埼 玉 県林 業 従 事者 にお け る ライム ボ レ リア感染 状 況 調査
埼玉県衛生研究所病理細菌部
生 嶋
昌 子
河 橋
幸 恵
奥 山
雄 介
明治薬科大学微生物学教室
松
井
勝
彦
新
井
俊
彦
(平成6年10月4日 受付)
(平成6年10月21日 受理)
Key words:
Borrelia burgdorferi, Lyme borreliosis,
tick bite, occupational risk
要 旨 ラ イ ム 病 の ハ イ リス ク グ ル ー プ と考 え られ る埼 玉 県 の 林 業 従 事 者80例 を対 象 と し て,ダ ニ に よ る刺 咬 被 害 調 査 及 び 抗Borrelia burgdorferi抗 体 保 有 状 況 調 査 を行 っ た.抗 体 測 定 は,北 米 由 来 株B31を 抗 原 と した 市 販 キ ッ ト,国 内 分 離 株HP3(シ ュル ツ ェ マ ダ ニ 由 来)及 びHO14(ヤ マ トマ ダ ニ 由来)を 抗 原 と し たELISA法 に よ り行 っ た.抗 体 陽 性 例 は80例 中24例(30.0%)で あ り,こ の う ち,B31株 を 抗 原 と し た場 合 で は,3例(3.8%),HP3株 で は19例(23.8%),ま た,HO14株 で は11例(13.8%)で あ っ た. ELISA法 に よ る抗 体 陽 性 例 に つ い て は,Westernblot法 に よ り特 異 抗 体 を確 認 した.そ の 結 果,最 終 的 に抗 体 陽 性 例 は16例(20.0%)で あ っ た.こ れ らは い ず れ も国 内 分 離 株 を抗 原 と し た 抗 体 陽 性 例 で あ り, HP3株 を 抗 原 と した 陽 性 例 が 多 数 を 占 め た.ま た,林 業 に 関 与 し な い 県 下 の 住 民30例 に つ い て 同 様 に測 定 した と こ ろ,HP3株 を抗 原 と し たELISA法 に の み 抗 体 陽 性 例 が1例(3.3%)認 め られ た が,Western blot法 で は陰 性 で あ っ た. ダ ニ に よ る刺 咬 被 害 調 査 で は,80例 中24例(30.0%)に ダ ニ 刺 咬 の 既 往 が 認 め られ た.ま た,HP3株 を 抗 原 と した 抗 体 陽 性例 に お け る ダ ニ 刺 咬 率 は,73.3%(11/15)で あ り,抗 体 陰 性例 に お け るダ ニ 刺 咬 率20.0%(13/65)に 比 べ 有 意 に 高 か っ た(p<0.001).以 上 よ り,本 県 の林 業 従 事 者 は,林 業 に 関 与 し な い 県 下 の 住 民 に比 べ 抗 体 保 有 率 が 高 く,マ ダ ニ の 刺 咬 に よ る ラ イ ム ボ レ リ ア の 感 染 が 示 唆 さ れ た.
序
文
ラ イ ム病 は,マ ダ ニ の 刺 咬 に よ りBorrelia
bur-gdorferi(ラ イ ム ボ レ リア)に 感 染 し,多 様 な臨 床
症 状 を生 ず る全 身 性 の感 染 症 で あ る.本 邦 で は,
1987年 に初 め て 症 例 報 告 が あ り1),以後,北 海 道 や
本 州 中 部 以 北 を 中 心 に そ の 症 例 が 報 告2)され て い
る.埼 玉 県 にお い て も,山 で 感 染 した 患 者 の症 例
報 告3)が あ る ほ か,登
山 者 等 に お い て マ ダ ニ の刺
咬 被 害 が 発 生 し て い る.さ
らに,秩 父 山 系 に生 息
す る マ ダ ニ か ら ラ イ ム ボ レ リア が 検 出 さ れ て お
り4),今 後 も ラ イ ム病 患 者 の 発 生 が 予 測 され る.
