Database Center for Life Science Online Service

Review

アクチビンシグナ リングと

腎臓の形態形成 ・再生

小島

至 ・前嶋明人

ア クチ ビ ン シグ ナ リ ン グ が 抑 制 さ れ た トラ ンス ジ ェニ ック マ ウス の 腎臓 で は,糸 球 体 数 が 増 加 して い た.そ の 原 因 は ア ク チ ビ ン が オ-ト ク リン 因 子 と して 尿 細 管 の 分 枝 を 負 に 調 節 して い る た め と 考 え られ た.尿 細 管 形 成 ・分 枝 を促 進 す るHGFは,オ ー トク リン 因 子 ア ク チ ビ ンAの 産 生 を抑 制 す る こ と に よ って そ の 作 用 を 発 揮 す る.ア ク チ ビ ンAは また 尿 細 管 の 再 生 時 に発 現 が増 加 し,再 生 を抑 制 して い る, ア クチ ビン フ ォ リス タチン 尿細管 形態 形成 は じめ に TGF-β ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー に 属 す る ア ク チ ビ ン は TGF-β やBMP(bone morphogenetic protein)な ど の 他 の メ ン バ ー と 同 様 に 増 殖 抑 制 作 用,分 化 誘 導 作 用 を も つ.ア ク チ ビ ン は 中 胚 葉 誘 導 を は じ め と し て,多 彩 な 分 化 誘 導 作 用 を 発 揮 し,さ ま ざ ま な 臓 器 ・組 織 で 局 所 因 子 と し て 形 態 形 成,臓 器 形 成,さ ら に 組 織 修 復 な ど を 調 節 し て い る と 考 え ら れ て い る1).ア ク チ ビ ン はTGF-β な ど と 同 様 に2量 体 構 造 を も つ が,そ れ を 構 成 す る サ ブ ユ ニ ッ ト(β サ ブ ユ ニ ッ ト よ ば れ る)は 現 在 ま で に5種 類 が 知 ら れ て い る.哺 乳 類 に は βA,βB,βC,βEの4種 類 が 発 現 して い る.βAサ ブ ユ ニ ッ トは 中 枢 神 経,骨 髄, 血 管,消 化 管,生 殖 腺 な ど 生 体 内 の 広 範 な 臓 器 に 発 現 し て い る.一 方,13Bサ ブ ユ ニ ッ ト は 下 垂 体,卵 巣 な ど比 較 的 限 定 さ れ た 組 織 に 発 現 し て い る2).さ ら に βC,βE サ ブ ユ ニ ッ トは お お む ね 肝 臓 の み に 発 現 し て い る3).ア ク チ ビ ン は β サ ブ ユ ニ ッ トの2量 体 で あ る こ と か ら,組 織 内 に 他 種 類 の β サ ブ ユ ニ ッ トが 発 現 し て い れ ば,組 合 せ か ら 多 種 類 の ア ク チ ビ ン分 子 種 を 形 成 す る こ と が 予 想 さ れ る.実 際,卵 巣 で は ア ク チ ビ ンA(βA-βA),ア ク チ ビ ンAB(βA-βB),ア ク チ ビ ンB(βB-βB)の3種 類 の ア ク チ ビ ン 蛋 白 質 が 発 現 し て い る こ と が 確 認 さ れ て い る.ま た 肝 臓 に は βA,βB,βC,βEが 発 現 し,と く に 正 常 な 肝 臓 で は βc,βEサ ブ ユ ニ ッ ト の 発 現 量 が 多 い.こ れ ら は ア ク チ ビ ンC(βC-βC),ア ク チ ビ ンE(βE-βE)の 形 で 存 在 す る と 考 え ら れ て い る が,こ れ ら 以 外 の 組 合 せ,た と え ば ア ク チ ビ ンCE(βC-βE)な ど の 形 で 存 在 す る 可 能 性 も 十 分 に あ る.し か し そ れ ら は ま だ 確 認 さ れ て い な い.ア ク チ ビ ン の サ ブ ユ ニ ッ トの 中 で も,βA サ ブ ユ ニ ッ トは 広 範 な 臓 器 に 発 現 し て い る こ と か ら,ア ク チ ビ ンAは こ れ ら の 臓 器 に お い て 何 ら か の 機 能 を 発 揮 して い る と 予 想 さ れ る. ア ク チ ビ ン に は 特 異 的 な 結 合 蛋 白 質 フ ォ リ ス タ チ ン が 存 在 す る4).フ ォ リ ス タ チ ン は β サ ブ ユ ニ ッ トに1対1 で 結 合 す る た め,ア ク チ ビ ン1分 子 あ た り2分 子 の フ ォ リ ス タ チ ンが 結 合 す る こ と に な る.フ ォ リ ス タ チ ン に 結 合 し た ア ク チ ビ ン は 受 容 体 を 活 性 化 す る こ と が で きず 作 用 を 失 う た め,フ ォ リ ス タ チ ン は ア ク チ ビ ン の 作 用 を 抑 制 す る ア ン タ ゴ ニ ス ト と し て 機 能 す る(図1).フ ォ リ ス タ チ ン は 細 胞 外 基 質 の ヘ パ ラ ン硫 酸 に 結 合 す る 性 質 を も つ が,ア ク チ ビ ン と結 合 し た フ ォ リ ス タ チ ン は エ ン ドサ イ トー シ ス を 受 け て 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ 分 解 さ れ る5). フ ォ リ ス タ チ ン は ア ク チ ビ ン の 標 的 細 胞 に 発 現 し て い る こ と が 多 く,ま た そ の 産 生 が ア ク チ ビ ンや 他 の 因 子 に よ

