マ ウ スAPEXヌ
ク レ ア ー ゼ 遺 伝 子 の
ク ロ ー ニ ン グ と構 造 解 析
岡 山大学 医学 部 附属分 子 細胞 医学研 究 施 設病 態分 子生物 学部 門(指 導:関
周 司教 授)
長
尾
一
孝
(平成6年2月28日
受稿)
Key words: APEXヌ ク レ ア ー ゼ, APエ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ, DNA修 復 酵 素, Apex遺 伝 子(マ ウ ス), CpG island 緒 言 細 胞 の 遺 伝 物 質DNAは,内 ・外 か らの 種 々 の 要 因 に よ り多 様 な 損 傷 を受 け て い る1).なか で も多 い の が プ リン あ る い は ピ リ ミジ ン塩 基 の 欠 落 で,直 接 的 に あ る い は 損 傷 塩 基 がN-グ リ コ シ ラ ー ゼ 作 用 で 除 か れ た結 果 と して 間 接 的 に, 1 日1細 胞DNA当 た り1万 箇 所 も生 じ る こ とが 知 ら れ て い る2), 3).ま た,イ オ ン化 放 射 線,活 性 酸 素 等 に よ り損 傷 され たDNAに よ く見 ら れ る ヌ ク レ オ チ ド破 片 が3'端 に 結 合 し て い る(3'ブ ロ ッ ク端 を もつ)一 本 鎖 切 断 も, 1日1細 胞 当 た り数 個 生 じ るこ とが 知 られ て い る1,4-7).これ ら の 損 傷 は,一 般 に は 細 胞 が 具 備 し て い る修 復 酵 素 系 に よ り元 通 りに 修 復 さ れ て,遺 伝 的 連 続 性, 損 傷 前 と 同様 の 情 報 発 現 が 保 た れ る.し か し, 時 に は誤 っ た修 復 が な され て 突 然 異 変 を きた し, 結 果 と し て,遺 伝 形 質 の 変 化 ひ い て は 表 現 形 質 の 変 化(が ん 化,分 子 遺 伝 病,素 因 等)に つ な が る こ と が あ る こ とが 知 られ て い る8). 塩 基 欠 落 部 位(apurinic/apyrimidinic sites; APサ イ ト)修 復 は,一 般 にAPエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ に よ りAPサ イ トの5'側 に 切 れ 目 を入 れ る こ とに よ り開 始 され る. 3'ブ ロ ッ ク端 を もつ 一 本 鎖 切 断 の 修 復 開 始 は, DNA 3'修 復 ジ エ ス テ ラー ゼ 作 用 に よ り3'ブ ロ ッ ク を 除 くこ と に よ っ て 修 復 が 開 始 さ れ る9).大 腸 菌(Escherichia coli)で は,両 作 用 を も っ た 酵 素 と して,エ キ ソ ヌ ク ア ー ゼIIIとエ ン ドヌ クア ー ゼIVが 知 られ て お り,こ れ ら酵 素 の 遺 伝 子 も解 明 され て い る10, 11). 哺 乳 類 で も, 1970年 代 か ら これ ま で 多種 類 のAP エ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ の 報 告 が な さ れ て き た.そ して,最 近 ま で 哺 乳 類 の 主 要 なAPエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ は, 3'→5'エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 を もた な い エ ン ドヌ ク レ ア ー ゼIV型 酵 素 と考 え ら れ て い た. 1991年, 3つ の グル ー プ か ら独 立 に, 哺 乳 類 の 主 要 なAPエ ン ドヌ ク レアーゼ のcDNA クロー ニ ン グの 報 告 が な され た12). Robsonら13, 14) は,ウ シお よ び ヒ トのcDNAを ク ロー ニ ン グ し, 酵 素 をbovine (human) AP endonuclease 1
(BAP 1 & HAP 1)と 命 名 し た.関 ら15, 16)は, マ ウ ス お よ び ヒ トの 本 酵 素cDNAを ク ロー ニ ン グ し た. Dempleら17)は,ヒ トのcDNAを ク ロー ニ ン グ し, APE cDNA,酵 素 をApe protein
と命 名 した.関 ら15, 16)は,本 酸 素 が エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIIIと 同 様 に, 5'APエ ン ドヌ ク レア ー ゼ 活 性, DNA 3'ボ ス タ フ ァ ー ゼ 活 性, 3'→5'エ キ ソ ヌ ク レア ー ゼ 活 性 お よ びDNA 3'修 復 ジエ ス テ ラ ー ゼ 活 性 を もつ 分 子 量35kDaの 多 機 能 DNA修 復 酵 素 で あ る こ と を示 した.以 上3グ ル ー プ か ら報 告 さ れ たcDNAは 互 い に 高 い ホ モ ロ ジ ー を示 し,同 一 酵 素 で,エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼ III (E. coli)の ホ モ ロー グ で あ る こ とが 判 明 し た.関 ら18)は,エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIII型 の 主 要 な APエ ン ドヌ ク レ アー ゼ で あ る こ とか ら,本 酵 素 をAPEX nuclease,遺 伝 子 名 は 命 名 の ガ イ ドラ イ ン19)に従 い,ヒ ト遺 伝 子 をAPEX,マ ウ ス 遺 伝 子 をApexと した. 本 酵 素 の 機 能 に 関 し て は,精 製 酵 素 に よ る 研 究 か ら少 な く と も4つ の 酵 素 活 性 を示 す 多 機 能 717
DNA修 復 酵 素 で あ り, E. coliで エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIIIと 相 補 し う る こ とが 明 ら か に され て い る.し か し,哺 乳 類 細 胞 内 で の 本 酵 素 の 機 能 と 発 現 調 節,特 にDNA修 復 系,複 製 系,転 写 系 等 の ネ ッ トワ ー ク の 中 で の 本 酵 素 の 役 割 や 本 酵 素 異 常 に 基 づ く疾 患 の 有 無 の 検 討 等,多 くの 重 要 な 研 究 課 題 が 考 え ら れ る.こ れ ら研 究 を遂 行 す る た め に は, Apex遺 伝 子 とそ の プ ロ モー タ ー 領 域 の 構 造 を明 らか に す る必 要 が あ る と思 わ れ る.特 に,マ ウ スApex遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ と そ の 構 造 解 明 は,本 遺 伝 子 破 壊(ノ ッ クア ウ ト)マ ウ ス の 作 成 を可 能 と し,生 体 内 に お け る本 酵 素 の機 能 解 明 に 有 用 と考 え られ る. 本 研 究 で は マ ウ スApex遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ,当 該 遺 伝 子 お よ び プ ロ モ ー ター 領 域 の 構 造 を 明 ら か に す る に す る こ と を試 み た. 材 料 と 方 法 1.材 料 電 気 泳 動 用 の ア ガ ロ ス ゲ ル(Low-Mr)は Bio-Rad Lab.よ り,制 限 酵 素, Klenowポ リ メ ラ ー ゼ, E. coliア ル カ リ ホ ス タ フ ァ ー ゼ, SeakemTM GTGア ガ ロ ー ス, DNA回 収 用 フ
ィ ル ター 付 き遠 心 チ ュ ー ブ(SUPRECTM-01), ラ ン ダ ム プ ラ イ マ ーDNAラ ベ リ ン グ キ ッ ト, 7-デ ア ザ シ ー ケ ン ス キ ッ ト(Ver. 2), DNAラ
イ ゲ ー シ ョ ン キ ッ トお よ びGene AmpTM DNA 増 幅 試 薬 キ ッ ト(AmpliTaqTMを 含 む)は 東 洋 紡 績 株 式 会 社 ま た は 宝 酒 造 株 式 会 社 よ り,マ ウ ス 白 血 球 由 来 の ゲ ノ ムDNAラ イ ブ ラ リ ー は CLONTECH社 よ り, DNase Iお よ びRNase AはSigma社 よ り, [α-32P] dCTP (3000Ci/ mmol)はICN社 よ り入 手 し た.ま た塩 基 配 列 の 決 定 に 用 い る 合 成 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドプ ラ イ マ ー(20mer)は 岡 山大 学 医 学 部 共 同 実 験 室 設 置 のDNA合 成 機(Applied Biosystems社 製) で 合 成,一 部 サ ワ デ ィー ・テ ク ノ ロ ジ ー 株 式 会 社 に 依 頼 合 成 した. EMBL-3 SP6/T7フ ァ ー ジ の 指 示 菌 と し てE . coli NM538株 を,プ ラ ス ミ ドの 宿 主 菌 と してE. coli JM109株(コ ン ピ テ ン トセ ル は 東 洋 紡 績 株 式 会 社 よ り購 入)を 用 い た. NZYM培 地20)は,水 溶 液1000ml当 り, 10g NZ Amine(和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社, Type