そ こで,本 県 に お け る ラ イ ム病 の感 染 状 況 を 把
握 す る た め,マ
ダ ニ と接 触 機 会 の 多 い林 業 従 事 者
に つ い て,ダ ニ に よ る刺 咬 被 害 調 査 及
び抗B.bur-gdorferi抗 体(抗Bb抗
体)保 有 状 況 調 査 を行 っ た
の で報 告 す る.
材 料 と方 法
1.調 査 対 象
1993年5月,埼
玉 県秩 父 地 方 の林 業 従 事 者80名
(男性78名 及 び 女 性2名)を
対 象 に調 査 を行 った.
2.ダ
ニ に よ る刺 咬 被 害 調 査
調 査 内 容:ダ
ニ刺 咬 の 有 無,ダ
ニ 刺 咬 に伴 う症
状,既 往 歴 及 び主 な作 業 場 所 の お お よ そ の海 抜 高
別 刷 請 求 先:(〒338)埼 玉 県浦 和 市 上大 久 保639-1 埼 玉 県衛 生 研 究所 病 理 細 菌部 生 嶋 昌子 平 成7年2月20日140
生嶋 昌子 他
度 を調 査 した.
調 査 方 法:個 別 に質 問 す る面 接 方 式 に よ り調 査
を行 っ た.調 査 の 際,対 象 者 に ラ イ ム 病 の概 要 を
説 明 した 上 で,ラ
イ ム ボ レ リア を媒 介 す る シ ュル
ツ ェ マ ダ ニ 及 び ラ イ ム 病 に特 異 的 な症 状 で あ る慢
性 遊 走 性 紅 斑(ECM)の
写 真 を提 示 し,刺 咬 後 の
症 状 を確 認 した.
3.ELISA法
に よ る抗Bb抗
体 検 索
被 検 血 清:ダ
ニ に よ る刺 咬被 害 調 査 時 に 採 取 し
た林 業 従 事 者80名 の 血 清 を使 用 した.ま
た,林 業
に 関 与 し な い 県下 の 住 民(対
照 群)30名
の 血 清 を
使 用 した.
ELISA法
1)北 米 由 来 株B31を
抗 原 と した 市 販 の 血 清 診
断 キ ッ ト(エ
ル ナ ス(R)ラ イ ム;Cambridge
Biotech, Worcester, USA)を
用 い,操 作 法 に従 っ
て 行 っ た.説 明 書 に従 い算 出 したcut off値 以 上 の
値 を示 す もの を,抗 体 陽性 と判 定 した.
2)本 邦 で 分 離 され た
B. burgdorferi sensu lato
の う ち,シ ュ ル ツ ェ マ ダ ニ 由 来 の Borrelia garinii HP3株5)(以 下,HP3株)及 び ヤ マ トマ ダ ニ 由 来 の
Borrelia japonica
HO14株6)(以 下,HO14株)の 超 音 波 破 砕 抗 原 を 用 い,磯 貝 ら7)の 方 法 に よ り測 定 し た.cut off値 は,対 照 群 の 血 清30例 の 測 定 平 均 値+2SDと し,cut off値 以 上 の 値 を 示 す も の を 抗 体 陽 性 と判 定 し た. 4.Western blot法 に よ る特 異 抗 体 の 確 認 ELISA法 に よ る 抗 体 陽 性 例 に つ い て は,West-ern blot法 に よ り確 認 を 行 っ た.そ の 際,陽 性 対 照 と し て,北 海 道 医 療 大 学 磯 貝 恵 美 子 博 士 か ら分 与 さ れ た ラ イ ム 病 患 者8)の 血 清 を 用 い た.ま た,陰 性 対 照 と し て,ELISA法 に お い て 抗 体 陰 性 で あ っ た 対 照 群 の 血 清 を 用 い た.ELISA法 の 使 用 抗 原 で あ る3株(B31,HP3及 びHO14)をLaemmli9)の 方 法 に 準 じ,sodium dodecyl sulfate(SDS)処 理 し た 後,10.0%ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 を 行 っ た.こ れ ら を ニ ト ロ セ ル ロ ー ル 膜 上 に 転 写 し た 後,3%BSAを 含 むTris-食 塩 緩 衝 液 (TBS)に 浸 し,4℃ で 一 夜blockingし た.次 に こ の 転 写 膜 を,100倍 希 釈 し た 被 検 血 清 で 各 々2時 間 反 応 さ せ た.さ ら に,転 写 膜 を1%Tween20添 加 TBS(washing buffer)で5回 洗 浄 後,8,000倍 希 釈 し た ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 ヒ トIgG抗 体(Organon Teknika nv., Turnhout, Belgium) で1時 間 反 応 さ せ た.反 応 後,こ れ をwashing bufferで5回 洗 浄 し,ECL化 学 発 光 シ ス テ ム
