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SUMMARY Physical effects of sampling conditions and preservation time on the nature of mitochondrial DNA (mtdna) were studied by analyzing electrophor

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Jpn J Electroph 1994; 38: 19

著 〕

各 種 動 物 の 長 期 保 存 お よ び事 故 死 体 臓 器 か らの

ミ トコ ン ド リアDNAの

精 製

横 濱 道 成 ・山崎 泰 助 ・亀 山祐 一 ・石 島 芳 郎

SUMMARY

Physical effects of sampling conditions and preservation time on the nature of mitochondrial

DNA (mtDNA) were studied by analyzing electrophoretic patterns and measuring volume and

purity of mtDNA which was fractionated and extracted from organs preserved for a maximum

1.4 years in eight animal species. The analysis showed that the volume and purity of the

pre-pared samples did not differ significantly between long-term preserved and fresh organs. Also,

no physical effect of the long-term freezing preservation on the cleavage patterns was detected in

the results using eight restriction endonucleases. Non-degenerate mtDNA was extracted from the

livers of Japanese Sika deer which died in accidents, and the organs preserved at less than -80℃ for one year. Almost no physical effect on volume or purity of the prepared mtDNA was

ob-served. When mitochondria was fractionated from organs of animals without bleeding and with

fatty livers, the non-degenerate mtDNA was obtained more by repeated washings with the homo

buffer and careful cutting with scissors. From the above results, even if organs are obtained

under inferior sampling conditions, as in the case of wild animals which died by traffic accidents,

mtDNA obtained by fractionation can be used to study cytoplasmic inheritance. It is suggested

that accident carcasses of wild animals, which are also important as gene resources can be

effi-ciently used for academic researches.

Key words: mitochondrial DNA, preserved organs, accident carcass, Japanese Sika deer.

緒 言

ミ トコ ン ド リアDNA (mtDNA) は核DNAと は 独

立 し た遺 伝 系 に あ り, 母 性 遺 伝 に従 う約16,500塩 基 対 の環 状 分 子 で あ る. mtDNAは 組 織 か ら比 較 的 容 易 にか つ 多 量 に 分離 で き, 進 化 速 度 (塩基 置換) が核DNAの 5∼10倍 の速 さで あ る こ とな どか ら, 系 統 進 化 や 先 天 性 異 常 疾 病 との 関 連 性 に 関 す る情 報 を 得 る た め 系 統 進 化 学, 家 畜 育 種 学, 分 子 遺 伝 学 お よび 医 学 の 分 野 に お いて 多 くの動 物 種 を 対 象 に そ の 制 限 酵 素 断 片 長 多 型 (RFLP)

の分析が行われて きた1∼7).

野生動物 を対象 としたmtDNAに

ついての研究 では,

生体か らの材料採取 が困難 で, 大半 は事故死体やあ る程

度保存 して おいた古 い材料 を利 用せ ざるをえない場合が

あ る. また家 畜の先天性異 常を研究す る場合 には, 死体

や屠 体か らの臓器を材料にす る場合 も多い と考え る. し

か し, いままで のmtDNAに

関す る報告は, 材料 の入

手が比較的 容易 な動物 で, しか もRFLP分

析へ の物理

的切 断やmtDNA変

性 などの影響 を避 けるため, 新鮮

材料 か ら抽 出したDNAに

つ いて検討 された ものであ

Preparation of mitochondrial DNA from long-term preserved and accident carcass organs in animals. Michinari Yokohama, Taisuke Yamazaki, Yuichi Kameyama, Yoshirou Ishijima; 東 京 農 業 大 学 生 物 産 業 学 部 動 物 資 源 学 研 究 室

Correspondence address: Michinari Yokohama, Laboratory of Animal Resources, Faculty of Bioindustry, Tokyo University of Agriculture, 196, Aza-Yasaka, Abashiri 099-24, Japan.

(受 付 1993年5月17日, 受 理 1993年9月8日)