A), 5g NaCl, 5g Bacto-yeast extract (Difco 社)お よ び2g MgSO4・7H2Oを 含 む よ うに 調 製 し た.指 示 菌E. coli NM538株 の 培 養 に は, NZYM培 地 に0.2%の マ ル トー ス を添 加 した 培 地
を 用 い た. Luria-Bertani (LB)培 地20)は,水 溶 液1000ml当 り10g Bacto-Tryptone (Difco 社), 5gのbacto-yeast extract (Difco社)お
よ び10g NaClを 含 む よ う に 調 製 した.全 て の 組 換 えDNA実 験 は 文 部 省 の ガ イ ドラ イ ン に 従 っ て 行 つ た. 2.マ ウ スApex遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ20) す で に 報 告 され て い るマ ウ スApex cDNA断 片 挿 入pUC18プ ラ ス ミ ド(pExE2)15)か ら, 遺 伝 子 ク ロ ー ニ ン グ用 プ ロ ー ブ を 調 製 した.こ のpExE2プ ラ ス ミ ドDNAを 制 限 酵 素EcoR
Iお よびPst Iで 消 化 し て,ポ リA領 域 を含 ま な いApex cDNA断 片 を 切 り 出 し,ア ガ ロー ス ゲ ル 電 気 泳 動 で こ の 断 片 を 分 離,精 製 した.こ のDNA断 片 を ニ ッ ク ト ラ ン ス レー シ ョ ン 法 で 32P標 識 し ,遺 伝 子 ク ロ ー ニ ン グ の プ ロー ブ と し た.使 用 し た マ ウ ス 白 血 球 由 来 ゲ ノ ムDNAラ イ ブ ラ リー は, EMBL-3 SP6/T7を ベ ク ター と し て 作 成 さ れ て お り,イ ン サ ー トDNAの 平 均 長 は15kbで, 1.6×106個 の 独 立 な フ ァー ジ ク ロ ー ン を含 有 して い る. E. coli NM538株 を25ml の0.2%マ ル トー ス 含 有NZYM培 地 で, 30℃, 一 晩 培 養 し ,遠 心 分 離 で 集 菌, 10mlの10mM MgSO4溶 液 に 懸 濁 し た.フ ァ ー ジ の感 染 時 に, 指 示 菌 懸 濁 液 を フ ァー ジ希 釈 液(NaC1 5.8g, MgSO4・7H2O2.0g, 1MTris-HCl緩 衝 液, pH7.5, 5ml, 2%ゼ ラ チ ン溶 液5mlを 蒸 留 水 に 溶 解 し1000mlに し た も の)で, 600nmに お け る 吸 光 度 が1.0に な る よ う に希 釈 し て 使 用 し た. 一 次 ス ク リー ニ ン グで は ,指 示 菌200μlに3.6×104 pfu (plaque forming unit)の フ ァ ー ジ 溶 液 を 混 ぜ, 37℃ で20分 間 保 温 し て 感 染 させ た. 50℃ に 加 温 した6mlの 上 層 寒 天 培 地(0.7%のBacto agarを 含 むNZYM培 地)と フ ァ ー ジ感 染 指 示 菌 を均 等 に 混 和 して,予 め 用 意 して お い た1.5% 寒 天 培 地 に 重 層 し, 37℃ で 培 養 し た.全 体 で1.5 ×106pfuの フ ァ ー ジ を41枚 の 角 型 シ ャー レ(9 .5 cm×13.5cm)に ま い た.十 分 な 大 き さの プ ラ ー クが 形 成 され た 後,シ ャー レ を4℃ に冷 却 した.
13cm×8.5cmの ナ イ ロ ン フ ィ ル タ ー(Hybond -N , Amersham社)を 寒 天 上 に1分 間 置 き フ ァー ジ を吸 着 さ せ た.変 性 溶 液(1.5M NaClを 含 む0.5N NaOH溶 液)で1分 間,中 和 溶 液(1.5 M NaClを 含 む0.5M Tris-HCI緩 衝 液, pH 7.5)で2分 間, 2×SSC溶 液 で5分 間 処 理 後, 風 乾 し更 に80℃ で2時 間 焼 付 け た.同 様 な 方 法 で レ プ リカ を作 成 し た.こ れ らの フ ィ ル タ ー を 2×SSCで5分 間 処 理 した 後, 0.5%ド デ シ ル 硫 酸 ナ ト リウ ム(SDS), 1mM EDTAを 含 む5 ×SSC溶 液 中 で42℃ で2時 間 振 盪 し て 洗 浄 した. プ ラー クハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン は 次 の 条 件 で 行 っ た.フ ィ ル タ ー を6×SSC, 5×Denhardt溶 液[1×Denhardt溶 液 は0.02%フ ィ コ ー ル (Sigma社, Type 400), 0.02%牛 血 清 ア ル ブ ミ ン(Armour社, F-V), 0.02%ポ リ ビ ニ ル ピ ロ リ ドン(片 山 化 学 工 業 株 式 会 社, K-90)を 含 む], 0.5% SDSお よ び0.1mg/mlの 変 性 サ ケ 精 子DNA (Sigma社, Type III)か ら な るハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン緩 衝 液 中 で, 68℃, 4時 間 加 温 後,液 を 除 き,新 た に ニ ッ ク トラ ン ス レー シ ョン で32P標 識 し た 変 性 プ ロ ー ブDNAを 含 む ハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョ ン液 を加 え, 68℃ で 一 夜 ハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョ ン を 行 っ た.フ ィ ル タ ー を室 温 で そ れ ぞ れ0 .1% SDSを 含 む2×SSC 溶 液 で 各25分 間, 4回 洗 浄 後, 68℃ の0.1% SDS 含 有1×SSC溶 液 で, 90分 間, 2回 洗 浄 し た. 洗 浄 し た フ ィ ル タ ー は,風 乾 後 サ ラ ン ラ ップ で 包 み,増 感 紙(du pont社, Lightening-Plus) を 用 い て フ ジRX医 療 用X線 フ ィ ル ム(フ ジ 写 真 フ ィ ル ム 株 式 会 社)に-80℃ で16∼72時 間 露 出 し,オ ー トラ ジ オ グ ラ フ ィ ー を行 っ た.こ の 一 次 ス ク リー ニ ン グ で検 出 さ れ た 複 数 の 陽 性 プ ラ ー クの 確 認 と単 離 を 行 う た め,二 次 ス ク リー ニ ン グ を行 っ た .そ れ ぞ れ の シ ャ ー レ か ら陽 性 を 示 す フ ァ ー ジ の プ ラ ー ク を採 取 し,単 離 した フ ァー ジ を φ9cmの シ ャ ー レ 当 り約300pfuに 調 整 して,一 次 ス ク リー ニ ン グ と 同様 の 操 作 を行 い 陽 性 の フ ァ ー ジ を純 化 し た . 3. Apex遺 伝 子 挿 人 プ ラ ス ミ ドの 構 築 Apex遺 伝 子 挿 入 組 換 えDNAは 図1の よ う に 構 築 した.前 述 の よ うに して,単 離,純 化 し た 陽 性 プ ラー ク か ら フ ァ ー ジ を 爪 楊 枝 で釣 り上 げ,指 示 菌E. coli NM 538%株 に 吸 着 させ た 後, 図1 マ ウ スApex遺 伝 子 を 組 み 込 ん だ プ ラ ス ミ ドの 構 築 単 離 し たEMBL-3 SP6/T7フ ァ ー ジ ク ロ ー ン に 挿 人 さ れ て い る ゲ ノ ムDNA断 片(15kb)を 制 限 酵 素 Xho Iで 切 出 し, pBluescript KS-プ ラ ス ミ ドのXho I部 位 に 組 込 み,組 換 え プ ラ ス ミ ドpMAPEX9を 作 成 し た.増 幅 し た 後,こ の ゲ ノ ムDNAを 更 にBamH I酵 素 で 消 化 し, Apex cDNAと ハ イ ブ リ ダ
イ ズ す る4kbのDNA断 片 を,同 種 プ ラ ス ミ ドのBamH I部 位 に 組 込 み,生 じ た 組 換 え プ ラ ス ミ ド を pMAPEX9-1と し た.