Itaru Kojima,Akito Maeshima,群 馬 大 学 生 体 調 節 研 究 所E-mail:ikojima@showa.gunma-u.acjp

Regulation of morphogenesis and regeneration of the kidney by the activin signaling system

131 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.46No.2(2001) っ て 調 節 され る こ とか ら,ア ク チ ビ ン と そ の 拮 抗 蛋 白 質 フ ォ リ ス タチ ンは 互 い に影 響 しな が ら細 胞 機 能 を複 雑 に 調 節 して い る. ア ク チ ビ ンの作 用 は ア クチ ビ ン受 容 体 に よ り細 胞 内 へ 伝 達 さ れ る.ア ク チ ビ ン受 容 体 は他 のTGF-β ス ー パ ー フ ァ ミ リー の リガ ン ドと同様 に1型 お よ びH型 受 容 体 に よ り構 成 され,そ れ ぞ れ 細 胞 内 ドメ イ ン に セ リ ン/ス レ オ ニ ン キ ナ ー ゼ 活 性 を もつ キ ナ ー ゼ 型 受 容 体 で あ る6). ア クチ ビ ンがⅡ 型 受 容 体 に結 合 す る とⅠ 型 受 容 体 と複 合 体 が 形 成 さ れ,Ⅰ 型 受 容 体 が リ ン酸 化 さ れ る.こ れ に よ りⅠ型 受 容 体 の キ ナ ー ゼ 活 性 が 増 加 し,細 胞 内 の 基 質 が リ ン酸 化 さ れ細 胞 内 に シ グナ ルが 伝 達 され る.Ⅰ 型 お よ びⅡ 型 受 容 体 に は そ れ ぞ れⅠB型 とⅡB型 とい う サ ブ タ イ プ が 存 在 す る.Ⅰ 型 受 容 体 に よ り リ ン酸 化 され る細 胞 内 の 基 質 の1つ がSmadと よ ば れ る 一 群 の 蛋 白 質[→ 今 月 のKeyWords(p.103)]で あ る.Ⅰ 型 受 容 体 キ ナ ー ゼ に よ りSmad2あ る い はSmad3が リ ン酸 化 さ れ,そ れ ら はSmad4と 複 合体 を形 成 して 核 内 に入 り,標 的 遺 伝 子 の 転 写 を 活 性 化 す るη.ア ク チ ビ ンに は秒 の 単 位 で 作 用 が 発 現 す る転 写 を 介 さ ない 作 用 もあ る こ とか ら,他 の シ グ ナ ル伝 達 経 路 も存 在 す る と考 え られ る. ア クチ ビ ンのn vivoに お け る機 能 を 明 らか に す る た め に,ア ク チ ビ ンの βサ ブユ ニ ッ トを 欠 失 す る 変 異 マ ウ ス,い わ ゆ る ノ ッ ク ア ウ トマ ウ ス が 作 製 され て い る.た と え ば ア ク チ ビ ン の βAサ ブユ ニ ッ トを 欠 失 す る マ ウ ス8)は,出 生 直 後 に死 亡 す る.口 蓋 裂 や 胸 郭 の 異 常 に よ り呼 吸 が で き な い た め と 考 え ら れ て い る,ま た βBサ ブ ユ ニ ッ トの ノ ック ア ウ トマ ウ ス は,眼 瞼 の 癒 合 に 問 題 が あ り,メ ス は 不 妊 と な る9).βAサ ブ ユ ニ ッ トと βBサ ブユ ニ ッ トの ダ ブ ル ノ ッ クア ウ トマ ウ ス は,そ れ ぞ れ の 表 現 型 の 和 を示 す,一 方,Ⅱ 型 ア クチ ビ ン受 容 体 の ノ ッ ク ア ウ トマ ウ スは,下 垂 体 ゴ ナ ド トロ ピ ン分 泌 が 低 下 し 続 発 性 に性 腺 機 能 が低 下 す る10).ま たⅡB型 受 容 体 の ノ ーック ア ウ トマ ウ ス は_{,心 血 管系 に 多彩 な異 常 を 示 すll).} これ らの リガ ン ドノ ッ ク ア ウ トマ ウス,受 容 体 ノ ッ クア ウ トマ ウ ス の 表 現 型 の 異 常 は,Smadの ノ ック ア ウ トマ ウス が 胎 生 期 致死 に な る の に比 べ て あ ま りに軽 度 で あ る と思 わ れ る.そ の 理 由 と し て リガ ン ドや 受 容 体 の サ ブ タ イ プ が 複 数 あ る た め に,1つ の 遺 伝 子 を 欠 失 して も異 常 が 出 に くい 可 能 性,さ らに 母 体 か らの リガ ン ドの供 給 に よ っ て 異 常 が レス キ ュ ー さ れ る 可 能 性 な どが 考 え られ る.ア ク チ ビ ン,と く に ア ク チ ビ ンAは 生 体 内 に 広 く 発 現 し,ま た胎 生 期 に もそ の 発 現 が 認 め られ る こ と,in vivoの 系 で は さ ま ざ ま な細 胞 系 で 作 用 を示 す こ と な どか ら,こ の リガ ン ドが さ らに 多 くの 機 能 を も って い る こ と が 推 測 さ れ る. in vivoに お け る ア クチ ビ ンの 作 用 を さ らに 明 らか にす る 目的 で,筆 者 らは そ の 作 用 を ブ ロ ッ クす る ド ミナ ン ト ネ ガ テ ィ ブ型 受 容 体 を過 剰 発 現 す る トラ ンス ジ ェニ ック (TG)マ ウス を作 製 した.キ ナ ー ゼ ドメ イ ン を 欠 失 す る II型 ア クチ ビ ン受 容 体 を,β ア ク チ ン プ ロ モ ー ター に よ り全 身 に過 剰 発 現 させ た.発 現 量 が 多 い もの は不 妊 とな る ため,比 較 的 コ ピ ー 数 の 少 な いTGマ ウス の み が 継 代 可 能 で あ っ た.こ の 継 代 可 能 なTGマ ウ ス は,ア クチ ビ ン シ グ ナ ル を不 完 全 に 欠 失 す る と予 想 され るが,実 際 に 細 胞 レベ ル で の検 討 が な され た肝 臓 な ど にお い て は,ア ク チ ビ ン作 用 が 約80∼90%程 度 抑 制 さ れ て い た.こ の TGマ ウス は さ ま ざ ま な 臓 器 に形 態 学 的 な 異 常 を も っ て い たが,と くに肝 臓,膵 臓,脾 臓,腎 臓 な どの 実 質臓 器 に さ ま ざ ま な組 織 学 的 異 常 が 認 め られ た.こ れ らの 異 常 は これ まで 報 告 され て き た ノ ッ ク ア ウ トマ ウ ス で は 記 載 され て い な い もの で あ っ た.肝 臓,膵 臓,脾 臓 に 見 られ る 組 織 学 的 異 常 は,こ れ ま で 知 ら れ て い る ア クチ ビ ンの 作 用 か ら推 測 可 能 な もの で あ っ た が12,13),腎臓 に 見 られ た 変 化 は予 期 せ ぬ もの で あ っ た.

