16K21398 研究成果報告書

東京理科大学・理工学部先端化学科・助教

科学研究費助成事業  研究成果報告書

Lyoprotection of biomembrane by zwitterionic amphiphiles

６０７１１５６２ 研究者番号： 相川 達男（Aikawa, Tatsuo） 研究期間： １６Ｋ２１３９８ 平成 ３０ 年 ５ 月 １６ 日現在 円 2,600,000 研究成果の概要（和文）：脂質二分子膜は生体膜の基本構造である。脂質二分子膜を凍結乾燥状態でも安定に維 持する技術は、細胞の凍結保存や食品のフリーズドライ保存において重要である。本研究では、双性イオン性物 質アルキルスルホベタイン（SBn、n：アルキル炭素数）における、脂質二分子膜の凍結乾燥保護効果を検討し た。その結果、中程度のアルキル鎖長をもつSBn(n=6, 8, 10)が、乾燥状態の膜の流動性を高めることで、保護 効果発揮することを示した。またSBnは両親媒性化合物であるにも関わらず、脂質二分子膜を溶解せず保護効果 を持つ。これはSBnがホスファチジルコリンと相互作用し、二分子膜構造を安定化していると思われる結果を得 た。

研究成果の概要（英文）：Biomembranes are composed of lipid bilayer. Therefore, stabilization of freeze-dried state of lipid bilayer is an important technology for storage of frozen cells and freeze-dried products (etc. foods). In this study, we investigated lyoprotective effect of lipid bilayer by alkyl sulfobetaines (SBn, n indicate the number of carbons in the alkyl chain), which are zwitterionic compound. The result showed that SBn with medium length of alkyl chain (n=6, 8, 10) had lyoprotective effect. These SBn should enhance fluidity of the dried bilayer, which may contribute to suppressing collapse of lipid bilayer during the rehydration process. In spite of their amphiphilic nature, SBn=10 do not solubilize lipid bilayers. The experimental result showed that lipid bilayers should be stabilized by intermolecular interaction between sulfobetaine unit in SBn and phosphocholine unit in lipid in the bilayer.

