ハムスター血漿中のプロティナーゼインヒビター--精製と性質及び急性相反応

全文

(1)博士学位論文. ハムスター血祭中のプロテイナーゼインヒピター:. 精製と性質および急性相反応. 宮才-ド、一. 士三 ; l. 近畿大学医学部第二生化学教室. 雨宮修.

(2) 博士学位論文. ハムスター血禁中のフ。口テイナーゼインヒビター:. 精製と性質および急性相反応. 平成 4 年 1月. 近畿大学医学部第二生化学教室. (指導:篠原兵庫教授). 雨宮修.

(3) ハムスター血奨中のプロテイナーゼインヒピター:. 精製と性質および急性相反応. 近畿大学医学部第二生化学教室. 雨宮修 (指導:篠原兵庫教授). P r o t e i n a s ei n h i b i t o r si nh a m s t e rp l a s m a : r o p e r t i e sanda c u t ep h a s er 白 p on碍 P u r i f i c a t i o n，p. S h u j i Amemiya. K i n k i SecondDepartmento fB i o c h e m i s t r y， Osaka， J a p a n U n i v e r s i t yS c h o o lofM e d i c i n e，. r o f .HyogoS i n o h a r a ) ( D i r e c t o r:P. ABSTRACT I nt h i ss t u d yt h r e ep r o t e i n sw i t ht r y p s i ni n h i b i t o r ya c t i v i t yw e r ep u r i f i e dt o a p p a r e n thomogeneityfromh a m s t e rp l a s m aandt h ec h a n g e si nt h e i rp l a s m al e v e l n t i p r o t e i n a s ehadam o l e c u l a rmass a f t e ra c u t ei n f l a m m a t i o nw e r ee x a m i n e d . α : 1・A n h i b i t e de l a s t a s e，t r y p s i n and c h y m o t r y p s i nb u tn o tp l a s m i n， o f 68 kDa，and i p o r c i n ep a n c r e a sk a l l i k r e i no rg u i n e ap i gp l a s m ak a l l i k r e i n .C o u n t e r t r y p i n and. a t r y p s i ni n h i b i t o rhadam o l e c u l a rmasso f5 5kDaand120kDa， r e s p e c t i v e l y， p r e and both i n h i b i t e do n l yt r y p s i n . The p r e a t r y p s i ni n h i b i t o rc o n s i s t e do fl i g h t.

(4) ( 2 5 kDa) a n dh e a v y( 9 0 kDa )p o l y p e p t i d ec h a i n s，whichw e r ed i s s o c i a t e dby c h o n d r o i t i n a s eABCt r e a t m e n tb u tn o tbyh e a t i n ga t 1000Ci nt h ep r e s e n c eo f l .T h i r t e e naminoa c i d so ft h eN t e r m i n a l s o d i u md o d e c y ls u l f a t eandd i t h i o t h r e i t o. e i c o s a p e p t i d es e q u e n c eo fb o t hl i g h tandh e a v yc h a i n sw e r ei d e n t i c a lw i t ht h e c o r r e s p o n d i n gr e g i o n so fhuman s e r u mp r e a t r y p s i ni n h i b i t o r .A f t e ri n d u c t i o n. a l m o n e l l at y p h i m u r i u ml i p o p o l y o fi n f l a m m a t i o nbyi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o no fS s a c c h a r i d e，t h ep l a s m al e v e lo fp r e a t r y p s i ni n h i b i t o ri n c r e a s e d and t h a to f m u r i n o g l o b u l i nd e c r e a s e d，b u to t h e ri n h i b i t o r s showed no s i g n i f i c a n tc h a n g e . ・a n t i p r o t e i n a s e，c o u n t e r t r y p i n， p r e a t r y p s i ni n h i b i t o r ， h a m s t e r KeyWords:α・1. p l a s m a， a c u t ep h a s er e s p o n s e， i n f l a m m a t i o n. -2-.