I.TGマ

ウスに見られた腎臓の組織学的変化

1.TGマ ウスの 腎糸 球体 TGマ ウス の 腎 臓 の 外 見 は 正 常 で あ っ た が,組 織 学 的 に見 る と皮 質 の 糸 球 体 の 数 が 増 加 して い た14)(図2).TG マ ウ ス の 単 位 面 積 あ た りの 糸 球 体 数 は 正 常 マ ウ ス の 約 180%に 増 加 して い た が,こ の こ と は 単 に糸 球 体 が 増 え 図1ア ク チ ビ ン ・フ ォ リ ス タ チ ン 系 ア ク チ ビ ン1分 子 に対 して2分 子 の フ ォ リス タ チ ン が結 合 す る, フ ォ リス タ チ ン と結 合 した ア クチ ビン は作 用 を失 う,

て い る とい うだ け で な く,腎 臓 の ネ フロ ン数 が 増 加 して い る こ と を 示 して い る.TGマ ウ ス の 糸 球 体 は大 小 不 揃 い で,正 常 の サ イ ズ の もの もあ る が,一 部 に は 小 さい も の も認 め ら れ た.形 態 計 測 に よ り多 数 の 糸球 体 を検 討 す る と,数 が180%と 正 常 マ ウ ス に 比 べ て 多 い に もか か わ らず,糸 球 体 断 面 の 総 面 積 は正 常 マ ウ ス に比 べ て 多 少 低 下 して い た.糸 球 体 の 微 細 構 造 を 見 る と,メ サ ンギ ウ ム 細 胞 な ど の 血 管 構 造 は お お む ね 正 常 で あ っ た が(図3 D),ボ ー マ ン嚢 上 皮 が 肥 厚 して お り,近 位 尿 細 管 に 類 似 した 上 皮 で お お わ れ て い る 像 が 見 られ た(図3C).尿 細 管 の 形 態 は お お む ね正 常 に 近 か っ た が,尿 細 管 を構 成 す る 上 皮 細 胞 が 小 さ くそ の 数 が 増 加 して い た.断 面 像 で 見 る と 正 常 マ ウ ス の130∼150%程 度 の上 皮細 胞 が 並 ん で い る.こ の よ うに 糸 球 体 や 尿 細 管 に形 態 異 常 が あ る が,BUN(blood urea nitrogen)や 血 清 ク レ ア チ ニ ン な ど の値 は お お む ね 正 常 で,極 端 な 腎 機 能低 下 は み られ な い. 2.腎 臓の ネ フロ ン形 成 過程 腎臓 の ネ フ ロ ン は い っ た ん 胎 生 期 に 腎 臓 が 形 成 さ れ る とそ の 後 は壊 れ る こ とは あ っ て も再 生 す る こ と は な い と さ れ て い る. 糸 球 体 に 慢 性 腎 炎 な どが 起 こ り,徐 々 に破 壊 さ れ る とや が て 慢 性 腎 不 全 と な るが,こ の場 合 も糸 球 体 は再 生 しな い た め 残 さ れ た 腎 機 能 は破 壊 を 免 れ て い る残 存 糸 球 体 数 に依 存 して い る.生 まれ た と きの ネ フ ロ ン数 が 多 い ほ ど 慢 性 腎 不 全 に な る まで の 時 間が 長 い と い う大 家 もい るほ ど で あ る.筆 者 らのTGマ ウ ス の ネ フ ロ ン数 が どの よ う な機 序 に よ り増 加 した か を明 らか に す る こ とは,腎 臓 の 形 態 形 成 の メ カ ニ ズ ム を明 らか にす る う え で も重 要 で あ る と考 え られ る. 腎 臓 の ネ フ ロ ン は尿 管 芽(uretericbud)の 分 枝 に よ り始 ま る(図4).尿 管 芽 は 間 葉 組 織(metanephrogenic 図2ド ミ ナ ン トネ ガ テ ィ ブ 型 ア ク チ ビ ン 受 容 体 を 過 剰 発 現 したTGマ ウ ス の 腎 臓 の 組 織 所 見 腎臓 の 皮 質 のPAM染 色 像.N:正 常 マ ウ ス,TG:TGマ ウス. 図3ド ミ ナ ン トネ ガ テ ィ ブ 型 ア ク チ ビ ン 受 容 体 を 過 剰 発 現 したTGマ ウ ス 糸 球 体 の 組 織 所 見 (A)正 常 マ ウ ス,(B)TGマ ウス,(C)TGマ ウ ス糸 球体 の トル イ ジ ン ブル − 染 色 像.ボ-マ ン嚢 の 肥 厚 が 見 られ る.G:糸 球 体 (D)TGマ ウス 糸 球 体 のPAS染 色 像,メ サ ン ギ ウ ム 細 胞 な ど は お お むね 正 常 で あ る. 図4腎 ネ フ ロンの形 態形 成