研究分野： 生体材料

キーワード： 脂質二分子膜 凍結乾燥 リポソーム 双性イオン

１．研究開始当初の背景 リン脂質二分子膜は、図１に示すように水 中で脂質分子が互いに疎水部どうしを向け、 外側に親水性の極性頭部を向けたシート状 に自己集合した構造体である。リン脂質二分 子膜は、生体膜の基本構造であり、これを乾 燥状態で維持し、再び水和し、元の構造に戻 せるような技術は、細胞ひいては脂質二分子 膜からなる様々な製品（いわゆるフリーズド ライ製品）の保存安定性を向上させるうえで 重要である。 図 1. 脂質二分子膜とそれを構成する脂質の 構造 低温・乾燥状態で脂質二分子膜を安定化す る試みは、1980 年代から行われており、特に Crowe らの研究成果が著しい[Science, 223, 701–703 (1984)]。彼らは、小胞形のモデル 生体膜（リポソーム）を凍結乾燥(FD)する際 に、保護剤(lyoprotectant)として糖類を添 加すると FD を経てもリポソームの構造が維 持されること（lyoprotective 効果）を示し て い る 。 特 に ト レ ハ ロ ー ス が 高 い lyoprotective 効果を発揮することも示して い る [Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 84, 1537–1540 (1987)]。 こ れ ま で の 研 究 に お い て 、 糖 類 の lyoprotective 効果が比較的高いことが明ら かになっているが、いくつか問題点もある。 lyoprotectant として糖類を使用する場合、 その必要量が脂質分子よりも多い (0.1 M)。 このように大量に糖類を使用すると、糖類の 性質が際だってあらわれてしまう。そこで 我々は、少量でも効果的に lyoprotective 効 果を示す物質の探索を行うことにした。 我々は、その特徴的な分子構造から、リン 脂質と逆の電荷配置を有する双性イオン性 の 両 親 媒 性 物 質 が リ ポ ソ ー ム の lyoprotective 効果を示すのではないかと期 待 し た 。 Crowe ら の 報 告 に よ る と lyoprotectant として機能するには、乾燥状 態において二分子膜内のリン脂質間に入り 込み、リン脂質同士をつなぎ止める効果が要 求される。本研究で lyoprotectant として提 案する双性イオン性両親媒性物質、アルキル スルホベタイン（SBn、n はアルキル鎖の炭素 数）は、図２に示したように、極性基の電荷 がリン脂質のそれはと逆に位置するため、リ ン脂質との間に分子間相互作用（双極子-双 極子相互作用 and/or 静電相互作用）が期待 できる。SBnは凍結乾燥中にリン脂質間に入り 込み、リン脂質分子をつなぎ止めると予想し た。 図 2. リポソームとアルキルスルホベタイン (lyoprotectant 候補物質)の構造 本研究では、モデル脂質二分子膜としてリ ポソームを用いることにした。リポソームは、 機能性分子を内包することが可能であるた め、薬物キャリアや化粧品材料として注目を 集めている。リポソームの凍結乾燥法を確立 することは、リポソームの生体材料分野での 応用可能性をさらに広くすると期待できる。 ２．研究の目的 (1) SBnの lyoprotective 効果の評価 (2) リン脂質と SBnとの分子間相互作用の観 点から lyoprotective 効果のメカニズム に関する検討 ３．研究の方法 (1) Lyoprotective 効果の評価 本研究では、DPPC からなるリポソームをモ デル二分子膜として用いた。リポソームの作 製は、一般的な方法である超音波照射法を採 用した。Lyoprotective 効果は、FD/RH 後に リポソームが形状を維持しているかを調べ 評価した。具体的には、FD/RH 前後のリポソ ームサイズの変化を動的光散乱法(DLS)によ り測定することで、脂質二分子膜の融合や融 合を評価した。 また水溶性蛍光色素（5(6)-カルボキシフ ルオレセイン）を内包したリポソームを調製 し、FD/RH 後に色素の保持率を蛍光強度から 見積もり、脂質二分子膜の欠陥形成の程度を 評価した。 (2) リン脂質と SBnとの分子間相互作用の調 査 脂質二分子膜は、温度上昇に伴い流動性の 低い相（ゲル相）から流動性の高い（液晶相） に転移を起こす。ゲル-液晶相転移温度(Tm) は、脂質二分子膜を形成する脂質分子間の分 子間相互作用に依存して増減する。SBnを添加 した DPPC リポソームのTmを示差走査熱量分 析(DSC)により測定した。 空気-水界面に DPPC からなる単分子膜を形 成し、この単分子膜に対して、SBnと同じ極性 ) (