(Amersham International plc., Buckingham-shire, England)に よ り抗 体 を 検 出 し た.被 検 血 清 の う ち,患 者 血 清 の 場 合 と同 様 に,各 菌 株 の 特 異 的 な 抗 原 バ ン ド と 考 え ら れ るOuter surface protein A (OspA)に 対 す る 抗 体 が 検 出 さ れ た も の を,最 終 的 に 抗Bb抗 体 陽 性 と 判 定 し た. 5.梅 毒 血 清 反 応 検 査 ELISA法 に よ る抗 体 陽 性 例 に つ い て は,梅 毒 ス ピ ロ ヘ ー タ と の 交 差 反 応 の 有 無 を確 認 す る た め, ガ ラ ス 板 法(住 友 製 薬,大 阪)及 びTPHA法(富 士 レ ビ オ,東 京)に よ り,梅 毒 血 清 反 応 検 査 を 実 施 し た. 成 績 1.ダ ニ に よ る 刺 咬 被 害 調 査 ダ ニ 刺 咬 の 既 往 が 「あ る 」 と 回 答 し た 者(ダ ニ 刺 咬 例)は,80例 中24例(30.0%)で あ っ た(Table 1).ダ ニ 刺 咬 例 に お い て,刺 咬 に 伴 う症 状 が 「あ っ
Table 1 Questionnaire survey of tick bite cases and working area in forestry workers in Saitama Prefecture (1993)
n=80
*1 surveyed in the cases of tick bites (n=24)
*2
above the sea
Table 2 Seropositive cases for antibodies against Borrelia burgdoferi in the forestry workers
(1993)
*the diagnostic kit (Elnas Lyme)
+: positive case by ELISA (
+): positive case by ELISA and Western blotting
た 」 と 回 答 し た 者(有 症 例)は14例 で あ り,そ の う ち 刺 咬 部 位 に 発 疹 が 認 め ら れ た 者 は7例 で あ っ た.ま た,残 りの7例 は,か ゆ み や し こ り な ど の 症 状 が 認 め ら れ た.有 症 例 に 認 め ら れ た 発 疹 は, ECMに 関 連 し た も の で は な く,い ず れ の ダ ニ 刺 咬 例 も ラ イ ム 病 の 典 型 的 な 症 状 は 認 め ら れ な か っ た.刺 さ れ た ダ ニ の 種 類 は,い ず れ も 不 明 で あ っ た. そ こ で,ラ イ ム ボ レ リ ア を 媒 介 す る マ ダ ニ の 生 息 す る 地 域 と の 関 連 を 調 べ る た め に,主 な 作 業 場 所 の 海 抜 高 度 を 調 査 し た 。 そ の 結 果,「 海 抜500m ∼1 ,000rn」 で 作 業 を 行 っ て い る 者 は69例 (86.3%),「 海 抜1,000m∼1,500m」 で は2例 (2.5%)で あ り,合 わ せ て88.8%で あ っ た.ま た, ダ ニ 刺 咬 の 既 往 が あ る24例 の う ち,22例 は 「海 抜 500m∼1,000m」 で,残 り の2例 は 「海 抜1,000m ∼1 ,500m」 で 作 業 を 行 っ て い た. 2.ELISA法 に よ る 抗Bb抗 体 検 索 3種 の 抗 原 を 用 い たELISA法 に よ る 抗Bb抗 体 陽 性 例 は,80例 中24例(30.0%)で あ っ た(Table 2).各 抗 原 を 用 い た 抗 体 陽 性 例 は,B31株 を 抗 原 と し た 市 販 キ ッ トで は3例(3.8%),国 内 分 離 株 の HP3株 を 抗 原 と し たELISA法 で は19例(23.8%) 及 びHO14株 で は11例(13.8%)で あ っ た.対 照 群 30例 に お い て は,HP3株 に の み 抗 体 陽 性 例 が1例
(3.3%)認
め られ た.B31株
を抗 原 と した 抗 体 陽 性
3例 は,国 内 分 離 株HP3及
びHO14を
抗 原 と した
い ず れ に も陽 性 を示 さ な か った.ま た,HO14株
を
抗 原 と した 抗 体 陽 性11例 中9例(81.8%)は,HP3
株 に お い て も陽 性 で あ っ た.