(5) 緒言. 動物体内には多くのプロテイナーゼが存在し，その活性中心の構造によってセリン，チオール，カルボキシおよび金属プロテイナーゼの 4種類に分類されている.それらのプロテイナーゼの調節因子として多くのプロテイナーゼインヒビターが存在し，凝固，線溶，補体活性化，免疫，発癌，細胞増殖など，さまざまな生理過程に関与しており，その血中の総量はヒト血奨蛋白質の約 13%に及ぶ. 生体 ζ l炎症や組織傷害が起こった時，血中濃度が変化する蛋白は急性相蛋白といわれ，プロテイナーゼインヒビターもそのひとつである.一般に進化の過程では構造遺伝子より調節遺伝子の方が変わりやすく，あるプロテイナーゼインヒビターがそれ自身の相向性は高くても急性相蛋白であるかどうかは動物種間で異な pr 0t einase( αー 1-AP)はヒトでは急性相蛋る場合が多い.例えば， α-1-anti. 白であるがマウスではそうでない t• 2. 逆に，ラッ卜の急性相蛋白である αー 2 -. αー 2-MG)はヒ卜ではそうでない macroglo b u lin(. したがって様々な種のプ. ロテイナーゼインヒビターを研究し，急性炎症時の挙動を比較することは遺伝子発現の調節機構を知るてがかりになる. ハムスターは比較的ウィルスに感染しやすく種々の薬剤で腫虜が発生しやすい実験動物である¥また気管内へのエラスターゼ散布によって起こされる肺気腫はヒトの汎葉性肺気腫に酷似していることが知られている¥こうした理由でハムスターは肺気腫，ウィルス感染および発癌などの研究の実験動物として使われている. しかしハムスターのプロテイナーゼインヒビターはまだ精製されていず急性相反応の知見も得られていない.そ乙で本実験ではハムスター血中からトリプシン回害活性を指標にしてプロテイナーゼインヒビターを精製し，急性炎症を起乙した時の血葉中濃度変化を測定した.. 方法 1.材料. -3ー.

(6) Syri an hamster オス体重 150-220gを，空調管理下の飼育室(室温 2 3土 1 "c，湿度 5 5: t5% の明暗調節環境下 ) において水道水，固形飼料 ( 舟橋農場 F -. 2 )で飼育した.採血は，. diethyl ether麻酔下で心臓から行ない，抗凝固剤. として ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 10mMを用いた.. 血奨. は 3000rpm， 3 0分間遠心分離した後一 8 0"cにて保存した. おもな材料と薬品の購入先は以下のとうりである. EDTA， (ρ-amidino. phenyl) methanesulfonyl fluoride hydrochloride (APMSF)(和光純薬) Blue cellulofine， chondroitinaseABC (Proteus vulgaris) (生化学工業). hydroxyapatite，CMAffi-Gel B1ue (Bio-Rad Laboratorie). SephadexG-I00， G-150，Q-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) Toyopearl HW-65 (Tosoh) porcine pancreatic trypsin (Biozyme) porcine pancreatic elastase， porcine pancreatic kallikrein， human plasma kallikrein(Sigma) (Worthington). bovine pancreatic αーchymotrypsi n. human plasmin (Boeringer). benzoyl-L-arginine. T-nitroanilide(BApNA)， Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanine ρ-nitroanilide (Suc-(Ala)3 pNA)(Peptide Institute); N-glutaryl-L-phenylalanine ρ-nitroani1ide (GpNA)(Research Organics) H-n-valyl-L-leucyl-L-lysine t-nitroanilide (S-2251)，H-n-valyl -L-leucY!-L-arginine T-nitroanilide (S-2266)，H-n-proryl-Lphenylalanyl-L-arginine ρ-nitroanilide (S-2302)(KabiVitrum) lipopolysaccharide (Salmonella typhimurium)(LPS)(Difco).. 2 . 方法 2 .1 . 電気泳動法. sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS. -4-.

(7) -PAGE) は Laemmli の， native-PAGEは D avisの方法た . 等電点電気泳動法は Yamamotoらの方法. に従って行なっ. ，. 8 ζ 準じて行なった.. 2 .2 プロテイナーゼ阻害活性測定法トリプシン間害活性は，各フラクションの試料 5 0μlに O .2mg/m1 trypsi n. 0mMTri s-HC1buf fer， pH8 .2 500μlを加え， 3 7" cにて 5分間イ 1 0μlと 5 ンキュベー卜した後，基質 1mM 3ApNAを 5 00μl加え 3 7" cにて 1 0分間反応させ，最後に 3 0% ( v / v )酢酸 250μlを加えて反応を停止させ 410nmの吸光度を測定した.試料の濃度とプロテイナーゼの種類によって試薬の種類と量及び反応時間は適宜変更した各プロテイナーゼ回害活性を測定するため用いた基質は，以下のとうりである O. elastase， Suc-(Ala)3pNA. chymotrypsin，GpNA. pancreatic kallikrein， S-2266. plasmin， S-2251. plasma kallikrein，S-2302.. 2 . 3 . 抗血清作製法精製した各プロテイナーゼインヒビター約. adjuvantと混ぜてウサギに皮下注射し， Oucht e rl o n y法たのち. . o01mgを，. completeFreund's. 2週間後 boosterを追加した.. 1 0にて各インヒビターに対する抗体ができていることを確認し. pentobarbital全麻下で抗血清を採取した .. 2 . 4 . 炎症の起こし方 LPSを 2 0mMphosphate buffered s a li n e， pH7 . 0(PBS) に溶解し，. 1. 個体につき LPS 2 00μgを腹腔内注射した.. 2 .5 . 血中濃度測定法. LPS注射前，. LPS注射後 O .5， 1， 2， 3， 7日の各時点で 5匹のハムス. ターから d iethyl ether麻酔下で心臓採血した . 血清中の各インヒビターの濃度はロケット免疫電泳動法. 1 1にて測定した.. 2 . 6 . アミノ酸分析，アミノ酸配列分析アミノ酸分析は A ppliedBiosystems derivatizer amino acid. ー. 5-.