基を有する合成脂質を混合したときの単分 子膜の収縮（または膨張）の程度を測定し、 分子間に引力（または斥力）が働いているか を調べた。 ４．研究成果 SBnの lyoprotective 効果は、アルキル鎖長 により異なった。中程度のアルキル炭素数を 持つ SBn(n=6,8,10)は、FD/RH 前後のリポソー ムサイズの変化が抑制された(図 3)。一方、 SBnを添加しない場合、あるいは SBnのアルキ ル 鎖 が 短 い (n= 1,2,4) と 長 い (n= 12,14,16,18) 場合 、 リポ ソ ー ムサ イ ズが FD/RH 後に増大したことから、リポソーム膜 が凝集/融合したことが示唆される。また FD/RH 後のリポソーム中の水溶性蛍光色素の 保持率を調べたところ、SBn=10を添加すると 95±10%(平均値±標準偏差、N=3)と高い保持 率であった。一方、SBnを添加しない場合は、 保持率は 1%未満であった。この結果から、 SBn=10は FD/RH 後にリポソーム膜の欠陥形成 を抑制していると言える。以上のことから、 中 程度 の長 さの アル キル 鎖を もつ SBn が lyoprotective 効果を持つことが示された。 図 3. SBn添加 DPPC リポソームの FD/RH 前後 のサイズ分布変化（黒: FD/RH 前、グレー: FD/RH 後）.[SBn]=30 mol% to DPPC. リポソームからの水溶性色素漏洩は、ゲル-液晶相転移時にもっとも顕著に起こること が 報 告 さ れ て お り [Hays, L. M., et al, Cryobiology 2001, 42, 88–102]、脂質二分 子膜の欠陥形成はゲル-液晶相転移時起こる と考えられる。再水和時は、ゲル-液晶相転 移温度(Tm)の変動が起こる。例えば、乾燥状 態の DPPC 二分子膜(SBnは未添加)の Tmは 100°C 程度で、水和状態では 41°C 程度であ る。すなわち、再水和時の温度が 41°C から 100°C の間の場合、水和時に転移が起こるこ とになる。SBnを添加し作製したリポソームの 乾燥状態での Tmは、SBnのアルキル炭素数に より異なった(図 4)。とくに中程度のアルキ ル鎖長をもつ SBn(n= 6, 8, 10)を添加した場 合、Tmの低下が顕著であった。本研究では、 リポソームの再水和を 55°C で実施している。 SBn(n= 6, 8, 10)を添加した場合、この再水 和温度で、脂質二分子膜は液晶相のはずであ る。再水和後（水が過剰にある状態）では、 SBnが脂質二分子膜から脱着し、Tmは 41°C 程度になるが、いずれにしても再水和前後で、 脂 質二 分子 膜は 液晶 相であ ると いえ る。 SBn(n= 6, 8, 10)を添加した場合、再水和の 過程で、ゲル-液晶相転移が起こらず、色素 の漏出（膜の欠陥形成）が抑制できたと考え られる。 図 4. 凍結乾燥した脂質二分子膜に SBnを添 加 し た と き の ゲ ル - 液 晶 相 転 移 温 度 (Tm). [SBn]=20 mol% to DPPC. 一般的に両親媒性化合物は脂質二分子膜 を水に対して可溶化する性質がある。本研究 で使用している SBnは両親媒性分子であり、 脂質二分子膜を溶解し、膜構造を破壊する可 能性があるにも関わらず、SBnが共存していて も膜構造は維持されている。極性基が双性イ オン性ではなく、カチオン性またはアニオン 性の両親媒性物質を添加した場合、FD/RH 後 は凝集/融合が起こることを予備実験により 確認している。この結果から、両親媒性物質 の極性基は双性イオン性基であることが、膜 を破壊せず lyoprotective 効果を発揮する上 で重要であると考えられる。SBnは図 2 に示し たように、DPPC の極性部と逆の電荷配置をも つ。このため極性基どうしで SBnと DPPC とで 相互作用し、膜構造が安定化すると考えられ る。これを検証するために、スルホベタイン を極性頭部とし、疎水ユニットの構造が、 DPPC と 同 じ 脂 質 分 子 (DPSB) を 合 成 し 、 DPPC/DPSB 混合単分子膜の収縮/膨張の程度 を調べた。DPPC に対して DPSB を混合すると 単分子膜が収縮し、等モル混合した場合、最 も収縮した。また DPPC/DPSB からなる混合脂 質の水分散液の Tmは、それぞれの脂質の Tm(DPPC; 41.4°C、DPSB; 40.8)よりも増加し、 52.9°C となった。この結果から互いの脂質

の分子間相互引力が作用しているといえる。 これらの結果から、スルホベタインユニット と DPPC の極性部には分子間引力が働いてい ると考えられ、SBnを添加しても DPPC 二分子 膜が崩壊せずに構造を維持出来ている要因 と考えられる。 また SBn=10を添加すると、凍結乾燥リポソ ームを再水和し分散する際に、過度な振とう 攪拌を必要とせず、速やかに分散した。この ような迅速な再分散は、凍結乾燥リポソーム の実用面において重要である。 本研究により、SBn=10の lyoprotective 効果 を示すことができた。SBn=10は脂質二分子膜の 凍結乾燥/再水和のプロセスにおいて、乾燥 状態の脂質二分子膜中に貫入し膜の流動性 を高めることでゲル-液晶相転移温度を低下 させ、再水和時の相転移を抑制している。ま た SBn=10は脂質二分子膜を可溶化せず、膜を 構成する脂質分子をつなぎ止める役割を果 たしていることが明らかになった。今後は、 実用性の向上に向けて、細胞膜や様々な種類 で構成されるリポソームにおいても、SBn=10 をはじめとするアルキルスルホベタインが lyoprotective 効果を有するかについて検討 が必要だと思われる。 ５．主な発表論文等 〔雑誌論文〕（計 4 件）

(1) T. Aikawa, K. Sato, H. Okado, Y. Takahashi, T. Kondo, M. Yuasa,

Lyoprotective Effect of Alkyl

Sulfobetaines for Freeze-Drying

1,2-Dipalmitoryl-sn-Glycero-3-Phosp hocholine Liposomes. J. Oleo Sci. 66, 1277–1284 (2017). 査読あり.