実 線 は ゲ ノ ムDNAを,波 線 はEMBL-3 SP6/T7フ ァ ー ジ ベ ク タ ーDNA,白 枠 部 分 は マ ウ スApex 遺 伝 子 の 想 定 さ れ る ア ミ ノ酸 コ ー ド領 域,そ の 黒 塗 り部 分 はpBluescript KS-プ ラ ス ミ ドDNA領 域 を 示 し た.図 中 の 制 限 酵 素 切 断 部 位 は 以 下 の よ う に 略 記 し た. X, Xho I; B, BamH I; N, Nar I.
寒 天 培 地 で平 面 培 養 を行 っ た.こ の 培 養 プ レー トか ら, Plate lysate法20)で フ ァー ジDNAを 調 製 し た.こ れ ら の 内 か ら,後 述 す るPCR
(Polymerase chain reaction)法 お よ び サ ザ ン ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン で, Apex遺 伝 子 の 全 領 域 を有 す る フ ァー ジ ク ロー ンの み を選 択 した. これ ら よ り一 つ の フ ァー ジ ク ロ ー ン を選 び(図 1),挿 入 ゲ ノ ムDNA (15kb)を 制 限 酵 素Xho Iで 切 り出 し,ア ガ ロー スゲ ル(SeakemTM GTG) 電 気 泳 動 で分 離 し,当 該 バ ン ドを 切 り 出 し,溶 出 し,ガ ラ ス ビ ー ズ(BIO 101社, GLASSMI LKTM)も し くはDNA回 収 用 フ ィ ル ター 付 き 遠 心 チ ュ ー ブ(SUPRECTM-01)を も ち い て 回 収, 精 製 し た.同 様 に 制 限 酵 素Xho Iで 切 断 し,脱 リ ン酸 化 処 理 を した プ ラ ス ミ ドpBluescript (Stratagene社, 3kb)に,上 記 マ ウ スDNA 断 片 を加 え,ラ イ ゲ ー シ ョ ン キ ッ トで ラ イ ゲ ー シ ョ ン し, pMAPEX 9を 構 築 した.本 プ ラ ス ミ ドで, E. coli JM109を 形 質 転 換 し た. IPTG (Sigma社), X-gal (Sigma社)お よ び ア ン ピ シ リ ン 添 加LB培 地 で,生 育 す る無 色 の コ ロ ニ ー を選 択 した.こ の 形 質 転 換 株 よ りア ル カ リ 法20)で プ ラ ス ミ ドDNAを 抽 出 し,各 種 制 限 酵 素 に よ る 消 化 並 び に マ ウ スApex cDNAを プ ロ ー ブ と した サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り,挿 入DNAの 制 限 酵 素 地 図 作 成 とApex遺 伝 子 の 存 在 を調 べ た.さ ら に, PCR法 に よ り組 換 え プ ラ ス ミ ドが マ ウ スApex遺 伝 子 の 全 ア ミ ノ 酸 コー ド領 域 を有 して い る こ と を確 認 した. こ の よ う に し て 作 製 したpMAPEX9 (18kb) か ら,マ ウ スApex遺 伝 子 の全 領 域 を含 む4kb のDNA断 片 を,制 限 酵 素BamH Iで 切 り出 し, pBluescript KS-のBamH Iサ イ トに 組 込 み,組 換 え プ ラ ス ミ ド(pMAPEX9-1, 7kb) を作 製 し た. E. coli JM109をpMAPEX9-1 で 形 質 転 換 し,本 プ ラ ス ミ ドを 増 幅 した.こ の 挿 入DNA断 片 を,名 種 制 限 酵 素 で 消 化 し,ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 で分 画 し,消 化DNA断 片 サ イ ズ の 比 較 に よ り詳 細 な 制 限 酵 素 地 図 を作 製 した. 4. PCR法 に よ るDNA増 幅21) DNA増 幅 は, DNA増 幅 装 置(ア ス テ ッ ク株 式 会 社,プ ロ グ ラム ・テ ン プ コ ン トロー ルPC-700)を 用 い て,以 下 の 条 件 で 行 っ た.あ らか じ め 作 成 した 反 応 液[10×PCR反 応 緩 衝 液1μl, dNTPs(各1.25mM)混 合 溶 液1.5μ1,各20μM プ ラ イ マ ー 溶 液0.5μl, Taqポ リ メ ラー ゼ(5unit/ μl)0.05μlを 遠 心 チ ュー ブ に 入 れ 蒸 留 水 を 加 え, 総 量 を9μlに す る]に テ ン ペ レ ー トDNAを1 μl(約1ng)添 加 し,そ の 上 に 水 の蒸 発 を 防 ぐ た め に25μlのmineral oilを 加 え た. 90℃ で1 分, 55℃ で1分, 72℃ で3分 の 反 応 を30サ イ ク ル 繰 り返 し,最 後 に72℃ で3分 間 反 応 後,冷 却 し保 存 し た.尚,使 用 し た プ ラ イ マ ー(20mer) は,マ ウ スApex cDNAの 塩 基 配 列15)に 基 づ い て 作 成 し た.増 幅DNAの 有 無 は,ア ガ ロー ス ゲ ル 電 気 泳 動 で確 認 した. 5.サ ザ ン ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン20) 制 限 酵 素 消 化DNAを, 0.8%ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 で分 画,ゲ ル 内DNAを エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド溶 液(0.5μg/ml)で 染 色 後, UVト ラ ン ス イ ル ミネ ー ター 上 で 写 真 撮 影 し た.ゲ ル を 変 性 溶 液(1.5M NaClを 含 む0.5M NaOH溶 液)中 で1時 間 振 盪 し,ブ ロ ッ テ ィ ン グ 溶 液(1.2 M NaClを 含 む0.25M NaOH溶 液)を 用 い, 毛 細 管 法 で ナ イ ロ ン フ ィ ル ター(Hybond-N, Amersham社)上 に 約16時 間 か け てDNAを ブ ロ ッ テ ィ ン グ し た.約16時 間 ブ ロ ッ テ ィ ン グ を行 っ た 後,フ ィ ル タ ー を2×SSC溶 液 で 洗 浄 し,風 乾 後 プ ラ ー クハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン と 同 様 の 条 件 で ハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョン を行 っ た. 6.塩 基 配 列 お よ びCpG islandの 決 定 組 換 え プ ラ ス ミ ド(pMAPEX9-1)中 の マ ウ スApex遺 伝 子 の 塩 基 配 列 は,シ ー ケ ナ ー ゼ を用 い, dideoxy chain termination法 に よ り 決 め た20,22).尚,シ ー ケ ン シ ン グ反 応 に 用 い た オ リゴ ヌ ク レ チ ドプ ラ イ マ ー(20mer)は,前 も っ て 決 定 さ れ た 塩 基 配 列 に 基 づ い て 逐 次 的 に 合 成 し て 用 い た.二 本 鎖 の 両 鎖 に つ い て 塩 基 配 列 を 決 定 し た.哺 乳 類housekeeping遺 伝 子 の 転 写 調 節 部 位 と推 定 さ れ て い るCpG islandの 決 定 は, Gardiner-GardenとFrommerの 方 法23) に 従 い, NECパ ー ソナ ル コ ン ピ ュ ー ターPC9801 を用 い て 図2に 示 し た プ ロ グ ラ ム で 計 算,図 式 化 した.