抗 体 陽性 例 は,い ず れ も梅 毒 血 清 反 応 陰 性 で あ
り,梅 毒 ス ピ ロへ ー タ との 交 差 反 応 は認 め られ な
か っ た.
3.Western
blot法 に よ る特 異 抗 体 の確 認
ELISA法
に よ る抗 体 陽 性 例 に つ い て
は,West-ern blot法 に よ り確 認 を行 っ た.そ の 結 果,24例
中16例 に お い てOspAに
対 す る抗 体 が 検 出 され,
最 終 的 に抗 体 陽 性 例 は16例(20.0%)で
あ っ た.
そ の代 表 例(Table2;
No.8)に
つ い てFig.1に
示 した.い ず れ も国 内 分 離 株 を抗 原 とし た抗 体 陽
性 例 で あ り,B 31株 を抗 原 と した 場 合 で は,鞭 毛 蛋
白 に対 す る抗 体 が 検 出 され た が,OspAに
対 す る
抗 体 は検 出 さ れ な か った.抗 体 陽性16例 の うち2
例 は,HP3株
及 びHO14株
を抗 原 と し た 各 々 の
Western blot法 に お い て 陽 性 で あ った.対 照 群 に
お け るELISA法
の 抗 体 陽 性1例
は,Western
blot法 で は陰 性 で あ っ た.
また,ダ ニ 刺 咬 の 既 往 は,抗 体 陽 性16例 中12例
(75.0%)に
認 め られ た.抗 体 陽性 例 に お い て ライ
ム病 の 典 型 的 な症 状 を示 した者 は認 め られ な か っ
平成7年2月20日142
生嶋 昌子 他
Fig. 1 Detection of antibodies against B.
burgdor-feri isolated in Japan by Western blotting
Anti-OspA(HP3 ; 33kDa, H014 ; 31kDa) antibody
in addition to anti-flagellin (41kDa) antibody was
detected in some of positive cases by ELISA with
HP3 or H014 antigen. Results of Western
blot-ting in the serum from No. 8 in Table 2 are
shown.
Table 3 Antibody-positive cases by ELISA and Western blotting, and relationship between antibody-positive cases by Western blotting and tick bites
*1: No . of positive cases confirmed by Western blotting *2: No . of positive cases by ELISA
* 3: No. of tick bite cases in Wb (+)
た. 4.各 抗 原 を 用 い たELISA法 の 陽 性 例 に お け るWesternblot法 の 成 績 ELISA法 に よ る 抗 体 陽 性 例 の う ち,Western blot法 で 陽 性 を 示 し た も の(抗 体 陽 性 一 致 例)は, B31株 を 抗 原 と し た 場 合 に 認 め ら れ な か っ た (Table3).ま た,HP3株 を 抗 原 と し た 抗 体 陽 性 一 致 例 は,19例 中15例(78.9%),HO14株 で は11例 中3例(27.3%)で あ っ た.ま た,抗 体 陽 性 一 致 例 が 最 も 高 率 に 認 め ら れ たHP3株 を 抗 原 と し た 場 合 で は,Westernblot法 で 確 認 さ れ た 抗 体 陽 性 例 に お け る ダ ニ 刺 咬 例 の 割 合(ダ ニ 刺 咬 率)は, 73.3%(11/15)で あ り,抗 体 陰 性 例 に お け る ダ ニ 刺 咬 率20,0%(13/65)に 比 べ 有 意 に 高 か っ た(p〈 0-001). 考 察 本 邦 に お け る ラ イ ム 病 患 者 は,欧 米 諸 国 で 報 告 さ れ て い る 症 例'0)11)に 比 べ,症 状 が 軽 度 で あ る ケ ー ス が 多 く,中 に は 不 顕 性 感 染 例 の 報 告3)12)も あ る.