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-19-生 物 物 理 化 学 1994; 38: 20 る. 短 期 間 (21日) の 冷 凍保 存 につ いて は ブ タ 肝 臓 で 検 討 され て い る もの の8), 長 期 間 冷 凍 保 存 し た臓 器, 放 血 が 不 完 全 な屠 体 臓 器 か ら抽 出 したmtDNAの 分 析 につ いて は あま り検 討 され て い ない. そ こで, 本 研 究 で は試 料 採 取 の条 件 が 劣 悪 な場 合 で も RFLP分 析 が 可 能 なmtDNAの 抽 出 が 可 能 で あ るか 調 べ る た め, 偶 発 的 に生 じた 動 物 の事 故 死 体 や 生 産 目的 に 屠殺 し た死 体 な ど を用 い, 採 取 した 臓 器 の保 存 期 間 や 採 取 材 料 の状 態 に よ るmtDNA抽 出 量 の 差 異 お よ び放 血 が不 完 全 な屠 体 臓 器 か らのmtDNA精 製 につ い て 検 討 し た. 材 料 お よ び 方 法 1. 供 試 動 物 肝 臓 を 採 取 し た 動 物種 は, ブ タ1頭 (品種 不 明), 北 極 キ ツ ネ Alopex lagopus 2頭 (青キ ツ ネ と白 キ ツ ネ), 赤 キ ツ ネ Vulpes fulva 4頭 (ギ ンギ ツオ), ミ ン ク Mustela vison 16頭 (白色 系13例, 淡 褐 色 系3例), ウ サ ギ7頭 (雑種), ラ ッ ト4頭 (SD系), 二 ホ ン ジ カ

Cervus nippon 4頭 (エゾ シ 力, Cervus n. yesoensis

3例, ヤ ク シ 力, Cervus n. yakushimae 1例) お よ び 重 朝 馬7頭 で あ った. 2. 採 取材 料 お よ び保 存 法 ブ タ (屠場 屠 体) とウサ ギ は完 全 に放 血 後 に肝 臓 を摘 出 し た. ミ ンク と ラ ッ トは放 血 群 と未 放 血 群 (頸椎 脱 臼 に よ る 屠 殺 後 室 温 に1時 間 放 置) を 設 け 肝 臓 を 摘 出 し た. キ ツ ネ は飼 育 農 家 にて パ コ マ液 を心 臓 に注 入 し屠 殺 後, 剥 皮 処 理 した も のか ら肝 臓 を摘 出 した. シカ は 事 故 死 (交通 事 故 や 窒 息 死) 後 数 十 時 間 が 経 過 した 屠 体 か ら 肝 臓 を摘 出 した. ウ マ の 精 巣 は去 勢 摘 出 した 後-20℃ で い った ん冷 凍 した も の を入 手 した. 採 材 した 肝 臓 お よ び精 巣 は ホ モバ ッフ ァーで 洗 浄 後, ビ ニ ール 袋 に 入 れ 密 閉し-80℃にて最長1年4力月間保存し た. 3. mtDNAの 精 製 お よ び検 出法 mtDNAの 精 製 とサ ブ マ リ ン泳 動 法 に よ るDNA分 析 は Powell お よび Zuniga2), な らび に三 上 ら4)の方 法 に準 じて 行 った. 4. 制 限 酵 素 処 理 使 用 した 制 限 酵 素 は, ApaI,BamHI,EcoRI,EcoRV, HindIII,scaIお よ びStuIの7種 類 で あ った. 5. mtDNA量 の測 定 mtDNAの 抽 出 量 お よ び 純 度 は, 自 記 分 光 光 度 計 (BECKMAN DU-65) を 用 い, 230∼330nmの 連 続 波 長 で 測 定 し, 280nm/260nmの 吸 光 度 比 で求 め た. 結 果 お よ び 考 察 Fig. 1に は, 長 期 保存 し た 各種 動 物 の肝 臓 お よ び精 巣 か ら分 画 し た ミ トコ ン ド リァDNA (mtDNA) の吸 光

Fig. 1. UV absorbance of mtDNA obtained from preserved organs (liver and testis) less than-80℃.

○---○ Rabbit (12 months, two-fold)

●---● Yeso Sika deer (12 months) □---□ Rat (12 months)

■---■ Pig (12 months) △---△ Silver fox (9 months, two-fold) ▲---▲ Horse (3 months, testis)

?---? American mink (16 months) -Pig (0 day)

(3)