図2 "CpG island"領 域 の 計 算 プ ロ グ ラ ム Nは シー クエ ン ス に よ り決 定 し た 総 塩 基 数, Mは100と す る. 結 果 1.マ ウ ス の ゲ ノ ムDNAの サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョン に よ る 解 析 マ ウ ス ゲ ノ ムDNAを,制 限 酵 素 で 消 化 し, サ ザ ン トラ ン ス フ ァ ー し た結 果 を 図3に 示 す. プ ラ ス ミ ドpExE 215)か ら マ ウ スAPEXヌ ク レ ア ー ゼ のcDNA (Apex cDNA)断 片(1kb)
を制 限 酵 素EcoR IとPst Iで 切 り 出 し,精 製 後,ニ ッ ク トラ ン ス レー シ ョ ン で32P標 識 して 検 出 プ ロ ー ブ と し た. Apex cDNAに 切 断 サ イ ト を もた な い制 限 酵 素BamH Iで 消 化 し た場 合4 kb, Bgl IIで 消 化 した 場 合 は15kbのDNA断 片 が1個 検 出 さ れ た. Apex cDNA中 に 一 箇 所 切
断 部 位 を持 つ 制 限 酵 素Apa Iで ゲ ノムDNAを 消 化 す る と, 5.0kbと2.3kbの2個 のDNA断 片
図3 マ ウ ス ゲ ノ ムDNAの サ ザ ン ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン
マ ウ ス ゲ ノ ムDNAは,制 限 酵 素Apa I(レ ー ン1), BamH I(レ ー ン2)お よ びBgl II(レ ー ン3) で 消 化 し た.使 用 し た プ ロ ー ブ お よ び ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 条 件 は 材 料 と 方 法 の 所 で 記 述 し た. が 検 出 さ れ,こ の 結 果 はApex遺 伝 子 が 単 一 遺 伝 子 で あ る こ と を 示 唆 し た. 2.マ ウ スApex遺 伝 子 の 単 離 マ ウ ス 白血 球 由 来 の ゲ ノムDNAラ イ ブ ラ リ ー か ら,マ ウ スApex cDNAを プ ロ ー ブ と して, Apex遺 伝 子 を有 す る フ ァー ジ ク ロー ン を単 離 し た.一 次 の プ ラ ー クハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョ ン で, 1.5×106個 の フ ァ ー ジ ク ロ ー ン か ら20個 の 陽 性 ク ロ ー ンが 検 出 さ れ た.こ れ ら の ク ロ ー ン か ら,確 実 な 陽 性 ク ロー ン と して10ク ロ ー ン を最 終 的 に 純 化,単 離 し た.こ れ らの 単 離 ク ロー ン か らPCR法 で,マ ウ ス のApex cDNA全 領 域 を 有 す る遺 伝 子 ク ロ ー ン を選 択 し た. Apex cDNA遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を参 考 に して合 成 し た 5'端 と3'端 の プ ラ イ マ ー を 用 い,単 離 した フ ァ ー ジ クロー ンのDNAを 鋳 型 と してApex cDNA
の ア ミノ 酸 コ ー ド領 域 に 対 応 す るDNAの 増 幅 を 試 み た(図4).そ の 結 果, 4つ の 陽 性 ク ロ ー ン で,同 一 増 幅 結 果 が 得 られ た.他 の6ク ロ ー ン は い ず れ も こ の プ ラ イ マ ー で 遺 伝 子 増 幅 が 観 察 さ れ ず,い ず れ もApex遺 伝 子 の 一 部 分 か ら な る遺 伝 子 断 片 が 挿 入 さ れ て い る と考 え られ た. DNA増 幅 が 認 め ら れ た ク ロー ン で,翻 訳 領 域 両 端 の プ ラ イ マ ー を用 い た 場 合, 1.9kbのDNAが 増 幅 さ れ た.同 一 プ ラ イ マ ー を 用 い てApex cDNAを 増 幅 させ る と1.1kbのDNAが 増 幅 さ れ る こ と よ り,こ の プ ラ イ マ ー 間 に 約0.8kbの イ ン トロ ン が 介 在 す る と推 定 さ れ た.さ らにcDNA 内 部 の プ ラ イ マ ー を用 い てPCR(反 応1∼4) を行 っ た 結 果,図4の プ ラ イ マ ーaとbの 間 に約0.2kb,プ ラ イ マ ーbとcの 間 に 約0.5kb, プ ラ イ マ ーcとdの 間 に 約0.1kaの イ ン トロ ン の 挿 入 が 予 測 さ れ た.そ こ でApex全 領 域 を有 す る と推 定 され る4種 の フ ァー ジ クロー ンのDNA を 単 離 し, EMBL-3 SP6/T7フ ァ ー ジベ ク タ ー のmultiple cloning site (MCS)に 制 限 酵 素 部 位 が あ るXho Iで 消 化 し た 結 果,こ れ ら の ク
ロ ー ン の 挿 入DNAは い ず れ も内 部 にXho I切 断 部 位 を も た ず,そ れ ぞ れ15, 18, 16, 15kbの DNA断 片 が 挿 入 さ れ て い る こ とが 確 認 され た. こ れ ら の ク ロー ン の 挿 入DNAは,各 種 の 制 限 酵 素 に よ るDNAの 消 化 パ ター ンが ほ ぼ 同 一 で, これ ら が 類 似 の ク ロー ン で あ る こ とが 示 唆 さ れ た. Apex cDNAの 制 限 酵 素 部 位 との 比 較 に よ
図4 Apex遺 伝 子 の 全 ア ミノ 酸 コ ー ド領 域 を 含 む フ ァ ー ジ ク ロ ー ン の 選 択
A: pUC18プ ラ ス ミ ドを ベ ク ター と して 作 成 さ れ た 組 換 え プ ラ ス ミ ドpExE2に 挿 入 さ れ て い る マ ウ ス Apex cDNA.黒 塗 の 太 い 部 分 は ア ミ ノ 酸 コ ー ド領 域 を 示 し た.こ の 遺 伝 子 中 の 制 限 酵 素 部 位 は 以 下 の 様 に 略 記 し た. (E), EcoR Iリ ン カ ー; A, Apa I; Ec, EcoRV; Bc, Bcl I; N, Nar I; P, Pst I. 横 向 きの 矢 印 は 遺 伝 子 の 増 幅 に 使 用 し た 合 成 プ ラ イ マ ー(20mer)の 作 成 位 置 お よ び 方 向 を 示 し,各 プ ラ イ マ ー は ア ル フ ァ ベ ッ トで 表 示 し た.aは5'端, fは3'端 の 非 翻 訳 領 域 の プ ラ イ マ ー で あ る. a: 5'TTGGGAGGCAGCGCAGTAAA3', b: 5'GCAGATTTGCCACTGGGTGA3', c: 5'CTTGCAGTTCAGCCGGGAGT3', d: 5'AGTCCTTTAGAAACTTTCGG3', e: 5'GGGCATTCATCATGTAAGTC3', f: 5'TCTCTTGGATTGTCTAAAGG3' B:全 ア ミ ノ 酸 領 域 を 含 む フ ァー ジ ク ロ ー ン のPCR法 に よ る 検 出 例 鋳 型DNAは,単 離 し たApex 遺 伝 子 フ ァ ー ジ ク ロ ー ン を使 用 し た.