133 蛋 白 質 核酸 酵 素Vol.46No.2(2001) mesenchyme)と 相 互作 用 を起 こ し(こ の 際 そ れ ぞ れ の組 織 か ら誘 導 因 子 が 産 生 ・分 泌 さ れ 互 い に 作 用 しあ う と考 え られ て い る),間 葉 組 織 を 上 皮 化 し近 位 尿 細 管 が 形 成 さ れ る.や が て そ こへ 毛 細 血 管 が 誘 導 され 糸 球 体 が 形 成 さ れ る と考 え られ て い る.こ の 際,分 枝 した1つ の 尿 管 芽 の 先 に糸 球 体 が で き るの で あ るか ら,尿 管 芽 が い くつ に 分 枝 す る か で ネ フ ロ ン数 が 規 定 さ れ る こ とに な る.ア クチ ビ ン シ グ ナ ル を抑 制 す る と ネ フ ロ ン数 が 増加 す る と い う理 由 と して,ア ク チ ビ ンが 尿 管 芽 の 分 枝 に 関 与 して い る可 能性 は な いで あ ろ うか?そ の 点 に 関 して,興 味 深 い報 告 が あ る.Ritvosら15)は 胎 生 期 マ ウ ス の腎 原 基 を 器 官 培 養 し,尿 管 芽 の 分 枝 を 検 討 し た.そ の 培 養 系 に ア ク チ ビ ンAを 添 加 す る と尿 管 芽 の 分 枝 を 著 明 に抑 制 し た の で あ る.ア クチ ビ ンAは 胎 生 期 の 腎 原 基 に 発 現 し て い る こ とが 知 られ て い る こ とか ら,尿 管 芽 に発 現 す る ア クチ ビ ンAが そ の 分 枝 を抑 制 して い る こ とが 推 定 さ れ る.も しそ う な らば,ア クチ ビ ン シ グ ナ ル を抑 制 す る と分 枝 が促 進 され,ひ い て は ネ フ ロ ン数 が 増 加 す る こ と が 推 定 され る. ⅠI.アク チ ビン による 腎尿 細管 の 分 枝 の制 御 1.尿 細管分枝形成のモデル系,MDCK細 胞 そ こで ア クチ ビ ンが 尿 細 管 形 成 に どの よ う に関 与 して い る か を さ らに検 討 す る た め に,尿 細 管 形 成 を研 究 す る モ デ ル系 で あ るMDCK細 胞 を用 い て 検 討 を 行 な っ た. こ の細 胞 は イ ヌ の 集 合 管 由 来 の 細 胞 株 で あ る.こ の細 胞 を コ ラ ー ゲ ンゲ ル 内 で 培 養 す る と,通 常 は球 状 の嚢 胞 を 形 成 す る.こ の 細 胞 を繊 維 芽 細 胞 と共 存 培 養 す る と,嚢 胞 か ら管 状 の構 造 が 出 現 し,や が て管 腔 構 造 を形 成 し, さ ら に分 枝 が起 こ る こ とが 知 られ て い る16).こ の 管 腔 は 極 性 を も っ た細 胞 か ら構 成 され,尿 細 管 の性 質 を備 えて お り,in vitroで 尿 細 管 形 成 を観 察 で き る実 験 系 と され て い る.繊 維 芽 細 胞 か ら産 生 ・分 泌 され る 因子 がMDCK 細 胞 を 尿細 管 へ と分 化 させ る わ け で あ る が,こ の 因 子 は 肝 細 胞 増 殖 因 子(HGF)で あ る こ とが 知 られ て い る.つ ま りMDCK細 胞 はHGFの 作 用 に よ り管 腔 を 形 成 して 尿 細 管 へ と分 化 し,さ らに 分 枝 を す るわ け で あ る. 図5Aは コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 に 培 養 して 嚢 胞 を 形 成 し たMDCK細 胞 で あ る.こ の 状 態 の 細 胞 にHGFを 添 加 して7日 間培 養 を続 け る と,図5Bの よ う に を管 腔 が 形 成 され 分枝 が 起 こ っ て く る.HGFに よ る 尿 細 管 形 成 で あ る.こ の と き,HGFと 同 時 に ア ク チ ビ ンAを 添 加 す る と,HGFに よ る尿 細 管 形 成 は 完 全 に 抑 制 さ れ,そ れ ば か りか 細 胞 は 分 散 し て し ま う.HGFは 細 胞 分 散 因 子 (scatter factor)で あ る こ とが 知 られ て い る が,こ の 結 果 は,ア クチ ビ ンがHGFの 尿 細 管 形 成 作 用 は抑 制 す る も の の,細 胞 分 散 因子 と して の 作 用 は抑 制 しな い た め,結 果 的 に細 胞 が 分 散 して しま う こ と を 示 唆 して い る.腎 原 基 で の 結 果 と同 様 に,ア ク チ ビ ン に は尿 細 管 形 成 ・分 枝 を強 力 に抑 制 す る作 用 が あ る こ とが 判 明 した.と こ ろ で 図5コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 に 培 養 し たMDCK細 胞 のHGFに よ る 形 態 変 化 と ア ク チ ビ ン の 作 用 MDCK細 胞 を コ ラ ー ゲ ンゲ ル 内 に 培 養 す る と嚢 胞 を形 成 す る (A).HGFを 添 加 す る と や が て 管 腔 を 形 成 し,分 枝 が 起 こ る (B).(C)強 拡 大 像,HGFと と も に ア ク チ ビ ンAを 添 加 す る と 管 腔形 成 は 阻害 さ れ,細 胞 は分 散 す る(D). 図6コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 に 培 養 し たMDCK細 胞 の フ ォ リ ス タ チ ン に よ る形 態 変 化 MDCK細 胞 を コ ラ-ゲ ン ゲ ル 内 に培 養 しフ ォ リス タ チ ン を添加 す る と,や が て 管 腔 が 形 成 さ れ(A),分 枝 も起 こ る(B).(C)強 拡大 像 管腔 を形 成 して い る こ とが わ か る.(D)固 定 した 切 片 の HE染 色 像,管 腔 構 造 の 断面 が認 め られ る.