Jpn J EIectroph 1994; 38: 21

度 曲 線 パ タ ー ンを 示 した. 実 線 で示 し た の は, ブ タ 肝 臓 を 摘 出 した 直 後 にmtDNAを 抽 出 し た試 料 で理 想 的 な 吸 収 極 大 (260nm) を示 して い た. この ブ タ肝 臓 を-80 ℃で1年間保存した後に精製した場合のmtDNAの 吸 収 極 大 は270nm付 近 で, そ の 回 収 量 は47μg/10gと 少 な く, 純 度 が1.5で 蛋 白質 含 量 が 多 い試 料 で あ った が, RFLP分 析 は 可 能 で あ った. ウサギでは, -80℃で1年間保存した試料から精 製 したmtDNA量 は240μg/10gで, そ の 純 度 が1.5と 低 く蛋 白 質 含 量 の 多 い 試 料 で あ った が, DNAの 泳 動パ タ ー ンお よび制 限 酵素 切 断片 パ タ ー ンは 臓 器 摘 出 後2日 間 冷 凍 保存 した もの と差 異 は な か った. ま た ウサ ギ の材 料 は シ カ と ミ ン クの 場 合 と同 様 に230nmの 吸 光 度 値 が 高 い 値 を 示 した. これ は 保存 日数 が 多 くな るに つ れ て 増 え る傾 向 に あ った. ラ ッ ト肝 臓 で は, 1年 聞 の保 存 (-80℃) で も260nm 付 近 に 吸 収 極 大 が 得 られ, 純 度 は1.9で や やRNA成 分 含 量 が 高 か った が, 回収 量 は332μg/8gで 多 か った. ま た ラ ッ トで は 事 故 動 物屠 体 か らの 試 料 採 取 を 想 定 し, 未 放 血 試 験 群 を 作 り, 死 後1時 間後 に 肝 臓 を 採 取 した も の と, 放 血 後直 ち に 採 取 し た もの との 間 に は, DNA回 収 量 お よび純 度 に ほ と ん ど 差 異 は認 め られ な か っ た. これ は後 述 す る ミ ンク肝 臓 を用 いた 試 験 で も同 じで あ っ た. 未 放 血 材 料 を用 い る場 合 は, 臓 器 の破 砕 と洗 浄 操 作 を 血液 成 分 (ヘモ グ ロ ビ ン色 素) な ど が確 認 で き な くな るま で十 分 繰 り返 す こ とが 重 要 で あ っ た. キ ツ ネ肝 臓 は いず れ も4カ 月 以 上 冷 凍 保存 した. Fig. 1に 示 し た試 料 の 回収 量 は238μg/10gで あ った が, 分 析 に 必 要 なmtDNA量 は いず れ の保 存 試 料 か らも得 ら れ た. キ ツ ネ の 場 合 は, パ コ マ液 を心 臓 注 入 し死 亡 さ せ, 毛 皮 用 の た め に剥 皮 後 採 取 して い るので, 放 血 が 不 十 分 な屠 体 を用 い た. 採 取 は屋 外 で 実 施 し た た め, 野 生 動 物 な ど の事 故 死 体 か ら採 取 す る状 況 に近 似 して い た. ミ ンク は 毛皮 用家 畜 として 飼 育 さ れて い るた め, 臓 器 を 採取 で き る時期 は高 エ ネル ギ ー飼 料 が給 餌 さ れ て い る 11∼12月 の剥 皮 期 で あ った. こ の時 期 に採 取 し た肝 臓 は い ず れ も多 くの 脂肪 沈 着 が認 め られ, 通 常 の抽 出操 作 で 回 収 したmtDNA量 は Fig. 1の 例 で は250μg/10g, 純 度 が1.89でRNAの 多 い 試 料 で あ った. ま た7例 (1カ月-80℃で保存) のミンク肝臓から分離し た mtDNAの 純 度 は1.81∼1.97で いず れ もRNAの 多 い 試 料で, そ の泳 動 像 (cccDNAお よびocDNAパ タ ー ン) は不 鮮 明で あ った. な お, ミ ンク の肝 臓 は脂 肪 が 多 か った の で 脂肪 な ど の不 純 物 の除 去 操 作 を2回 繰 り返 し た 結 果, 泳 動 パ タ ー ンは 鮮 明 に な った が そ の 回収 量 が 約 7割 減 少 した. ウマ の 去勢 手 術 に よ って 得 た精 巣 は肝 臓 の場 合 とは 異 な り, 実質 組 織 が少 な い た め ホ モ ナ ジイ ズ操 作 が や や 困 難 で あ った. 精 巣 は肝 臓 に 比 べmtDNAの 回 収 量 が 少 な い と報 告 され て い るが8), ハ サ ミに よる組 織 破 砕 を 丁 寧 に 実 施 す る こ とに よ り3力 月 間 保存 し た精 巣 か らで も 675μg/10gのDNA量 を 回 収 す る こ とがで きた ので, ウマ のmtDNA分 析 に は 肥 育 目的 に去 勢 した 精 巣 で も 有 効 に利 用 で き る こ とが わ か った. ま た, シ 力 肝 臓 か らのmtDNA抽 出 に は, 事 故 死 後 少 な く と も数 十 時 間 経 過後 に 摘 出 し た材 料 を さ ら に1年 間 冷 凍 保存 し て 用 い た. そ の 吸 光 度極 大 は260∼270nm に 得 られ た が (Fig. 1), mtDNA量 は119μg/10gで, そ の 純 度 が1.7で あ った. シ カ の 場合 は, いず れ も事 故 死 体 を 用 い てDNAを 精 製 した もの で, 8日, 12日 お よび4カ 月 間 保存 した 後 で 抽 出 した が, そ の純 度 は い ず れ も1.7付 近 で あ った. Fig. 1に 示 し た試 料 は, 保存 日数 や動 物 種 も異 な るが そ の 平 均mtDNA回 収 量 は318±153μg/10gで, 純 度 は1.68∼1.93で あ った. 吸 収 極 大 は 大部 分260nm付 近 に 集 中 して お り動 物 種 の 差 は ほ とん ど認 め られ な か っ た. 回収mtDNA量 の標 準誤 差 が大 きか った 点 は お も に 実 験 者 に よ る技 術 上 の 差異 に よ る もの と考 え られ た. シ カ な ど の よ うな 野生 動 物 の場 合 は, 研 究 遂行 の た め 一 時的 に捕 獲 し採 材 す る こ とは一 般 的 に不 可 能 であ る. ま た北 海 道 に お け るエ ゾ シ カ な ど の野 生 動 物 は車 な ど に よ る事 故 死 例 が 多 い が, これ らの大 半 は学 術 的 材 料 とし て活 用 さ れ る こ とな くそ の ま ま廃 棄 され て い る. 今 回 の 調 査 で は, 事 故 死 体 か らの材 料 を さ らに長 期 間 保存 した 場 合 で も十 分mtDNA分 析 が 可能 で あ る こ とを 示 した. Fig. 2は, 各 種 動 物 臓 器 か ら回収 したmtDNAの 泳動 像 で あ る. こ こに 示 した5種 の 動 物 で は, いず れ も開 環 状