ま た,ラ イ ム 病 と 診 断 さ れ た 患 者 以 外 で も, マ ダ ニ と 接 触 機 会 の 多 い 職 業 群 に お い て,ラ イ ム 病 の 典 型 的 な 症 状 を 示 さ な い 抗 体 陽 性 例 が 認 め ら れ て お り13),不 顕 性 感 染 例 の 存 在 も否 定 で き な い. こ れ ら の ケ ー ス で は,マ ダ ニ 刺 咬 の 既 往 及 び 血 清 診 断 が,ラ イ ム ボ レ リ ア の 感 染 状 況 を 把 握 す る た め の 重 要 な ポ イ ン ト と 思 わ れ る.そ こ で,ラ イ ム 病 の ハ イ リス ク グ ル ー プ と考 え ら れ る 林 業 従 事 者 80名 に つ い て,ダ ニ に よ る 刺 咬 被 害 調 査 及 び 抗 Bb抗 体 保 有 調 査 を 行 っ た. ダ ニ に よ る 刺 咬 被 害 調 査 の 結 果,ダ ニ 刺 咬 の 既 往 は 全 体 の30%に 認 め ら れ,こ れ ら の 刺 咬 例 は 海 抜1,000m付 近 の 山 林 で 作 業 を 行 っ て い た.藤 本 ら14)の調 査 で は,標 高600∼1,800mの 秩 父 山 系 に お い て,ラ イ ム ボ レ リ ア を 媒 介 す る マ ダ ニ が 採 集 さ れ て い る.さ ら に,Miyamotoら4)は,秩 父 山 系 に 生 息 す る マ ダ ニ か ら ラ イ ム ボ レ リ ア を 検 出 し て い る.今 回 の 調 査 で は,海 抜500m以 上 で 作 業 を 行 っ て い る 者 が 全 体 の 約89%を 占 め て い る こ と か ら,ラ イ ム 病 のoccupational riskが 高 い と考 え ら れ た.刺 さ れ た ダ ニ の 種 類 に つ い て は 確 認 で き な か っ た が,山 林 地 域 で 刺 咬 被 害 が あ り,さ ら に, ダ ニ を 肉 眼 で 認 識 で き た こ と か らマ ダ ニ と 推 測 さ れ た15). こ の よ う な ダ ニ に よ る 刺 咬 被 害 状 況 と ラ イ ム ボ レ リ ア 感 染 と の 関 連 を 調 べ る た め に,抗Bb抗 体 保 有 状 況 調 査 を 行 っ た.国 内 で 使 用 さ れ て い る 抗 Bb抗 体 測 定 用 の 市 販 キ ッ トの 抗 原 に は,北 米 由 来 株 のB. burgdorfe7i sensu strictoB31が 用 い ら れ て い る.し か し,本 邦 で 患 者 及 び マ ダ ニ か ら 分 離 さ れ たB. burgdorferi sensu latoは,北 米 由 来 株 と タ イ プ が 異 な る5)16)と報 告 さ れ て い る こ と か ら,国 内 分 離 株 を 抗 原 と し たELISA法 に よ る 測 定 も 行 っ た.さ ら に,抗 体 陽 性 例 に つ い て は,
Western
blot法 に よ り各 菌 株 の 特 異 的 な 抗 原 バ
ン ド と考 え ら れ るOspAに
対 す る抗 体 を確 認 し
た.そ
の 結 果,抗 体 陽 性 例 は80例 中16例(20.0%)
で あ っ た.こ
れ ら は いず れ も国 内 分 離 株 を抗 原 と
し た 抗 体 陽 性 例 で あ り,HP3株
で は15例
(18.8%),HO14株
で は3例(3.8%)と,HP3株
を抗 原 とし た 抗 体 陽 性 例 が 多 数 を 占 め た.B31株
を抗 原 とし た抗 体 陽 性 例 は,Western
blot法 に よ
り鞭 毛 蛋 白 に対 す る 抗 体 が 検 出 さ れ た が,OspA
に対 す る抗 体 は検 出 さ れ な か った.こ
の 鞭 毛 蛋 白
に対 す る抗 体 は,ラ
イ ム病 患 者 に お い て検 出 頻 度
が 最 も高 い反 面,健
康 人 に お い て検 出 され る割 合
も多 い17)と報 告 され て い る.今 回 の成 績 に お い て
も,陰 性 対 照 に鞭 毛 蛋 白 に対 す る抗 体 が 検 出 さ れ
て い る こ とか ら,B 31株 を抗 原 と した 抗 体 陽 性 例
は,非 特 異 的 反 応 に よ る偽 陽 性 と考 え られ た.