(8) analysis system 420Aを用いて行なった . アミノ酸配列は精製した蛋白を SDS-PAGEした後 PVDFmembraneに移し，該当するバンドを切り出し Appli ed Biosystems 477A にかけて N末端 2 0個のアミノ酸配列を決定した . 2 . 7 . コンドロイチナーゼ処理 Pα1 1 .8μgと c hondroitinase ABC O .02Uを 30mMsodiumacetate， 10mMEDTAを含む 50mMTris-HCl buffer，pH8.2中で 3 7t 3 0分間反応させた.. 結果. 1.精製 1 . 1 . α ー 1ーアンチプロテイナーゼ (AP)およびカウンタートリピン (CT) の精製すべての操作は 4tで行なった . 解凍したハムスター血紫 (3 5ml) を， 5 0m M. Tris-HCl， pH7.5， 0.15MNaClで平衡化した BlueCellulofine のカラム ( 4x2 4cm)にかけ，流速 40ml/hで同 bufferを流した . 素通りを 1 0ml ずつ分取し，各画分の 280nmでの吸光度と. trypsin間害活性を測定した. (Fig. 1 .A). 活性のあった部分 ( 画分 21-50)を集め，同 b ufferで平衡化した hydroxyapatiteカラム ( 4x1 2cm)にかけ，同一 bufferで洗浄したのち， sodiumphosphate buffer， pH7 . 5の濃度勾配 (5-200ロ削)を用いて溶出さ. I !h). 溶出液を 10mlずつ分取し，同様に 280nmでの吸光度とせた ( 流速 30m. 1. trypsin阻害活性を測定した (Fig. 1 .B). 次に，活性画分 ( 34-39)を集め 80 9 ぢ飽和硫安にて塩析した. SORVALL RC2-B SS-34にて 1 0，000rpm，1 0 分間遠心分離して得られた沈殿を，小量の bufferに溶解し，. G-150 (約 1. Sephadex G-100，. 1混合物 ) のカラム ( 3x 155cm)にかけた. 50m MTri s-. .5， O .15M NaCl bufferを用いて分画し同様に活性を測定した ( HC1，pH7 Fig. 1 . C ).活性のあった画分 ( 5 9 64)を集め 50mMTris-HC1，pH 7 . 5 申. -6-.

(9) A .Blue. B . Hydroxyapatite. Cellulofine. 3E. 1 . 2. J 1Hl0~ j ¥f l. 0 . 8. 1 . 5. ¥ I¥. . .. 08. 4 0.. of. 。. 1 .2 』. 20. C .. 0 . 5. 40. 60. 自0. F r a c t i o nN o .. 100. G・100， G-150. 0 . 2. I ' 可 0 . 0f o 20. l0 . 0. ~Tァー~.. 0 . 0 8. 1 ¥. 0 . 0 2 0 . 0 P-'I. o. Y. '. 5. 20. 40. F r a c t i o nN o .. ~0.0. 60. 60. F r a c t i o nN o .. 80. 100. o. ・ ‘. ，0.8 卜0 . 6. T¥. r¥ /. 八、. 1 .. 0 . 0 0￨. 80. A. 且. j\~. < <0.04. 0 . 2. ，. .E .' r . .0.0. 0 . 1 0. 0 . 6. 1 1 v. 40. D.Q-Sepharose，pH 7 . 5. ，0.8. 官. 0. 4. 0. 4 <. ¥ J. ". ト0 . 2. . .i. ，. ‘. 『. 40. 20. 0 . 0. 60. F r a c t i o nN o .. F .Q-Sepharose，pH 5.5. . 5 E.Q・Sepharose，pH 5 0 . 0 4. 0 . 1 5. 0 . 6. ，0.3. 0 . 0 3 0 . 2. ¥ 1 ¥ (. 。田 ].~~j:: 0 . 0 0. 守内角~0.0. ・吋. o. 0 . 0 1. 20. 40. F r a c t i o nN o .. 60. 80. ~A l Vド M U. o. 10 20 30 40 50 60 70. F r a c t i o nN o .. F i g .1 Pu r i f i c a t i o nofAPandCT ・ ( A-FAbsorbancea t280nm，. -);Absorbancea t 410 nm which r e p r e s e n t st r y p s i ni n h i b i t o r ya c t i v i t y， ( ← 0 ). -7ー.