DOI: 10.5650/jos.ess17100

(2) T. Aikawa, H. Okura, T. Kondo, M. Yuasa, Comparison of Carboxybetaine with Sulfobetaine as Lipid Headgroup

Involved in Intermolecular

Interaction between Lipids in the Membrane. ACS Omega 2, 5803–5812 (2017). 査読あり.

DOI: 10.1021/acsomega.7b00574 (3) T. Aikawa, Y. Nezu, K. Tsuchiya, T.

Kondo, M. Yuasa, Synthesis and Diol-Responsiveness of a Boronic Lipid. Chem. Lett. 46, 293–295 (2017). 査読あり.

DOI: 10.1246/cl.161023

(4) T. Aikawa, K. Yokota, T. Kondo, M. Yuasa, Intermolecular Interaction

between Phosphatidylcholine and

Sulfobetaine Lipid: A Combination of Lipids with Antiparallel Arranged

Headgroup Charge. Langmuir 32,

10483–10490 (2016).査読あり. DOI: 10.1021/acs.langmuir.6b02563 〔学会発表〕（計 21 件） (1) 相川達男、大倉葉月、横田圭亮、近藤剛 史、湯浅真、“逆”の電荷配置をもつ双 性イオン性脂質からなる脂質膜（招待講 演）、第 27 回日本 MRS 年次大会（2017 年 12 月 5 日-7 日、横浜市開港記念会館 （神奈川県・横浜市））

(2) K. Yokota, T. Aikawa, T. Kondo, M. Yuasa, Intermolecular interaction between lipid headgroups comprising

phosphocholine and sulfobetaine

having opposite charge arrangement, 2017 MRS Fall Meeting & Exhibit (2017 年 11 月 26 日-12 月 1 日, ボストン (ア メリカ))

(3) Y. Nezu, T. Aikawa, T. Kondo, M. Yuasa,

Sugar-responsive lipid bilayer

membrane: Regarding to response mechanism, 2017 MRS Fall Meeting & Exhibit (2017 年 11 月 26 日-12 月 1 日, ボストン (アメリカ)) (4) 相川達男、根津友祐、横田圭亮、大倉葉 月、岡部祥士、近藤剛史、湯浅真、“逆 電荷配置双性イオン性脂質(ICZL)”とリ ン脂質から構成される脂質膜（招待講 演）、膜シンポジウム 2017“膜を創る・ 知る・操る”（主催：日本膜学会、2017 年 11 月 13 日—14 日、富山大学黒田講堂 （富山県・富山市）） (5) 相川達男、電荷配置が逆の極性頭部をも つジアシルグリセリド型脂質の脂質膜 特性、第 64 回界面科学部会秋季セミナ ー（主催：日本油化学会 界面科学部会、 2017 年 11 月 6 日-7 日、IPC 生産性国際 交流センター（神奈川県・葉山町））

(6) T. Aikawa, H. Okura, K. Yokota, T. Kondo, M. Yuasa, Effect of Charge

Arrangement in Zwitterionic

Headgroups on Intermolecular

Interaction between Lipids in Lipid Membrane, Asian Conference on Oleo Science 2017 (2017 年 9 月 11 日-13 日、 東京理科大学神楽坂キャンパス (東京 都・新宿区)) (7) 大倉葉月、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 極性頭部が互いに逆の電荷配置である カルボキシベタイン脂質とホスファチ ジルコリンの分子間相互作用、第 68 回 コロイドおよび界面化学討論会 （2017 年 9 月 6 日-8 日、神戸大学鶴甲第１キャ ンパス（兵庫県・神戸市）) (8) 寺嶋迪、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 界面活性剤頭部の電荷がリン脂質二分 子膜構造に与える影響、第 68 回コロイ ドおよび界面化学討論会 （2017 年 9 月 6 日-8 日、神戸大学鶴甲第１キャンパス （兵庫県・神戸市）) (9) 伊藤元気、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 リポソームの凍結乾燥保護剤としての アルキルカルボキシベタインの効果、第