写 真 は,下 記 反 応1-4で 増 幅 さ れ たDNAの 電 気 泳 動 像 を示 し た. 反 応1:レ ー ン1(プ ラ イ マ ー セ ッ ト, aとb),反 応2:レ ー ン2(プ ラ イ マ ー セ ッ ト, aとc),反 応3:レ ー ン3(プ ラ イ マ ー セ ッ ト, aとd),反 応4:レ ー ン4(プ ラ イ マ ー セ ッ ト, aとe),お よ び 反 応5:レ ー ン5(プ ラ イ マ ー セ ッ ト, aとf) り, 4種 の ク ロー ン はApex遺 伝 子 全 体 が 挿 入 さ れ た 組 換 えDNAと 推 定 さ れ た.そ こ で こ れ ら の ク ロー ン よ り一 つ(15kbの 挿 入DNA断 片 を もつ も の)を 選 択 し,以 下 の 実 験 に用 い た. こ の フ ァー ジ ク ロー ン の 挿 入DNA断 片 を制 限 酵 素Xho Iで 切 り出 し,そ れ をpBluescript KS-プ ラ ス ミ ドのMCSのXho I部 位 に 組 込 み,組 換 え プ ラ ス ミ ドpMAPEX9を 得 た(図1).さ
ら に そ のBamH I消 化DNA断 片 を, pBlue scriptのBamH I部 位 に サ ブ クロ ー ニ ング して, 組 換 え プ ラ ス ミ ドpMAPEX9-1を 作 製 した. Apex cDNAとBamH I消 化 で 生 じ る4kbの
DNA断 片 の 制 限 酵 素 地 図 やPCR増 幅 実 験 の 結 果 等 か ら,こ の4kbのDNA断 片 は,マ ウ ス Apex遺 伝 子 の ア ミ ノ酸 コー ド領 域 よ り上 流(5' 側)1.5kbと,下 流(3'側)0.5kbを 含 ん で い る こ とが 確 認 さ れ た(図4お よ び 図5).ま た こ の 結 果 は,ア ミ ノ酸 コー ド領 域 の 半 分 よ りN末 端 側 に,少 な く と も3つ の イ ン トロ ン(総 計0.8kb) が 存 在 し,こ の3'側 か ら 二 番 目の イ ン トロ ン 中 に 制 限 酵 素Xba Iお よ びPst I切 断 部 位 が 存 在 す る こ と も示 唆 さ れ た(図5). 3.マ ウ スApex遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 決 定 ク ロ ー ニ ン グ した ゲ ノ ムDNA断 片(4kb) の シー ケ ン シ ン グ はdideoxy法 で行 っ た.図1 に 示 し たpMAPEX9-1プ ラ ス ミ ドDNAを 用 い, pBluescriptKS-のT7お よ びT3プ ラ イ マ ー(17mer)を 使 用 し て 挿 入 断 片 の5'端 お よ び3'端 よ りsequencingを 始 め,必 要 な プ ラ イ マ ー は 合 成 し て 逐 次 的 に 両 鎖 の 塩 基 配 列 を 決
図5 Apex遺 伝 子 の 構 造
Aは マ ウ スApex cDNAを 示 し た. aはAPEXヌ ク レ ア ー ゼ の 核 移 行 ドメ イ ン, bは 触 媒 ドメ イ ン を 表 す.ま たAAAは ポ リA領 域 を 示 す.
Bは マ ウ スApex遺 伝 子 の エ キ ソ ン,イ ン トロ ン 構 造 を示 し た.太 い 白 及 び 黒 の 実 線 は エ キ ソ ン 構 造 を 示 し,黒 塗 り は ア ミ ノ 酸 の コ ー ド領 域,白 枠 部 分 は ア ミ ノ 酸 非 コ ー ド領 域 を,点 線 枠 部 分 は エ キ ソ ンIの 推 定 領 域 を 示 し た. Apex遺 伝 子 の 各 エ キ ソ ン は5'側 か らI, II, III, IV, Vと 番 号 を 付 け 表 示 し た. Nt, Not I; N, Nar I; P, Pst I: A, Apa I: Ec, EcoR V; Bc, Bcl I: E, EcoR I: B, BamH
I 定 し た.塩 基 配 列 よ り,上 記 の3つ の イ ン ト ロ ン の 上 流 に 更 に1つ の イ ン トロ ン の 存 在 が 示 さ れ た. 4.マ ウ スApex遺 伝 子 の 遺 伝 子 構 造 マ ウ スApex遺 伝 子 の 塩 基 配 列 と既 に 報 告 さ れ て い る マ ウ スApex cDNAの 塩 基 配 列15)を比 較 す る こ とに よ り,マ ウ スApex遺 伝 子 の イ ン トロ ン/エ キ ソ ン接 合 部 位 の 構 造 を 決 定 した. ア ミ ノ酸 の 開 始 コ ドン(ATG)よ り上 流 に 存 在 す る エ キ ソ ン の 開 始 部 位 は 決 定 し て い な い が, 最 近 報 告 さ れ た ヒ トAPEX遺 伝 子 の 構 造 か ら 類 推 す る と,本 遺 伝 子 は ヒ トの 場 合 と 同 様 に5 つ の エ キ ソ ン, 4つ の イ ン トロ ン に よ り構 成 さ れ て い る と推 定 され る.ま た,マ ウ スAPEXヌ ク レ ア ー ゼ を コー ドし て い る エ キ ソ ン部 位 の 塩 基 配 列 は,既 に 報 告 さ れ て い る マ ウ スApex cDNAの 塩 基 配 列15)と 完 全 に 一 致 し た.実 験 的 に 決 め た 制 限 酵 素 部 位 と塩 基 配 列 か ら 推 定 さ れ る制 限 酵 素 部 位 も一 致 し た(図5).図6は,本 実 験 で 明 ら か に し た エ キ ソ ンI∼Vの 位 置 を, 既 に 報 告 さ れ て い るマ ウ スApex cDNA上 に 区 画 して 示 して い る.マ ウ スApex遺 伝 子 の 構 造 を図5に,各 エ キ ソ ン と イ ン トロ ン の サ イ ズ お よ び 各 イ ン トロ ン/エ キ ソ ン接 合 部 位 周 辺 の 塩 基 配 列 を表1に 示 す. マ ウ スApex遺 伝 子 に お い て も,エ キ ソ ン と イ ン ト ロ ン の 境 界 は 全 てGT-AG則24)に 従 って い た .エ キ ソ ンIは, 5'側 の ア ミ ノ酸 非 コー ド 領 域 に あ り,翻 訳 開 始 コ ドンATGは エ キ ソ ン IIに,終 止 コ ドンTGAは エ キ ソ ンVに 存 在 し た.図6に 示 す 様 に 成 熟 酵 素 で はN末 端 の メ チ オ ニ ン は 除 か れ るが15),こ の ア ミノ酸 を含 め て 各 エ キ ソ ン に 含 ま れ る ア ミ ノ酸 の コー ド領 域 の 塩 基 の 全 ア ミノ 酸 コー ド領 域 に 対 す る 割 合 は エ キ ソ ンII, III, IVお よ びVで,そ れ ぞれ5.9%, 19.7% 20.4%お よ び54.1%で あ り,こ の 酵 素 を構 成 す