(10) buffer1 < :対し 3日間透析した.次にその内液を，. 50mMTris-HC1，pH7.5. bufferで平衡化した Q-Sepharoseカラム ( 3x 6 cm)にかけ流速 24ml/h で同 bufferを流した後，. 0-0 . 3M の NaCl濃度勾配で溶出させた.活性を測定す. ると 2つのピークが出現し，前方のピークは C Tを，後方のピークは A Pを含んでいた (Fig. 1 . D). そこでまず，後方のピークの画分 (46-50)を集め. Imrnersible CX-30で濃縮し，. PD-10にて 2 5m Mpiperazine，pH5 . 5 に. buffer 交換した後，同 bufferで平衡化した. Q-Sepharoseカラム ( 1x 40 5ml/hで平衡化 bufferを流した後， cm)にかけた . 流速 1. O-0.3MNaCl. 濃度勾配ζ l て溶出させ，ほぼ純粋な A Pが得られた (Fig. 1 . E). また APと同. .F) . 様な手順で，前方のピーク (28-34)からは CTが単離された (Fig. 1 1 .2 . プレ α トリプシンインヒビター (Pα1)の精製. 5mlを 50mMTris-HC1，pH7 . 5， 0.15M 解凍したハムスター血奨 3 .6x 1 0cm )にかけ，同 NaC1 bufferで平衡化した Q-Sepharoseのカラム ( 2 buffer を流した後，流速 40ml/h1 < :て 0.15-O .50M NaCl濃度勾配で溶出させた.溶出液を 5mlずつ分取し 280nmでの吸光度と trypsin 阻害活性を測定した (Fig .2 .A ).活性のあった画分 (39-48)を集め ImmersibleCX-30 で濃縮した後，. 5 0mMTris-HCl， pH7.5， O.15MNaCl， bufferで平衡化し. 5カラム ( 2 . 6 x 95 cm)にかけ，同 bufferを流速 2 5ml た Toyopear1H W-6 /hで流した . 流出液を 5mlずつ分取し 280nmでの吸光度と trypsin回害活性 g .2 . B ). 活性のあった画分 ( 76-83)を 50m M Trisを同様に測定した (Fi . 5， 0.15M NaCl bufferで平衡化した CMAffi-Gel Blue カラ HCl，pH7 ム( 1x 38cm)にかけ，同 bufferを流速 1 0ml/hで流した. ほぼ純粋な PαIが得られた (Fig. 2 . C).. -8-. 素通り画分から.

(11) A . Q-Sepharose. B .Toyopearl. 3. ￨刈Vぺバ. 0 . 5. I. 0 . 4. ∞ 。. 2. H W・65. 0 . 3. 0 . 2. 。寺。田. V ¥ I. Nd﹃. 0 . 3. < : ( < : (. 0 . 1. ^. 0 . 2. ol o. .' .' .‘ず. .￨0.1. a.. 10. 20. 30. 40. 50. 60. ¥ 1 0 . 0 MJ~ 40 50. ， . ... I60 70. 80. 』 .. E. 90. F r a c t i o nN o .. F r a c t i o nN o .. c .CM Affi・Gel Blue 0 . 0 8. 0 . 6. 0 . 0 6. 0 . 5. 0 . 0 4. 0. 4. o. α 3 C ¥ I. o. 〈. F. 守. 〈. 0 . 3. 0 . 0 2. 0 . 0 0. o. 10. 20. 0 . 2 30. F r a c t i o nN o .. F i g .2 Pu r i f i c a t i o nofP α ，I b s o r b a n c ea t A-CA b s o r b a n c ea t280nm，(・---);A 410 nm w hich r e p r e s e n t st r y p s i ni n h i b i t o r ya c t i v i t y， (←-0). -9-. t f0 . 0 100.

(12) 回・・圃. て ; 緋除数; こ w. 。. 等、. +. dye I ~ f r on t l F i g . 3 Native-PAGEofAP， CTandPα ，I Lane3，Pα ， I Lane1，AP;Lane2，CT; 2 . AP，CTおよび PαIの性質それぞれのインヒビターは native-PAGE，還元，非還元下 SDS-PAGE で. Figs. 3-5). C Tと PαIは非常に分解しや単ーなノインドとして泳動された ( すく，数日のうちに単一バンドでなくなり，とくに C Tは 2 8 0nmの吸光度が日に日に上昇する傾向があった . 等電点電気泳動ではそれぞれ数本のバンドとして泳動された ( Fig. 6). ヒ卜 A Pを等電点電気泳動すると普通 microhetero-. geneit yのため数本のバンドが現われるが 11 ハムスター A Pでは強く染まるパンドが 2本と薄く染まるバンドが 1~ 2本現われるのみであった . 電気泳動から求めた分子量と等電点は Table 1のとうりである。 A Pは e lastase. -10-.

(13) DTI 十 }. AP. M. DTT(+) CT. kDa. 94. 67. ・嗣・・相醐聞. .. 43. ま. AP. M. CT. "嶋司陣凶岨圃柳欄輪出向揖. 30. 時. ・闘・・. .闘圃圃'. . . .. 匂刷聞聞醐酔. F i g. 4 SDS-PAGEo fAPandc r DTT，D i t h i o t h r e i t o l; M，M o l e c u l a rw e i g h tmarker. DTI( ・ M P α i kDa. 9ヰ純一. DTT(+). P α l. M. 相酬酬輔惨. ー ‘. 67. 43. F i g.5 SDS-P AGEo fP α I DTT， D i t h i o t h r e i t o l; M， M o l e c u l a rw e i g h tm a r k e r. -11-.