68 回 コ ロ イ ド お よ び 界 面 化 学 討 論 会 （2017 年 9 月 6 日-8 日、神戸大学鶴 甲第１キャンパス（兵庫県・神戸市）) (10) 佐藤堪太、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 アルキルスルホベタインが凍結乾燥リ ポソームのリン脂質二分子膜構造に与 える影響、第 68 回コロイドおよび界面 化学討論会 （2017 年 9 月 6 日-8 日、神 戸大学鶴甲第１キャンパス（兵庫県・神 戸市）) (11) 岡部祥士、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 極性頭部にフェニルボロン酸ユニット を持つ糖応答性脂質の合成、第 68 回コ ロイドおよび界面化学討論会 （2017 年 9 月 6 日-8 日、神戸大学鶴甲第１キャン パス（兵庫県・神戸市）) (12) 横田圭亮、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 ホスホコリン脂質とスルホベタイン脂 質の極性頭部間におけるホフマイスタ ーの効果、第 68 回コロイドおよび界面 化学討論会 （2017 年 9 月 6 日-8 日、神 戸大学鶴甲第１キャンパス（兵庫県・神 戸市）) (13) 根津友祐、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 頭部にボロン酸ユニットをもつ脂質の 糖に応答した脂質二分子膜構造変化、第 68 回 コ ロ イ ド お よ び 界 面 化 学 討 論 会 （2017 年 9 月 6 日-8 日、神戸大学鶴 甲第１キャンパス（兵庫県・神戸市）) (14) 相川達男、根津友祐、横田圭亮、大倉葉 月、近藤剛史、湯浅真、脂質極性頭部に おける双性イオン性の電荷の組合せが 脂質膜物性に与える影響、第 66 回高分 子学会年次大会（2017 年 5 月 29 日—31 日、幕張メッセ（千葉県・千葉市）） (15) 大門宏規、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 凍結乾燥・再水和プロセスにおけるアル キルスルホベタインのリポソーム保護 効果、日本化学会第 97 回春季年会（2017 年 3 月 16 日-19 日、 慶應義塾大学日吉 キャンパス（神奈川県・横浜市）） (16) 大倉葉月、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 膜脂質におけるカルボキシベタイン-ホ スホリルコリン極性頭部間の相互作用、 第 34 回高分子学会千葉地域活動若手セ ミナー（2017 年 3 月 7 日、東京理科大学 葛飾キャンパス（東京都・葛飾区）） (17) 相川達男、横田圭亮、大倉葉月、近藤剛 史、湯浅真、極性頭部の電荷配置が互い に逆平行の双性イオン性脂質の分子間 相互作用、第 26 回日本 MRS 年次大会 （2016 年 12 月 19 日-22 日、横浜市開港 記念会館（神奈川県・横浜市）） (18) 金子芽祐、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 リン脂質ベシクルに対するカルボキシ ベタイン両親媒性物質の凍結乾燥保護 効果、第 26 回日本 MRS 年次大会（2016 年 19 日-22 日、横浜市開港記念会館（神 奈川県・横浜市）） (19) 佐藤堪太、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 アルキルスルホベタインのリポソーム 凍結乾燥保護効果：アルキルスルホベタ インの炭化水素鎖長の影響、第 67 回コ ロイドおよび界面化学討論会（2016 年 9 月 22 日−24 日、北海道教育大学旭川校 （北海道・旭川市）） (20) 横田圭亮、相川達男、近藤剛史、湯浅真、 極性頭部の電荷配置が“逆”の脂質とリ ン脂質との分子間相互作用、第 67 回コ ロイドおよび界面化学討論会（2016 年 9 月 22 日−24 日、北海道教育大学旭川校 （北海道・旭川市）） (21) 相川達男、横田圭亮、近藤剛史、湯浅真、 極性頭部の電荷配置が互いに逆の脂質 における分子間相互作用、日本油化学会 第 55 回年会（2016 年 9 月 7 日-9 日、奈 良女子大学（奈良県・奈良市）） 〔図書〕（計 0 件） 〔産業財産権〕 ○出願状況（計 0 件） ○取得状況（計 0 件） ６．研究組織 (1)研究代表者 相川 達男（AIKAWA, Tatsuo） 東京理科大学・理工学部・助教 研究者番号：60711562 (2)研究分担者 なし (3)連携研究者 なし (4)研究協力者 なし