のocDNA (open circular DNA) と閉 環 状 のcccDNA

(covalently closed circular DNA) 域 を示 す 明 瞭 な2

本 のDNAバ ン ドが得 られ た. 動 物 種 間 でDNA分 子

量 が 若 干異 な って お り, ま たcccDNAとocDNAバ ン

ドの濃 度 間 に も差 異 が あ った. No.4個 体 はocDNAが

No. 1とNo. 3はcccDNAバ ン ドが(濃く検 出 され,

No. 2個 体 で は両DNAバ ン ドが ほぼ 同 じ濃 度 を 示 し て い た. な お, ミ ンク お よび ウマ の場 合 は不 純 物 の 混入 が 多 か った た め, Fig. 2に 示 した よ うな 明 瞭 な2本 バ ン ドのパ タ ー ンは 得 られ な か った. これ らのmtDNA試 料 を7種 類 の制 限 酵 素 で 切 断 し,

(4)

-21-生 物 物 理 化 学 1994; 38: 22 そ の泳 動 パ ター ンから 保 存 期 間 や 採材 条 件 の影 響 に よ る 物 理 的 切 断が あ るか 否 か 調 べ た. Fig. 3は ブ タ肝 臓 か ら 回 収 したmtDNAをHindIIIで 切 断 し たパ タ ー ンで, 新 鮮 材 料 お よび1年 間 保 存 し た材 料 との間 に は差 異 が な く, 長 期 間 保存 に よ る影 響 は認 め られ な か った. これ と 同 じ成 績 が 今 回供 試 し た全 材 料 を7種 類 の酵 素 で 処 理 し たRFLPパ タ ー ンで も得 られ た. またocDNAお よび cccDNAパ タ ー ンが 不 鮮 明で あ った ミ ンク お よ び ウマ のmtDNA試 料 で も, 酵 素 処 理 す る こと に よ って 薄 い バ ン ドで は あ っ た が 鮮 明 な切 断 片パ ター ンが 観 察 で き た. 以 上 の よ うに, 通 常 で は 研 究 材 料 とし て 利 用 され る こ との な い 動 物屠 体 な ど を 用 い そ の臓 器 を摘 出 しmtDNA

を 分 離 精 製 し た 結 果, RFLP分

析 に 十 分 な純 度 の

mtDNAが

精製 できた. これ は, 野生動物などの事故死

体臓器を細胞遺伝学的研究の材料 として十 分活用 し得 る

てとを示唆 した成績であ った. 今後は, 貴 重な野生動物

の事故死体材料の保存 が組織 的に実施 され, 各研究分野

へ の協力が容 易になる ような体 制が確立されることを望

む.

本研究実施に当た り,

mtDNAの

精製 およびRFLPの

検出につ いて指導 を賜 りました, 農 林水産省畜産試験場

の小 松正憲および大西彰技官 に厚 く御礼 申し上げます.