(14) Table1. MW(Da). M Wandp lo fAP， CTandPαi AP. CT. Pαl. 68， 000. 55， 000. 120， 000. p l. 4.06・4.14. 4.25・4.30 4.30・4.37. Table2. I n h i b i t o r ySpectrumo fAP， CTandP α l AP. e l a s t a s e( p o r c i n epancreas) p l a s m i n(humanplasma) chymotrypsin( b o v i n ep a n c r e a s ) k a l l i k r e i n( p o r c i n epancreas) k a l l i k r e i n(humanplasma) k a l l i k r e i n( g u i n e ap i gplasma) t r y p s i n( p o r c i n epancreas). CT. P α l. +. +. ++ +. ++. chymotrypsi n と trypsinを阻害し， CT と PαI は trypsi nのみを阻害した (Table2). Ouchterony法ではインヒビター相互の共通抗原性は認められなかった (Fig. 7) . A Pの N末端 2 0個のアミノ酸配列を比較のためラットと並べて Fig. 8に示した. ヒト PαIは還元剤では分解されず. chondroitinaseABCや hyaluro-. nidase処理によって 2本のポリペプチド鎖に分解されることから，ジスルフィド結合ではなくグリコサミノグリカン鎖を介して，. -12-. 2本のポリペプチド鎖が結合.

(15) p l. 12 3. 3 . 7 5. 紛場. 41 .5-. 4 . 5 5-. F i g .6 I s o e l e c t r i cf o c u s i n go fAPa n dCT AP; Lane3，CT Lane1 ， p Im a r k e r;Lan~ 2，. -13ー.

(16) F i g .7 DoubleimmunodiffusionofAP， CTandP α ，I 1 ，AP;2， CT; 3， Pα1; 4， a n t iAP;5，a n t iCT; 6， a n t iP α I. N-te工百unal sequence. inhibitor hamsterAP rat AP. ED. : : : : : ￨ ; : ; 回: ; : : E : :. hamster Pα工(heavychain) human Pα工(heavychain) hamster Pα工(lightchain) human Pα工(light chain). F i g .8 Comparisono fN t e r m i n a le i c o s a p e p t i d es e q u e n c e. -14-.

(17) 2. 1. ♂: . .山崎. kDa 1. 、，.' < l : み. 俳. 94. r f i r噸叫. 67. 訓. d l 刷、山地. 43. 、 ‘ ・守 ‘.. ‘. 論議議. 30. 線網. 20. ゆ f f " -. F i g .9 SDS-PAGEo fn a t i v ePα1andc h o n d r o i t i n a s e t r e a t e dPα ，I 1 ， c h o n d r o i t i n a s et r e a t e dP α 1; 2， n a t i v eP α I 制. していると考えられている. 1 3. そ乙で精製したハムスター PαIをコンドロイチ. 2万のバンドは消え，新たに分子量ナーゼ処理した後電気泳動をすると，分子量 1 9万と 2 .5万のバンドが出現した (Fig.9). それぞれのバンドの N末端アミノ酸配列を決定し，. ヒト PαIのアミノ酸配列と比較したと乙ろ，両鎖とも 2 0個中. 1 3個が一致していた (Fig. 8).. 3 各インヒビターの卜リプシン阻害活性 A Pおよび C T共に trypsinを約 1. のモル比で阻害するのに対し PαIは. trypsin Pα1= 1 1 .6のモル比であった (Fi g .1 0.A-C)• 4 . 急性炎症時の濃度変化今回精製した AP， C Tおよび Pα1 I C対する抗血清を用いて各インヒビターの濃度変化をロケット免疫電気泳動法にて測定した.また以前当教室で作成してあった α-macr 0g1 0b u1i n(α-MG) と murinoglobuli n(MUG)に対する抗血. Fhd.

(18) A .Trypsin Inhibition by AP 0 . 8. 0 . 6 o. 0 . 4. • 〈. 0 . 2. 0 . 0 0 . 0. 1 . 0. 0.5. 1 . 5. AP l T r y p s i n( m o l a rr a t i o ). B .Trypsin Inhibition by CT 1 . 0. 0 . 8. 4. hu. ov守︿. 0 . 6. 0 . 2. 0 . 0 0 . 0. 0.5 1.5 1 .0 CT l T r y p s i n( m o l a rr a t i o ). 2.0. C .Trypsin Inhibition by Pα1 0 . 3. 0 . 2 O F守︿. 0 . 1. 0 . 0. o. < . 2 P < < l l Tr y p s i n( m o l a rr a t i o ). 3. F i g .1 0T r y p s i ni n h i b i t i o nbyAP， CTandPα ，I. pnu.

