりまく卵丘細胞を除去するため、その後の体 外成熟 (IVM) では細胞質が著しく劣化する。そこで全く異なる長短所を有する２つの体外成 熟培養液（TYH と αMEM）を 1:1 に混合し、卵丘細胞除去卵子の IVM に供したところ、そ の後の胚発生を有意に改善することができた。この IVM 系を一次精母細胞を顕微授精した 未成熟卵子へ応用したところ、IVM 後の MII 卵子をそのまま活性化することで産子を得た。 この顕微授精は通常 MII で細胞質を置換するが、今回初めて、GV 期からの細胞質をそのま ま利用して産子を得ることに成功した。
3. 効率的な胚・配偶子の凍結保存法の開発 胚および配偶子の凍結保存技術は、実験動物バイオリソース保存の核となる技術であ る。本研究室ではさまざまな条件設定（凍害防止剤の調整、温度設定など）により、効率 的な凍結保存技術の開発をめざすとともに、これらリソースの簡便な輸送方法の検討をお こなっている。 1）マウス各系統の体外受精成績について 587 系統（のべ 1768 回）の体外受精結果より、全体の平均受精率は 69％と安定した 成績が得られた。 同系統同士の体外受精が全体の 72％を占め、用いた雌 1 匹当たりから得られた受精卵数 は 8.2 個（平均受精率は 67.3％）であり、バックグラウンド系統との体外受精の場合の 12.0 個（同 74.0％）に比べて受精卵の作出効率は 2/3 であった。凍結精子を用いた体外受 精は 35 回行い、ほとんどの系統で 48 ～ 54％の受精率であった。 2）マウス 2 細胞期胚におけるガラス化保存法の改善について EFS 溶液でガラス化保存した胚の融解・回収方法の改善を行った。融解液として 0.75M sucrose-PB1 と 0.25M sucrose-PB1 を用いることで C57BL/6、BDF1、BALB/c、FVB の各系 統で生存性に改善が見られた。更に融解後 3 分間静置してから胚を回収することで操作も 容易になり、系統に関わらず回収率は 98-100％、生存率は 95％以上と高率で安定するこ とが確認された。
3）マウス未受精卵の最適な凍結保存法の開発について
BDF1 マウス系統の未受精卵を様々な条件で凍結保存したところ、クライオトップを 用いて、8% DMSO + 8% ethylene glycol(EG)-PB1 溶液で 3 分間平衡後、16% DMSO + 16% EG + Ficol + sucrose 溶液に 1 分間平衡させてから液体窒素へ浸漬し、0.5M sucrose-PB1 溶 液で回収した場合に、最良の結果が得られた。融解後、98% が形態的に正常であり、さら に 2.5M SrCl2で活性化処理した半数体単為発生胚の発生率を調べたところ、94% が 2 細胞 期胚へ、69% が胚盤胞へ発生した。 4）マウス精子の凍結保存法の改善について マウス精子を 18％ラフィノース水溶液で凍結保存した場合の最適な温度低下速度を 調べたところ、冷蔵温度から -50℃へ至る間の低下速度が重要であることがわかった。-10 ～ -450℃ / 分の速度で凍結した際に融解後約 20％の運動性精子率が得られ、-3000℃およ び -0.7℃ / 分では運動性精子は得られなかった。これらの結果から冷蔵温度から -50℃ま での間は 20 秒間～ 3 分間かけて温度を降下させることが運動性を持つ精子を回収するた めに重要であることが示唆された。 4. 各種幹細胞株の樹立と解析および利用 1）ES 細胞株樹立とその利用 一般的にマウス ES 細胞は 129 系統以外の系統から樹立する事が困難とされているが、 野生マウスや近交系マウスから効率的に ES 細胞を作出できればその応用範囲は幅広く、 当該研究分野の発展に大きく貢献できる。当研究室ではこれまでに 129 系統以外の系統か ら B6 マウスや野生マウスとラボマウスの F1 を含む 6 種類 (37 ライン ) の ES 細胞株を樹 立した。また、体細胞核移植クローン胚からは 5 種類（32 ライン）の ntES 細胞株樹立に
成功している。クローン個体がほとんど得られない近交系でも ntES 細胞を経由する事 で体細胞からの個体作出の可能性が高まり、一方では交配不可能なマウス系統の復活・ 維持へも応用できると期待される。 2）生殖幹細胞株の樹立 これまでにマウス、ウサギ、サルから 5 種類の生殖幹細胞株樹立を試みた。サルで は雌性の、マウスとウサギでは雌雄どちらでも未分化様コロニーの成長を確認している。 特にウサギでは各種未分化マーカータンパク質の産生やアルカリフォスファターゼ活性 なども確認しており、継代数に限りがあるものの、よく増殖する事も明らかになってい る。今後は遺伝子導入とその細胞の分化能の解析に重点を置いて解析を行う。 3）新生仔卵巣由来細胞の利用と解析 新生仔卵巣をトリプシンなどの酵素処理により分散させた後に、そこから効率よく 卵子を発生・成熟させる試みも行っている。培地に Stem Cell Factor を添加する事で効 果的に卵子の誘出と成長を誘導できる事も明らかになった。現在、その卵子の由来や成 長段階を同定中である。また、ほぼ純化した幹細胞様の形態を示す細胞も得ることがで きた。そこで GFP トランスジェニックマウス新生仔の卵巣からその細胞を単離し卵巣 に移植して分化を誘導することで、その細胞の特徴を解析している。 4）新規 EG 細胞株の樹立 EG細胞はマウス8.5日～12.5日胚の始原生殖細胞由来の多能性をもつ幹細胞であり、 12.5 日以降の発生段階からでは樹立困難とされている。しかしながら、当研究室では現 在までに 14.5 日雌胚からの EG 細胞株樹立に成功しており、その細胞が未分化マーカー 遺伝子を発現し、多分化能を有する事も確認している。このことは、発生段階の生殖巣 に存在する細胞種の種類や性質を明らかにする上で非常に興味深い。今後はこの細胞の 性質をより詳細に解析する予定である。 研究発表（誌上発表） （原著論文）* 印は査読
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