るア ミ ノ酸 の 約 半 分 は エ キ ソ ンVに コー ドさ れ て い る. E. coliエ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIII, Strepta coccus pneumoniaeのExo Aタ ン パ ク質
等10, 25, 26)と一 次 構 造 で 相 同 性 を 示 す マ ウ ス APEXヌ ク レ ア ー ゼ タ ン パ ク 質 の29kDa C末 触 媒 ドメ イ ン15)は単 一 の エ キ ソ ン に含 まれ るの で は な く,エ キ ソ ンIII, IVそ してVに 分 散 して い た. 5.マ ウ スApex遺 伝 子 の5'お よ び3'非 コ ー ド領 域 の 構 造 転 写 開 始 部 位 を決 定 し て い な い の で,プ ロ モ ー ター 領 域 を塩 基 配 列 上 か ら検 討 す る の は 難 し い が,最 近 報 告 さ れ た ヒ トAPEX遺 伝 子 の プ ロ モ ー ター 領 域 の 構 造27)と比 較 して も,特 徴 的 な TATAボ ッ ク ス やCAATボ ッ ク ス は認 め られ な か っ た.こ れ に 引 き換 え,本 遺 伝 子 の 上 流 領
図6 マ ウ スApex cDNAの 塩 基 配 列 とエ キソ ン構 造 名 エ キ ソン を実 線 で 囲 み,図5の エ キ ソ ンの番 号 を表示 した.▼ は成 熟APEXヌ クレ アー ゼ のN末 端 を 示 す. 表1 マ ウスApex遺 伝 子 の イ ン トロ ン/エ キ ソ ン接 合 部位 の塩 基 配 列 イ ン トロ ン,エ キ ソン部 分 の塩 基 配列 は それ ぞ れ小 文 字 と大文 字 で 区別 して 表 示 した. ()内 は そ れ ぞ れ の塩 基 数(bp)を 表 す.
域 に は, G+C含 量 が 高 くCpGジ ヌ ク レ オ チ ド が 高 頻 度 に 出 現 す る領 域 が 認 め られ た.そ こ で, housekeeping遺 伝 子 に 於 て 遺 伝 子 の 発 現 調 節 に 関 与 す る こ とが 示 唆 さ れ て い るCpG islands を, Gardiner-GardenとFrommerの 式23)に当 て は め て 検 索 した.検 索 に は 図2の よ うに, % (G+C)とCpG出 現 頻 度 計 算 式 を コ ン ピ ュ ー タ ー プ ロ グ ラ ム 化 し て 算 出 し た.マ ウ スApex 遺 伝 子 に つ い て, %(G+C)とCpG出 現 頻 度 を計 算 した結 果 を 図7に 示 す. Gardiner-Garden とFrommerの 式 と基 準 に よ る と,イ ン トロ ン IIか ら上 流 約0.8kbの 間 がCpG islandの 基 準 に 当 て は ま る.こ の 中 にG/Cボ ッ ク ス(GGGCGG) の 存 在 も確 認 さ れ た. APEXヌ ク レ ア ー ゼ は, マ ウ ス,ラ ッ ト,ヒ ト等 で 調 べ た全 て の 細 胞 に お い て 発 現 して お り15, 16),機能 上 か ら も細 胞 に と っ て 必 須 の 酵 素 と考 え られ る.従 っ て,本 遺 伝 子 はhousekeeping遺 伝 子 に 属 し,こ の5' CpG islandが 本 酵 素 転 写 調 節 に 重 要 な役 割 を演 じ て い る こ とが 示 唆 さ れ る. 3'側 で は,翻 訳 停 止 コ ドンTGAの146bp下 流 に ポ リア デ ニ ル 化 シ グ ナ ル(AATAAA)が 存 在 す る. 3' CpG island は 認 め ら れ な か っ た. 考 察 本 研 究 で は,哺 乳 類 細 胞 の 主 要 なAPエ ン ド ヌ ク レ アー ゼ で あ るAPEXヌ ク レア ー ゼ の マ ウ ス遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ と そ の 遺 伝 子 構 造 に つ い て 報 告 し た.本 酵 素 は, E. coliの エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIIIと 同 様 に, 5' APエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ 活 性, DNA 3'修 復 ジ エ ス テ ラー ゼ 活 性 等 を 示 す 多機 能DNA修 復 酵 素 で,本 酵 素 の 一 次 構 造 もエ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIIIの そ れ と有 意 の ホ モ ロ ジー を示 し,エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIIIの 哺 乳 類 ホ モ ロー グ で あ る こ とが 明 らか に さ れ て い る15).
ま た,エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIIIを 欠 くE, coli株 で 本 遺 伝 子 を発 現 さ せ る と, APサ イ ト を生 じ る よ うなDNA損 傷 剤 や3'ブ ロ ッ クー 本 鎖 切 断 を 生 じ る よ う なDNA損 傷 剤 に 対 す る抵 抗 性 を 増 し,生 細 胞 内 で もエ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIIIに相 補 し う る こ とが 示 され て い る15).関 ら28)が活 性 プ ロ ッ テ ィ ン グ法 で 検 討 した結 果 に よ る と, APEX ヌ ク レ ア ー ゼ は,哺 乳 類 細 胞 の 全5' APエ ン ド ヌ ク レア ー ゼ 活 性 の90%以 上 を 占め て い る と推 定 さ れ て い る.本 酵 素 は,酵 素 機 能 か らす る と 細 胞 に と っ て 極 め て 重 要 なDNA修 復 酵 素 と推 定 され るが,本 酵 素 の 哺 乳 類 細 胞 内 で の役 割 は 図7 マ ウ スApex遺 伝 子 と5'上 流 領 域 のCpG island領 域 図 はGardiner-GardenとFrommerの 方 法 に 従 っ て 計 算 し,図 式 化 し た.実 線 はObs/Exp CpG値, 点 線 は% G+C値.実 線 と 点 線 の 水 平 直 線 は,そ れ ぞ れ のCpG island境 界 値(0.6お よ び50%)を 示 す.図 の 下 部 にApex遺 伝 子 の イ ン トロ ン/エ キ ソ ン構 造 と 図 の 上 部 にCpG islandを 表 示 し た(表 示 法 は 図5と 同 様).