(19) AP. α・M G. 2 . 2. 2 . 2. ，1•8. ー骨言〈. 3 018. 1 . 0. 1 . 0. g0.6 s. 雲~ 0 . 6. 。. 。. 0 . 2. 0 . 2. 2. 4. d a y CT. 8. 6. 2. 4. 6. 8. 6. 8. d a y MUG. 2 . 2. 2 . 2. 『宴 @ 〈 1 . 8. E 〈@1 ・ 8. 同. 。. ヨ Z 由 8 Z1 . 4. 1 . 0. B 31. S a0 . 6. 也孟0 . 6. 。. 0 . 2. 2. 4. 。. 0 . 2 6. 8. day. 2. 4 day. PαI 2 .2. g 也〈 a L 1 . 8. o S0.6. 。. 0 . 2. 2. 4. 6. 8. d a y F i g .1 1 C h a n g e sofp l a s m al e v e lofv a r i o u sp r o t e i n a s ei n h i b i t o r s a f t e ra c u t ei n f l a m m a t i o n Thev e r t i c a la x i ss h o w sr e l a t i v ep l a s m al e v e l s， t h eh o r i z o n t a la x i sd a y sa f t e rt h ei n j e c t i o no fLPS Thei n j e c t i o nofLPSwasdonea f t e rt h eday0 Eachp o i n tr e p r e s e n t st h emeano f白v ea n i m a l sa n de a c h b a rt h es t a n d a r dd e v i a t i o n. ~17-.

(20) 清を用いて α-MGとMUGの濃度変化も合わせて測定した. PαIは起炎後 1日から上昇し始め 3日後にピークとなり，起炎前の約 2倍になった. M UG は起炎 1 2時間後から減少し始め. 3日後 ζ l最低値となり 7日後にも回復していなかった.. AP， CT，α-MGは大きな変化はしなかったが， APは全体にやや減少， αM Gは一過性 l とやや減少する傾向を認めた (Fig.11).. 考察. ハムスター血紫中からトリプシン阻害活性をもっ 3種類のプロテイナーゼインヒビターを精製しその性質を調べ，炎症時の濃度変化を測定した. ヒト A Pは最もよく研究されたプロテイナーゼインヒピターの一つで，. 394個. のアミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖が 3個の β シートと 8個の αヘリックスを形作っている. A Pの標的酵素は好中球エラスターゼであり，その先天的欠損症は肺組織の破壊の結果肺気腫をもたらす 14. ハムスター A Pは分子量 6 .8万で. ヒ卜 A Pの分子量よりやや大きい . 乙の差が糖鎖によるものかアミノ酸によるものかは不明である. N末端 2 0個のアミノ酸配列をヒ卜とラットの APと比較するとラットとは 1 1個ヒ卜とは 9個一致していた (Fig. 8).. C Tは山本によりマウス腹水及び血中から精製されたトリプシンのみを阻害するプロテイナーゼインヒピターである. 1 5. 当初，容易に分解される乙と，. トリプ. シンしか阻害しない乙とから inte←αー trypsin inhibitor (IαI )の分解産物とも考えられた.しかし N末端のアミノ酸配列が全く異なること，ハムスターにも同族と考えられる蛋白質が存在することなどから，別の蛋白質と考えられる. その生理的役割は不明で，今後の研究課題である.. IαIは glycoproteinπ として初めて記述され 16 の inhibitorであることが示された 17. 後に bovine trypsin. その名は電気泳動上 α1 -α2g lobu1i n. の聞に移動することに由来する. IαIは，還元剤存在下 SDS-PAGEにて単一バンドとして泳動されるため，当初一本鎖の蛋白と考えられていた.. -18-.