MDCK細 胞 は,ア ク チ ビ ン の βAサ ブ ユ ニ ッ ト を 産 生 し,そ の2量 体 で あ る ア ク チ ビ ンAを 産 生 分 泌 し て い る. 2.ア ク チ ビン ・フ ォ リスタチ ン系の意 義 こ の オ ー ト ク リ ン 産 生 さ れ る ア ク チ ビ ンAがMDCK 細 胞 に お い て ど の よ う な 役 割 を 果 た し て い る か を 明 ら か に す る 目 的 で,ア ク チ ビ ン の ア ン タ ゴ ニ ス トで あ る フ ォ リ ス タ チ ン を 培 養 系 に 添 加 し た.す る と,HGFな ど の 因 子 を 加 え て い な い に も か か わ ら ず,HGFの 場 合 と 同 様 に 管 腔 が 形 成 さ れ,分 枝 も 起 こ っ た の で あ る17)(図6 A,B).フ ォ リ ス タ チ ン に よ り で き た 管 腔 は 強 拡 大 で 見 る と 内 腔 が あ り,断 面 で 見 て も確 か に 管 腔 を 形 成 し て い る こ と が わ か る(図6C,D).実 際,電 顕 で み る と 極 性 を も ち デ ス モ ソ ー ム 構 造 を も つ 尿 細 管 の 構 造 が で き て い た.フ ォ リ ス タ チ ン の 作 用 が は た し て ア ク チ ビ ン の 作 用 を ブ ロ ッ ク す る こ と に よ り発 現 さ れ て い る か は 重 要 な 問 題 で あ る が,筆 者 ら は ド ミ ナ ン ト ネ ガ テ ィ ブ 作 用 を も つ 変 異 Ⅱ型 ア ク チ ビ ン受 容 体 遺 伝 子 をア デ ノ ウ イ ル スベ ク タ ー に よ りコ ラ ー ゲ ンゲ ル 内 のMDCK細 胞 に導 入 し, そ の 効 果 をみ た.そ の 結 果,変 異 ア ク チ ビ ン受 容 体 の 導 入 で ア クチ ビ ンシ グナ ル を ブ ロ ッ ク し た場 合 も,フ ォ リ ス タチ ン と同 様 に管 腔 が 形 成 さ れ た.こ の 変 異 受 容 体 は BMP-7(OP-1)の 作 用 を も 抑 制 す る 可 能 性 が あ る が, BMP-7は こ の 細 胞 で は ア クチ ビ ン と は 逆 に 管 腔 形 成 を 促 進 す る こ とか ら,変 異 受 容 体 は内 因 性 に 産 生 され て い る ア クチ ビ ンの作 用 を ブ ロ ッ ク して 管 腔 形 成 を促 進 した と考 え られ る.こ れ らの 結 果 は,次 の こ と を 示 して い る. ①MDCK細 胞 は ア ク チ ビ ンAを 産 生 し,② そ の ア ク チ ビ ンAは オ ー トク リ ン 因 子 と して 尿 細 管 形 成 を抑 制 し て い る.③ そ の作 用 を フ ォ リス タチ ン や 変 異 受 容 体 遺 伝 子 の 導 入 に よ っ て抑 制 す る と,管 腔 形 成,分 枝 形 成 が 起 こ る. 3.HGF作 用とアクチビン作用の関係 で はHGFに よ る 管 腔 形 成 ・分 枝 形 成 と ア ク チ ビ ンの 作 用 と は 関 係 が あ る の だ ろ うか?HGFを 添 加 す る と ア ク チ ビ ンの βAサ ブ ユ ニ ッ トmRNAの 発 現 が 低 下 す る17).実 際,図7に 示 す よ う に コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 で βA

サ ブ ユ ニ ッ トmRNAの 発 現 をin situハ イ ブ リ ダ イゼ ー

シ ョ ンで 検 討 す る と,嚢 胞 を形 成 して い る と き に は βA の 発 現 は 顕 著 で あ るが,HGF添 加 に よ り管 腔 を 形 成 す る 際 に は そ の 発 現 は 大 き く減 少 す る.ア ク チ ビ ンAの 蛋 白 質 レベ ル もHGFで 著 明 に 減 少 す る.つ ま り,HGF は ア ク チ ビ ンAの 産 生 を 抑 制 す る こ と に よ り 管 腔 形 成,分 枝 形 成 を促 進 す る と考 え ら れ る.も ち ろ んHGF が ア クチ ビ ンの 産 生 抑 制 に よ る経 路 に加 え て 他 の 経 路 か ら も作 用 して い る 可 能性 は否 定 で き な い.し か し,ア ク 図7HGFに よ る ア ク チ ビ ン βAサ ブ ユ ニ ッ トmRNA発 現 の 抑 制 ｉn situハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョン 法 に よ リ コ ラー ゲ ン ゲ ル 内の βAmRNA発 現 を 検 討 した.(A)嚢 胞 にお け る βAmRNA発 現, (B)HGF投 与 後 の βAmRNA発 現(C)セ ンス プ ロ-ブ. 図8虚 血 腎 障 害 後 の ア ク チ ビ ン βA サ ブ ユ ニ ッ ト,Ⅰ 型 お よ びⅡ 型 ア ク チ ビ ン 受 容 体mRNAの 発 現 変 化 ラ ッ トの両 側 腎動 脈 を45分 間 ク ラ ンプ したの ち に再 灌 流 し,虚 血 性 腎 障 害 を与 えた.そ の後 の ア ク チ ビン βAサ ブユ ニ ッ ト,Ⅰ 型(ActRI)お よ び Ⅰ型 ア ク チ ビ ン 受 容 体(ActRⅠ)mRNAの 変 化 を RT-PCRに よ り測 定 した.