ダ ニ 刺 咬 の 既 往 は,抗
体 陽 性16例
中12例
(75.0%)に
認 め ら れ た.こ
の うち,HP3株
及 び
HO14株
を抗 原 と し た い ず れ に も陽性 を示 した2
例 で は,過 去 に ダ ニ に よ る刺 咬 が 数 回 認 め られ て
お り,HP3株
及 びHOI4株
の 各 抗 原 に対 す る抗 体
を保 有 して い る と考 え られ た.
HP3株
を抗 原 と したELISA法
とWestern blot
法 との抗 体 陽 性 一 致 例 は,他 の2株
を抗 原 と した
場 合 に比 べ て 高 率 に認 め られ,検 出 抗 体 の 特 異 性
が 高 い と考 え られ た.ま た,HP3株
を抗 原 とした
ELISA法
に お い て 抗 体 陽 性 で あ っ た ダ ニ 刺 咬 例
の12例 中11例(91.7%)は,Western
blot法 に お
い て も陽 性 を示 し,さ
らに,抗 体 陽 性 例 の ダ ニ 刺
咬 率 は,抗 体 陰 性 例 の場 合 と比 べ有 意 に高 か っ た.
HP3株
は,本 邦 で ラ イ ム病 を発 症 さ せ る有 力 なベ
ク タ ー と考 え られ て い る シ ュル ツ ェ マ ダ ニ よ り分
離 され た 株 で あ り,今 回 の 成 績 か ら,抗 体 陽 性 例
とマ ダ ニ 刺 咬 の 既 往 との 関 連 が 強 く示 唆 され た.
本 邦 で は,地 域 に よ り様 々 な タ イ プ の ラ イ ム ボ レ
リア が 分 離 され て お り,今 後 さ らに使 用 抗 原 に つ
い て 検 討 を行 う必 要 が あ る と考 え られ た.
以 上,本
県 の 林 業 従 事 者 は,ダ ニ に よ る刺 咬被
害 状 況 及 び 作 業 環 境 か ら,ラ
イ ム 病
のoccupa-tional riskが 高 い と考 え られ た.ま た,抗 体 調 査
の 結 果,林
業 に関 与 し な い 県下 の 住 民 に比 べ抗 体
保 有 率 が 高 く,マ ダ ニ の 刺 咬 に よ る ラ イ ム ボ レ リ ア の 感 染 が 示 唆 さ れ た.今 回 の 調 査 対 象 で は,抗 体 陽 性 例 に ラ イ ム 病 の 典 型 的 な 症 状 は 認 め られ な か っ た が,今 後 も 追 跡 調 査 を 行 う 必 要 が あ る と思 わ れ た. 本 論 文 の一 部 は,第68回 日本 感 染 症学 会 総 会(1994年4 月)に て 発表 した. 謝 辞:稿 を終 え るに 当た り,御 指 導及 び御 助 力 いた だ い た北 海 道 医療 大 学 磯 貝恵 美 子博 士,国 立 予 防 衛 生研 究 所 森 守博 士,大 谷 昌博 士,埼 玉 県衛 生 研 究所 大 村 外 志隆 博 士, 渕 卜博 司 博 士,山 田 立也 先 生 に深 謝 い た します.文
献
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生嶋
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