(21) しかし Iα11[.関連した baboon 1i ver mRNAの翻訳産物が 3種類のポリペプチドであったことや，. ヒ卜肝 cDNAの知見から. 1αIは 2本以上の蛋白から. 成っていることが示唆され 1 8 2 1 さらに testis hyaluronidaseや chondro-. 3 iti nase ABCで処理すると 3本のポリペプチド鎖に分れることがわかり 1 g h t chainがコンドロイチン硫酸を介 IαIは 2本の heavy chainと 1本の 1i して結合しているのではないかと推測された 2 2 最近ヒト血中には IαIのほかに. agarose電気泳動で αglobuli nの前ζ l位置し分子量 1 2 .5万で heavy. chain， 1ight chainそれぞれ 1本からなる PαIが存在することが報告された 2 3 本実験では当初ハムスター血葉から IαIを精製する目的でトリプシン阻害 2万で予想よ活性のある分画を追っていったところ，得られた精製物の分子量は 1 りはるかに小さかった . そ乙でこの精製物を chondroitinaseABC処理した後. .5万の新たな 2本のバンドが出現した. 電気泳動してみたところ，分子量 9万と 2 それぞれのアミノ酸配列を決定したところ，. ヒ卜 PαI と高い相向性が見られ，. L相当するインヒビターであることがわかった . ヒ卜以この精製物はヒト Pα1I 外の動物で PαIの存在が確認されたのは初めてであり，ハムスターは PαIの生理的役割の解明にとっても大切な動物であると言える. 急性相蛋白としてプロテイナーゼインヒビターがどういう生理的役割を担っているかは推測の域を出ないが，比較的近い種においても急性炎症時のプロテイナーゼインヒビターの挙動が異なるのは興味深い現象である.本実験で顕著に増加. g h t chainが腫蕩や炎症時にしたのは PαIであった. 1αIの一部である 1i 増加するとの報告はあるが 2 4 α Iは様々な病態でも変化しないという報告人. 2 6や逆に減少するとの報告 2 7 2 9もあり. 1αIについて一定した見解はない.ま. た PαIについてはまだ何も報告されていない. MUGはマウス血中から単離された α-macroglo buli nファミリーに属する分子量 1 8万の糖蛋白である 30αMG ファミリーは脊椎及び無脊椎動物循環中や鳥類，~虫類の卵白中に含まれる. 高分子量の糖蛋白で，プロテイナーゼに対し“ molecular t raps" として働いて. n u.

(22) Table3. I n h i b i t o r s AP CT P α l α-2 ・ MG MUG. Acutephaseresponsei nv a r i o u ss p e c i e s. Hamster Human R a b b i t Rat Mouse Guineap i g. ( t ). t. . t ， '. 2 4 ・f o l di n c r e a s e ;t tover10・foldincrease;ー nosignificantchange d e c r e a s et o1 1 3l e v e lo ft h ec o n t r o l ;b l a n k， n o td e t e c t e di nplasma I. I. いる.分子中 l と" bait" regionと呼ばれるプロテイナーゼで切断され易い部分があり，. この部分が切れると分子全体の conformationが変化しプロテイナーゼ. rapできるようになっている .α-M GI l :t rapされたプロテイナーゼは，をt. α. l入りこめる低分子基質は分解できるが，入り込めない高分子基 -MGの分子内ζ 質は分解できない 31. ヒト α 2-M Gは 4量体だがマウス MUGは単量体でこの相. 3 3 同物はラット及びモルモットにも存在する 32，. ハムスター MUGは起炎 1 2時間. 後から減り始め 1週間後にも元に復さなかった . これはラット，マウスと同様な反応である人 3 4. APはヒ卜，ラット，モルモットでは急絶相蛋白であり. 1 ， 3， 3 5. マウスではそうでないが¥ハムスターではむしろやや減少する傾向が見られた.. α-MG はラット，モルモッ卜では急性相蛋白であるが 3， 3 5 ウスではそうでない. 1， 34， 36. ヒト，ウサギ，マ. ハムスターでも大きな変化はなかった.以上の結果. をまとめると Table 3になる. ハムスター血中から 3種類のトリプシン阻害活性を持つプロテイナーゼインヒビター (AP，CT，Pα1 )を精製し性質を調べた. APはヒ卜に比しやや分子量が大きいものの際だった特長はなかった . PαIはヒト以外の動物からは初めて精製され，ハムスターにおいては急性相蛋白であることがわかった.. -20-.

(23) 謝辞稿を終えるにあたり，本研究の御指導と論文の御校聞をいただいた篠原兵庫教授に深く感謝いたします.また終始暖かい御援助と御助言をいただき，. α-MG. および MUGI 乙対する抗血清を提供していただいた山本和彦先生に心から感謝いたします . さらに本研究の実験に御協力いただいた第 2生化学教室の諸先生方に. yrian hamste rの提供に対し動物室渡辺信介氏に感謝い謝意を表します.また S たします. 最後に本研究の機会を与えてくださった東洋医学研究所第 2研究部門遠田裕政教授に深甚の感謝の念を捧げます.. 3回日本生化学会 (1990 年 9月本論文の要旨は，第6 学会(1 991年 8月，エルサレム ) にて発表した .. -2 1ー. 大阪 )，第 1 5回国際生化.