Fig. 2. Agarose gel electrophoretic patterns of

mtDNA prepared from preserved livers.

Remarks: 1 (pig), 2 (Yeso Sika deer), 3 (rabbit),

4 (rat), 5 (Arctic fox) and marker (λDNA-Hind III)

Fig. 3. Hind III cleavage patterns of mt-DNA prepared from preserved livers stored for var-ious lengths of time.

Remarks: 1 (0 day), 2 (3 months), 3 (6 months), 4(12 months) and marker (λDNA-Hind III)

文 献

1) 宝 来 聰. ミ ト コ ン ド リ アDNAか ら 見 た 日 本 人. 遺 伝 1981; 40: 202-9.

2) Powell JR, Zuniga MC. A simplified proce-dure for studying mtDNA polymorphism. Bio-chew Genet 1983; 21: 1051-5.

3) Buzzo K, Fouts DL, WolstenHolme DR. Eco-RI cleavage site variants of mitochondrial DNA molecules from rats. Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75: 909-13.

4) 三 上 仁 志, 大 西 彰, 小 松 正 憲, 大 谷 敏 明, 関 哲 夫, 五 十 嵐 真 哉. 中 国 豚 の ミ ト コ ン ド リ アDNA 制 限 酵 素 切 断 型. 日 豚 会 誌 1988; 25:181-5. 5) Bell BR, Mcdaniel BT, Robison OW. Effects

of cytoplasmic inheritance on production traits of dairy cattle. J Dairy Sci 1988; 68: 2038-51. 6) Bibb MJ, Van Etten RA, Wright CT, Walberg

MW, Clayton PA. Sequence and gene organi-nation of mouse mitochandrial DNA. Cell

1981; 26: 167-80. 7) 林 純 一. ミ トコ ン ド リア遺 伝 子 疾 患 の 体 細胞 遺 伝 学. 細 胞 工 学 1992; 11: 31-9. 8) 坂 上 正 行, 田 中一 栄, 鈴 木 伸 一, 坂 井 活 子, 向 山 明 孝. ブタ 保 存 臓 器 か ら の ミ 下コ ン ド リアDNA の精 製 とそ のRFLP分 析. 日 畜会 報 1991; 62: 125-34.

8種 類の動物種から採材 し, 最 長1年4カ 月間保存 し

た臓器か らのmtDNA抽

出量 と抽 出されたDNAの

度の検定お よび泳動パ ター ンの分 析を実施 し, 保存期間

や採材条件がmtDNAの

性状 に及 ぼす 物理的影響 を調

べた, その結 果, 長 期間保存 した動物臓器 と新鮮材料 間

のmtDNA回

収量 および純 度には有意 な差異は認 め ら

れなかった. また制 限酵素に よって切断したDNA断

片 の泳 動パター ンにも長 期間の冷 凍保存 による物理 的影

響 は認 め られ なか った.

(5)

-22-Jpn J Electroph 1994; 38: 23

交 通 事 故 な ど に よ って死 亡 し た ニ ホ ンジ カ の肝 臓 か ら も変 性 の な いmtDNAが 回 収 で き, そ の臓 器 を長 期保 存 し た場 合 で も, mtDNAの 回収 量 や純 度 に大 きな影 響 は認 め られ な か っ た. ミ トコ ン ド リア分 画 に 当 た って 未 放 血 や 脂 肪 の 多 い材 料 を 用 い る とき は, 不 純 物 (蛋白質 や 脂 肪) を 除 去 す る た め フ ェノ ー ルや ク ロ ロ ホル ム の 処 理 操 作 を 繰 り返 し行 う よ り も, ハ サ ミに よ る破 砕 操 作 とホ モ バ ッフ ァー に よ る洗 浄 を丁 寧 に繰 り返 し行 うこ と に よ ってDNA分 析

に使え るmtDNA量

が よ り多 く回収で きた.

野生 動物 などの事故死体 お よび屠体 は採取材料の条件

として劣悪 であ るが, その材 料はmtDNAを

用いた細

胞遺伝学的研究に も活 用で き る こ とが 示 され た. また

事故死体か ら摘 出 した臓器を長期間冷凍保存 した場合で

も, RFLP分

析が可能なmtDNA量

を十分 に回収で き

た ことか ら, 遺伝子資源 として も貴重な野生動 物の事故

死屠体が細胞遺伝学的研究へ有効に活用で きることが示

唆で きた.

Fig.  1.  UV  absorbance  of  mtDNA  obtained  from  preserved  organs
Fig.  2.  Agarose  gel  electrophoretic  patterns  of mtDNA  prepared  from  preserved  livers.

参照

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