酵 素 活 性 とE. coliの エ キ ソ ヌ ク レア ー ゼIIIを相 補 し う る こ と か ら推 察 され て い る に 過 ぎ な い. E. coliで は, APエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ と して, エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼIIIの他 に エ ン ドヌ ク レ ア ー ゼIVや エ ン ドヌ ク レア ー ゼIII等1,29)が知 られ て い る.哺 乳 類 細 胞 で も,酵 素 レベ ル で は,多 種 類 あ る と報 告 さ れ て い る が1), cDNAが ク ロー ニ ン グ さ れ て い るの は,緒 言 の 項 で 述 べ た よ うに, 3つ の グ ル ー プ か ら独 立 に 報 告 され た 本 酵 素 の み で あ る.本 酵 素 の 遺 伝 子 名 は,報 告 者 に よ っ てHAP130,31), APEX15,16,27), APE17,32), Ref
133)等 ま ち ま ち な名 称 が使 用 され て い る が,最 近 のScience誌34)に よ る と,本 報 告 の 様 に マ ウ ス の 遺 伝 子 をApex,ヒ トの 遺 伝 子 をAPEXと して 報 告 さ れ て い る. 本 酵 素 ヒ ト遺 伝 子 は す で に, Zhaoら(HAP 1)26), Robsonら(HAP1)27), Harrisonら (APE)32),秋 山 ら(APEX)27)に よ っ て 報 告 さ れ て お り, 5つ の エ キ ソ ン か ら構 成 さ れ,染 色 体14q11.2-12に 局 在 し て い る こ とが 示 さ れ て い る.秋 山 ら27)はさ らに プ ロ モー ター 領 域 の 解 析 も行 っ て い る.に も拘 らず,著 者 が マ ウ ス の 遺 伝 子 の ク ロー ニ ン グ を行 っ た の は,生 細 胞 に お け る遺 伝 子 機 能 を明 らか に す る上 で,ジ ー ン タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ法 に よ り,遺 伝 子 破 壊 マ ウ スや 変 異 遺 伝 子 導 入 マ ウ ス を 作 成 し て 遺 伝 子 機 能 を 調 べ る方 法 が 可 能 に な る と考 え た か らで あ る. 数 種 のAPエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ の 相 互 関 係,他 の 修 復 系,複 製 系,転 写 系 等 との 相 互 関 係 等 を 明 らか に す る に は,こ の 様 なin vivo系 が 是 非 必 要 と思 わ れ る. マ ウ ス のApex遺 伝 子 も ヒ トAPEX遺 伝 子 同 様,比 較 的compactな 遺 伝 子 で, 5つ の エ キ ソ ン か ら構 成 され て お り, 5'上 流 領 域 にCpG islandが 認 め られ た.基 本 的 に は,ヒ ト遣 伝 子 と 同様 な構 造 で あ っ た が,特 に イ ン トロ ン の 塩 基 配 列 や イ ン トロ ンIIIサイ ズ(マ ウ ス が106bp短 い)に 顕 著 な違 い が 認 め ら れ た . CpG islandは, 他 のhousekeeping遺 伝 子 の 場 合 と 同様 に,転 写 調 節 に 関 与 して い る と推 定 され た.最 近,秋 山 ら27)はヒ トAPEX遺 伝 子 で5' CpG islandの 比 較 的 短 い 領 域 に プ ロ モ ー タ ー 活 性 が あ る こ と を証 明 し て い る.ま た 数 種 の 転 写 調 節 因 子 認 識 塩 基 配 列 の 存 在 を 指 摘 して い る.マ ウ スApex 遺 伝 子 につ い て は,転 写 開 始 点 の 決 定 が 出 来 て い な い が, Apex mRNAが 約1.5kbで あ り15), エ キ ソ ンII以 下 の 大 き さが 約12kb+polyAで あ る こ とか ら,エ キ ソ ンIの 大 き さ は 約0.2kbと 推 定 され た. マ ウ スApex遺 伝 子 に 関 す る本 研 究 は,生 細 胞 に お け る 本 酵 素 の 機 能 を 明 らか に す る上 で, ま た 本 酵 素 異 常 に 基 づ く病 態 に つ い て の 研 究 に 役 立 つ こ とが 期 待 され る. 結 論 1. APエ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ, DNA 3'修 復 ジ エ ス テ ラ ー ゼ, 3'→5'エ キ ソ ヌ ク レアー ゼ, DNA 3'ホ ス フ ァ ター ゼ 等 の 活 性 を示 す 多 機 能DNA 修 復 酵 素(APEXヌ クレ アーゼ)の 遣 伝 子(Apex) を,マ ウ ス 白血 球 由 来 ゲ ノ ムDNAラ イ ブ ラ リ ー よ り,マ ウ スApex cDNAを プ ロ ー ブ と し て ク ロ ー ニ ン グ し,制 限 酵 素 地 図 を作 成 し た. 2. Apex遺 伝 子 を 含 む 約4kbの 塩 基 配 列 を 決 め,遺 伝 子 構 造 を 検 討 し た. Apex遺 伝 子 は, 比 較 的compactな 約2.6kbの 遺 伝 子 で, Apex cDNAの 塩 基 配 列 と の 比 較 か ら, 5つ の エ キ ソ ン で構 成 さ れ て い る と推 定 され た.エ キ ソ ンー イ ン トロ ン接 合 部 位 はGT/AG規 則 に 従 っ て い た.翻 訳 開 始 コ ドンATGは エ キ ソ ンIIに,終 止 コ ドンTGAは エ キ ソ ンVに 局 在 した. 3.イ ン トロ ンIIか ら上 流0.8kbの 範 囲 は, G+ C含 量 が 高 くCpGジ ヌ ク レ オ チ ドが 高 頻 度 に 出 現 す る領 域 で, housekeeping遺 伝 子 に し ば し ば 認 め ら れ る"CpG island"と 考 え られ た. こ の領 域 に,プ ロ モ ー ター 領 域,転 写 開 始 点 等 が 局 在 す る こ とが 示 唆 され た. 本 研 究 の 遂行 お よび論 文 の 作 成 に あ た り始 終,御 指 導 と御 校 閲 を賜 わ りま した恩 師,関 周 司教 授 に 深 く感 謝 致 し ます.ま た 貴重 なプ ラス ミ ドpBlue script KS-を 贈 与 下 さ い ま した 同研 究 室 の 筒井 研 助教 授 に深 謝 い た し ます と共 に, CpG islandの 計 算 プ ログ ラ ム作 成 に 御協 力 くだ さ い ま した 岡 山理科 大 学 情報 セ ンター の尾 高 好政 助 教 授 ならびに実 験遂 行, 論 文 作 成 に あ た り始 終快 く御 協 力頂 き ま した秋 山公 祐 助 手お よび教 室 の皆 様 に 心か らお礼 申 し上 げ ます.
文
献
1) Friedberg EC: DNA repair. W. H. Freeman and Company, New York
(1985).
2) Lindahl T: DNA repair enzymes. Annu Rev Biochem (1982) 51, 61-87.
3) Lindahl T: Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature
(1993) 362, 709-715.
4) Teoule R: Radiation-induced
DNA damage and its repair. Int J Radiat Biol (1987) 51, 573-589.
5) Gilon L, Takeshita
M, Johnson F, Iden C and Grollman AP: Bleomycin-induced
strand-scission
of
DNA, mechanism of deoxyribose cleavage. J Biol Chem (1981) 256, 8608-8615.
6) Muragesan N, Xu C, Ehrenfeld GM, Sugiyama H, kilkuskie RE, Rodriguez LO, Chang L-H and Hecht
SM: Analysis of products formed during Bleomycin-mediated
DNA degradation.
Biochemistry
(1985) 24, 5735-5744.
7) Burger RM, Projan SJ, Horwitz SB and Peisach J: The DNA cleavage
mechanism
of lron
- Bleomycin, kinetic resolution of strand scission from base propenal release. J Biol Chem (1986) 261,
15955-15959.