(24) 文献. 1 .K u s h n e r1 . Thea c u t ep h a s er e s p o n s e:ano v e r v i e w .MethodsEnzyrno11988; 1 6 3:373-383. a t i r n e rJ J，G l i b e t i cMD. Mouseα1・ p r o t e a s ei n h i b i t o ri sn o ta n 2 .B a u r n a nH，L a c u t ep h a s er e a c t a n t .Ar chB i o c h e r nB i o p h y s1 9 8 6; 246:488-493. a i t oA，N a g a s eS，S i n o h a r aH. A c u t ep h a s er e s p o n s eo fp l a s r n a 3 . Goto K，S p r o t e i n si nan a 1 b u r n i n e r n i cr a t s .JB i o c h e r n1988;104:952-955. 4 . Bi 1 l i n g h a r nRE，S t r e i l e i nJW. I n t r o d u c t i o n .AdvExpMedBio11981 ;134: 1 3 . n i d e rGL . A n i r n a lr n o d e l so fe r n p h y s e r n a .ArnRevResD i s . 5 .K a r l i n s k yJB，S 1 9 7 8;1 1 7:1109-1133. l e a v a g eo fs t r u c t u r a lp r o t e i n sd u r i n gt h ea s s e r n b l yo ft h eh e a d 6 .L a e r n r n l iUK. C o fb a c t e r i o p h a g eT 4 .N a t u r e1 9 7 0; 227:680-685.. 1 .Methoda n da p p l i c a t i o nt oh u r n a ns e r u r n 7 .D a v i sB J . D i s ce l e c t r o p h o r e s i s:1 p r o t e i n s .An nNYAcadS c i1964;1 2 1:404-429. 8 .Y a r n a r n o t oK，S u z u k iS，S i n o h a r aH . S y n t h e s i so fc o n t r a p s i nandα・1 ・剖l t i p r o t e i n a s ei ni n f l a r n e dandt u m o r b e a r i n gm i c e . BiochemI n t 1988 1 6 921-928. e r g m e y e rJ， G r a s lM，e d s . Methodso fE n z y m a t i cAna l y s i s . 9 .B e r g m e y e rH U，B 9 8 4 . v o 1 5 .3 r de d .F l o r i d a:V e r l a gChemie，1 1 0 .O u c h t e r l o n yO . D i f f u s i o ni ng e lmethodsf o ri m m u n o l o g i c a la n a l y s i s .P r o g a l l e r g y1953; 5:1 7 8 . 1 1 .L a u r e l 1L B . Q u a n t i t a t i v ee s t i m a t i o nofp r o t e i n sbye l e c t r o p h o r e s i si na g a r o s e g e lc o n t a i n i n ga n t i b o d i e s .A n a lB i o c h e r n1966; 1 5:45-52. -22-.

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(27) 与の可能性. 日血会誌. 1 9 8 0 ;4 3 :587-592.. 2 9 . ChawlaRK，R a u s c hDJ，F r e d e r i c kW M，V o l g e rWR，LawsonDH. Abnormal p r o f i l eofserump r o t e i n a s ei n h i b i t o r si nc a n c e rp a t i e n t s .C a n c e rR e s 1984 44:2718-2723. i n o h a r aH . M u r i n o g l o b u l i n， an o v e lp r o t e a s ei n h i b i t o rfromm u r i n e 3 0 .S a i t oA，S . p l a s m a .JB i o lChem1985; 260:775-781. 3 1 .S o t t r u p・J e n s e nL .. α M a c r o g l o b u l i n s s t r u c t u r e，s h a p e，a n dmechanismo f. p r o t e i n a s e complex f o r m a t i o n .JB i o l Chem 1989 ;264 11539ー 1 1 5 4 2 . 3 2 .S a i t oA，S i n o h a r aH . R a tp l a s m am u r i n o g l o b u l i n:i s o l a t i o n， c h a r a c t e r i z a t i o n， a n dc o m p a r i s o nw i t hr a tα・1 ・a n dα・2 m a c r o g l o b u l i n s .JBiochem1985;98: 501-516. i gp l a s m am u r i n o g l o b u l i n .B i o lChemHoppe3 3 .S u z u k iY，S i n o h a r aH . G u i n e aP. S e y l e r1986; 367:579-589. 3 4 . YamamotoK，T s u j i n oY，S a i t oA，S i n o h a r aH . C o n c e n t r a t i o no fm u r i n o g l o ・ b u l i nandα~-macroglobulin i nt h emouses e r u m:v a r i a t i o nw i t ha g e，s e x，a n d e x p e r i m e n t a li n f l a m m a t i o n .BiochemI n t1 9 8 5;1 0:463-469. 3 5 .S u z u k i Y，Y o s h i d a K，I c h i m i y a T，Yamamoto T，S i n o h a r aH .. T r y p s i n. i n h i b i t o r si ng u i n e ap i gp l a s m a:i s o l a t i o nandc h a r a c t e r i z t i o no fc o n t r a p s i na n d n t i p r o t e i n a s eand a c u t ep h a s er e s p o n s eo ff o u rm a j o r two i s o f o r m so fα ' 1・a t r y p s i ni n h i b i t o r s .JBiochem1 9 9 0;1 0 7:1 7 3 1 7 9 . 3 6 .L e b r e t o ndeVonneT，GutmanN，MourayH . L e sa l p h am a c r o g l o b u l i n e sd e l a p i na uc o u r sd el ar e a c t i o ni n f l a m m a t o i r e .C l i nChimA c t a1970; 30:6036 0 7 .. -25-.

(28)