135 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.46No.2(2001) チ ビ ン作 用 を抑 制 す る だ け で HGFと ま っ た く同 様 な 管 腔 形 成,分 枝 形 成 が 見 られ る こ とか ら,HGF作 用 の 主 要 な 経 路 は この ア ク チ ビ ンの 産 生 抑 制 に よ る と い っ て よい で あ ろ う. 腎 原 基 の 尿 管 芽 に お い て も ア ク チ ビ ンAは 産 生 さ れ て お り,ま たRitvosら15)が 示 した よ うに,管 腔 形 成,分 枝 形 成 を抑 制 す る作 用 を もつ. した が っ てMDCK細 胞 に お い て 明 らか に な っ た ア クチ ビ ン作 用 の 意 義 は,発 生 過 程 の 腎 原 基 に お い て もあ て は ま る と推 定 さ れ る.HGFが 尿 管 形 成 にお い て 重 要 な働 きを して い る こ とは す で に確 立 され て い るが,こ の 作 用 が オ ー トク リ ン 因子 ア ク チ ビ ン の 産 生 調 節 を 介 して い る こ とが 明 らか に な っ た わ け で あ る.よ く知 ら れ て い る よ う に,HGFは 間 葉 系 細 胞 が 産 生 す る 因 子 で あ る.ア ク チ ビ ンAは 上 皮 細 胞 が 産 生 す る 因 子 で あ り,こ こ に も間葉 系 −上 皮 系 の 相 互 作 用 が み られ る わ け で あ る. III.ア ク チ ビン ・フ ォリスタ チ ン系 に よ る腎 尿 細 管 再 生 の調 節 1.尿 細管再生とアクチビン 腎 尿 細 管 の 形 態 形 成 に お け る ア クチ ビ ンの 作 用 が 明 ら か に な って きた が,出 生 後 の 組織 修 復 の 際 に も発 生 過 程 と同 様 な 増 殖 因 子 ・分 化 誘 導 因子 に よ る 調 節 が み られ る こ とが 多 い.腎 臓 の 場 合,一 般 に 糸 球 体 は 再 生 しな い と い う こ と に な っ て い るが,尿 細 管 は さ ま ざ ま な病 態 にお い て 再 生 す る こ とが 知 られ て い る.た と え ば,腎 虚 血 や 腎毒 性 の あ る薬 物 に よ り尿 細 管 壊 死 が 起 こ り急 性 腎 不 全 に 陥 っ た場 合,や が て尿 細 管 細 胞 は 再 生 し,尿 細 管 の 構 造 が 再 構 成 され る.こ の 尿 細 管 の再 生 過 程 に お い て も ア ク チ ビ ン ・フ ォ リス タチ ンが 関与 して い る こ とが 推 定 さ れ る. 図9虚 血 腎 障 害 ラ ッ トに フ ォ リ ス タ チ ンを 投 与 した 際 の 尿 細 管 の 組 織 変 化 ラ ッ トに虚 血 腎障 害 を与 え,再 灌 流 時 に 生 理 的食 塩 水(A)あ る い は フ ォ リス タ チ ン(B.C)を 投 与 した,48時 間後 の 尿 細 管 の 組 織 像 を示 す. 図10虚 血 腎 障 害 ラ ッ トに フ ォ リ ス タ チ ン を 投 与 した 際 の 尿 細 管 細 胞 の ア ポ トー シ ス ラ ッ トに虚 血 腎 障害 を 与 え,再 灌 流 時 に生 理 的食 塩 水(A,C)あ る い は フ ォ リス タチ ン(B,D)を 投 与 し,48時 間後 の 尿 細管 細 胞 の ア ポ ト-シ ス をTUNEL法 に よ り測 定 した.C,D:強 拡大 像,