8) Loeb LA and Preston BD: Mutagenesis by apuriinic/apyrimidinic
sites. Annu Rev Genet (1986) 20,
201-230.
9) Weiss B and Grossman L: Phosphodiesterases
involved in DNA repair. Adv Enzymol Relat Areas
Mol Biol (1987) 60, 1-34.
10) Saporito SM, Smith-white BJ and Cunningham RP: Nucleotide sequence of xth gene of Escherichia
coli K-12. J Bacteriol
(1988) 170, 4542-4547.
11) Saporito SM and Cunningham RP: Nucleotide sequence of the nfo gene of Escherichia coli K-12. J
Bacteriol
(1988) 170, 5141-5145.
12) 関 周 司,秋 山 公 祐:ク ロー ニ ン グ さ れ た 哺 乳 類 の 遺 伝 子 修 復 酵 素-APエ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ を 中 心 に-. 生 化 学(1993) 65, 1165-1170.
13) Robson CN, Milne AM, Pappin DJC and Hickson ID: Isolation of cDNA clones encoding an enzyme
from bovine cells that repairs oxidative
DNA damage in vitro: homology with bacterial
repair
enzymes. Nucleic Acids Res (1991) 19, 1087-1092.
14) Robson CN and Hickson ID: Isolation of cDNA clones encoding a human apurinic/apyrimidinic
endonuclease that corrects DNA repair and mutagenesis
defects in E. coli xth (exonuclease
III)
mutants. Nucleic Acids Res (1991) 19, 5519-5523.
15) Seki S, Akiyama K, Watanabe S, Hatsushika
M, Ikeda S and Tsutsui K: cDNA and deduced amino
acid sequence of a mouse DNA repair enzyme (APEX nuclease)
with significant
homology to
Escherichia coli exonucleane III. J Biol Chem (1991) 266, 20797-20802.
16) Seki S, Hatsushika
M, Watanabe S, Akiyama K, Nagao K and Tsutsui K: cDNA cloning, sequenc
ing, expression and possible domain structure of human APEX nuclease homologous to Escherichia
coli exonuclease III. Biochim Biophys Acta (1992) 1131, 287-299.
17) Demple B, Herman T and Chen DS: Cloning and expression of APE, the cDNA encoding the major
human apurinic endonuclease:
Definition of a family of DNA repair enzymes. Proc Natl Acad Soci
USA (1991) 88, 11450-11454.
18) Seki S, Ikeda S, Watanabe S, Hatsushika
M, Tsutsui K, Akiyama K and Zhang B: A mouse DNA
repair enzyme (APEX nuclease)
having exonuclease and apurinic/apyrimidinic
endonuclease activ
19) Shows TB, McAlopine PJ, Boucheix C, Collins FS, Conneally PM, Frezal J, Gershowitz H, Goodfel
low PN, Hall JG, Issitt P, Jones CA, Knowies BB, Lewis M, Mckusick VA, Meisler M, Morton NE,
Rubinstein P, Schanfield MS, Schmickel RD, Skolnick MH, Spence MA, Sutherland GR, Traver M,
Van Cong N and Willard HF: Guidelines for human gene nomenclature. Cytogenet Cell Genet (1987)
46, 11-28.
20) Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T: Molecular cloning, a laboratory manual
(2nd edition)
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989).
21) Innis MA, Gelfand DH, Sninskey JJ and White TJ: PCR protocols, A guide to method and applica
tions. White TJ ed, Academic Press Inc, San Diego, California
(1990).
22) 中 村 崇 規,水 之 江 義 充,安 川 洋 生,前 川 宣 彦:修 飾T7 DNAポ リ メ ラ ー ゼ(シ ー ケ ネ ー ス)に よ るDNA 塩 基 配 列 決 定 法.細 胞 工 学(1988) 7, 712-722.
23) Gardiner-Garden
M and Frommer M: CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol (1987) 196,
261-282.
24) Mount SM: A catalogue of splice junction sequences. Nucleic Acid Res (1982) 10, 459-472.
25) Puyet A, Greengerg B and Lacks SA: The exoA gene of Streptococcus pneumoniae and its product,
a DNA exonuclease with apurinic endonuclease activity. J Bacteriol (1989) 171, 2278-2286.
26) Clement JE, Rogers SG and Weiss B: A DNase for apurinic/apyrimidinic
sites associated with
exonuclease III of Haemophilus innfluenzae. J Biol Chem (1978) 253, 2990-2999.
27) Akiyama K, Seki S, Oshida T and Yoshida MC: Structure, promoter analysis and chromoromal
assignment of the human APEX gene. Biochim Biophys Acta (1994) in press.
28) Ikeda S, Seki S, Watanabe
S, Hatsushika
M and Tsutsui K: Detection of possible DNA repair
enzymes on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
gels by protein blotting to damaged DNA-fixed
membrans. Anal Biochem (1991) 192, 96-103.
29) Kornberg A and Baker TA: DNA replication,
2nd Ed, W. H. Freeman and Company, New York
(1992) pp 403-437.
30) Zhao B, Grandy DK, Hagerup JM, Magenis RE, Smith L, Chuhan BC and Henner WD: The human
gene for apurinic/apyrimidinic
endonuclease
(HAP 1): sequence and localization to chromosome
14 band q12. Nucleic Acids Res (1992) 20, 4097-4098.
31) Robson CN, Hochhauser D, Craig R, Rack K, Buckle VJ and Hickson ID: Structure of the human
DNA repair gene HAP 1 and its localisation to chromosome 14q 11.2-12.
Nucleic Acids Res
(1992) 20, 4417-4421.
32) Harrison L, Ascione G, Menninger JC, Ward DC and Demple B: Human apurinic endonuclease gene
(APE):
structure and genomic mapping (chromosome 14q 11.2-12).
Human Mol Genet (1992)
1, 677-680.
33) Xanthoudakis
S Miao G, Wang F, Pan Y-CE and Curran T: Redox activation
of Fos-Jun DNA
binding activity is mediated by a DNA repair enzyme. EMBO J (1992) 11, 3323-3335.
34) Copeland NG, Jenkins NA, Gilbert DJ, Eppig JT, Maltais EL, Miller JC, Dietrich WF, Weaver DA,
Lincoln SE, Steen RG, Stein LD, Nadeau JH and Lander ES: A genetic linkage map of the mouse:
Cloning and structural
analysis of mouse Apex gene encoding
the major apurinic/apyrimidinic
endonuclease
Kazutaka
NAGAO
Department
of Molecular
Biology,
Institute
of Cellular
and Molecular
Biology,
Okayama
University
Medical
School,
Okayama
700, Japan
(Director:
Prof. S. Seki)
The APEX nuclease is a mammalian multifunctional repair enzyme having 5•L apurinic/ apyrimidinic (AP) endonuclease, DNA 3•L repair diesterase, 3•L-5•L exonuclease and DNA 3•L phosphatase activities. The mouse Apex gene for the enzyme, was isolated from a mouse leukocyte genomic library by plaque hybridization with the mouse Apex cDNA as a probe. The nucleotide sequence of the Apex gene and its 5•L-and 3•L-flanking regions were determined. With reference to the published Apex cDNA sequence, the mouse Apex gene can be divided into five exons and four introns with a total length of about 2.6kb. The boundaries between exon and intron follow the GT/AG rule. The translation initiation and termination sites are located in exons II and V, respectively. A part of the 5•L flanking region belongs to a CpG island, which extends to intron II. The CpG island is thought to be a putative transcription regulatory region of the Apex gene, a housekeeping gene.