2.ア クチ ビン ・フォ リス タチ ンの発現変 化 と意 義 そ こ で 筆 者 ら は,ラ ッ トの 両 側 腎 動 脈 を45分 間 ク ラ ンプ して 腎 を虚 血 状 態 に し,急 性 腎 不 全 を起 こ させ,そ の 後 の 尿 細 管 再 生 過 程 で ア ク チ ビ ン ・フ ォ リス タチ ン系 が ど の よ う に 変 化 す る か を検 討 し た.図8に 示 す よ う に,ア ク チ ビ ン の βAサ ブ ユ ニ ッ トmRNAは 正 常 腎 に は検 出 で き な か っ た が,一 過 性 腎 虚 血 に よ り障 害 を 与 え る と そ の24時 間 後 以 降 に 大 き く増 加 した.Ⅰ 型 お よ び Ⅱ型 ア ク チ ビ ン受 容 体 のmRNA発 現 に は 変 化 は み られ な か っ た.ア ク チ ビ ンAの 発 現 を免 疫 組 織 化 学 法 に よ り検 討 す る と,正 常 腎 に は ア クチ ビ ンの 免 疫 活 性 は 認 め られ な いが,腎 虚 血 後 に尿 細 管 上皮 細 胞 に お い て 著 明 な ア ク チ ビ ンAの 発 現 を 認 め た.一 方,正 常 腎 で は フ ォ リス タ チ ンmRNAの 発 現 が 多 い が,腎 虚 血 の あ と に 発 現 が 減 少 し,そ の 変 動 は ち ょ う どア クチ ビ ン βAサ ブ ユ ニ ッ トの 発 現 変 化 と鏡 像 的 で あ っ た,つ ま りア ク チ ビ ン Aが 増 加 し,フ ォ リス タチ ンが 減 少 す る の で あ る か ら, 腎 虚 血 後 の 尿 細 管 再 生 の 際 に は ア クチ ビ ン作 用 が 大 き く 増 加 して い る と推 定 され る,そ こで 腎 障 害 後 に 発 現 す る ア クチ ビ ンの 意 義 を 明 らか に す る た め に,腎 虚 血 後 の 再 灌 流 の 直 後 に フ ォ リス タチ ンを経 静 脈 的 に投 与 しそ の 効 果 を 検 討 し た.図9Aに 示 す よ う に,虚 血 性 の 腎 障 害 を受 け た 腎 臓 で は尿 細 管 腔 が 拡 大 し,上 皮 の 脱 落,出 血 な どの 組 織 学 的 異 常 が 認 め られ た.一 方,再 灌 流 の 際 に フ ォ リ ス タチ ン を投 与 した ラ ッ トで は こ う した 障 害 が 軽 度 で,尿 細 管 上 皮 の脱 落や 出血 像 は 認 め られ なか っ た(図 9B). ま た 図10に 示 す よ う に,対 照 群 で は ア ポ トー シ ス を 起 こ した細 胞 が 多 数 認 め られ,一 部 は尿 細 管 腔 に 脱 落 し て い る像 が 見 ら れ たが,フ ォ リス タチ ン投 与 群 で は ア ポ トー シ ス を起 こ した細 胞 の数 は著 明 に減 少 して い た.や が て こ う した細 胞 死 や 組 織 障 害 に ひ き続 い て 尿 細 管 細 胞 の 再 生 が 始 ま り,DNA合 成 を始 め る 細 胞 が 観 察 さ れ る よ うに な る が,図11に 示 す よ う に,フ ォ リ ス タ チ ン を 投 与 した ラ ッ トで は 対 照 群 に比 べ てDNA合 成 を す る 細 胞 の 数 が 有 意 に 多 か っ た.す なわ ち フ ォ リ ス タチ ン投 与 に よ り内 因 性 の ア クチ ビ ンAの 作 用 を抑 制 す る と,細 胞死 が 減 少 して 組 織 障 害 が 軽 度 に な り,さ ら にDNA合 成 が 促 進 す る.そ の 結 果,フ ォ リ ス タ チ ン投 与 群 で は BUNや 血 清 ク レ アチ ニ ン の 改 善 が 認 め られ た.逆 に, 再灌 流 時 に,経 静 脈 的 に ア クチ ビ ンAを 投 与 す る と, こ れ と は逆 に ア ポ トー シス の増 加,DNA合 成 の 減 少 が 認 め られ た こ とか ら,腎 障 害 後 に 腎 臓 に発 現 す る ア クチ ビ ンAは 障 害 を 悪 化 させ,組 織 修 復 を 遅 延 させ る よ う に働 い て い る と考 え ら れ た. 3.フ ォリスタチンによる尿細管再生の促進 この 結 果 は,ア クチ ビ ン ・フ ォ リ ス タチ ン系 が 腎 障 害 後 の 尿 細 管 再 生 過 程 に 関 与 し て い る こ と を 示 す と 同 時 に,フ ォ リ ス タチ ン を投 与 して 内 因 性 の ア ク チ ビ ンA の作 用 をブ ロ ックす る こ と に よ り,腎 障 害 を軽 減 し尿 細 管 の再 生 を促 進 させ る こ とが 可 能 で あ る こ と を示 唆 して い る.HGFに こ う した 作 用 が あ る こ と は す で に よ く知 ら れ て い る18).HGFを 経 静 脈 的 に投 与 した 場 合,そ の 半 減 期 は短 い が,こ れ に 対 して フ ォ リス タチ ン は経 静 脈 的 に投 与 した 際 に高 率 に 腎臓 に 集 積 し,し か も腎 内 に長 図11虚 血 腎 障 害 ラ ッ トに フ ォ リ ス タ チ ン を 投 与 した あ と の 尿 細 管 細 胞 のDNA合 成 (a)ラ ッ トに 虚血 腎障 害 を 与 え,再 灌 流 時 に生 理 的 食 塩水(○)あ る い は フ ォ リスタ チ ン(●)を 投与 し,尿 細 管 細 胞 のDNA合 成 を BrdU標 識 法 に よ り測 定 した.(b)リ コ ン ビナ ン ト・ヒ ト(rh)フォ リス タチ ン 作用 の 濃度 依 存 性.

137 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.46No.2(2001) 時 間 と ど ま る こ と か ら19),尿 細 管 再 生 の促 進 の 目 的 で 投 与 す る うえ で は 有 利 で あ る.筆 者 らは す で に フ ォ リス タ チ ン を投 与 す る こ と に よ り,内 因性 の ア クチ ビ ン作 用 を 抑 制 して肝 再 生 を 促 進 させ る こ とが で き る こ と を報 告 し て い る20).“増 殖 抑 制 因 子 の作 用 を ブ ロ ッ ク す る こ と に よ っ て 再 生 を 促 進 す る ”こ との 有 用 性 を再 認 識 した こ と に な る. お わ りに ア ク チ ビ ンお よ び フ ォ リス タチ ンが 腎 尿 細 管 の形 態 形 成,急 性 腎 不 全 時 の 尿 細 管 再 生 に 関与 して い る こ とが 明 らか に な っ た.今 後,慢 性 の腎 障 害 へ の 関 与 な ど を 明 ら か に して い く必 要 が あ る.

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