脳ペリサイトをめぐる脳保護と再生
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(2) 図１㻌 傷害誘導性神経幹細胞 （Injury-induced Neural Stem Progenitor Cells: iNSPC). 脳循環代謝 第 26 巻 第 2 号. Ａ㻌. Ｂ㻌 PDGFRb/nestin. 大脳皮質梗塞. 培養. MACS for PDGFRb. 㻯㻌. 虚血ペリサイト（iPC）. 図２㻌. iNSPC. 図 1．傷害誘導性神経幹細胞（Injury-induced Neural Stem Progenitor Cells: iNSPC）. ヒトペリサイトの低酸素・低グルコース負荷による傷害誘導性神経幹細胞への脱分化. Ａ㻌. bFGF + LIF + OGD. ヒトペリサイト (hPC) Sox2(-). Ｂ㻌. ヒトiNSPC (OGD-hPC) Sox2(+). hPC OGD(-) OGD(+). MAP2. 図 2．ヒトペリサイトの低酸素・低グルコース負荷による傷害誘導性神経幹細胞へ の脱分化. るうえに血管周囲に存在して PDGFRβ や NG2 といっ たペリサイトマーカーを発現することから，ペリサイ. かの刺激を受けて脱分化し，多分化能を獲得した幹細 ニューロン㻌 胞である可能性が示唆される．. トを起源とする神経幹細胞ではないかと推測してい た．実際，脳梗塞巣から磁気細胞分離法（MACS）で PDGFRβ 陽性細胞を選択的に抽出し培養するとニュー. 5．正常ヒトペリサイトは低酸素・低グルコー ス負荷で傷害誘導性神経幹細胞に脱分化する. ロスフィア様の細胞塊（Spheroid）の形成を介して神経 幹細胞を作製することに成功した13, 14） （図 1, A∼C）．. そのことを証明するためにヒトペリサイト株（Pri-. したがって，iNSPC の起源のひとつはペリサイトであ. mary human brain pericytes; hPC, ACBRI-499, Cell Sys-. ることが明らかとなった． このことは，脳傷害時にペ. tems）を用いて，その特性と擬似虚血負荷である低酸. リサイト自身の再生能を介した脳修復が期待できるこ. 素（1％）・無グルコース（oxygen-glucose deprivation;. とを意味する．. OGD）負荷の影響を検討した15） （図 2）．この hPC は継 代を重ねた培養細胞であり PCR にて Klf4 や c-myc を. 4．虚血ペリサイト（ischemic pericyte; iPC）. 発現していたが，Sox2 は発現しておらず，分化培地. これまでの報告や我々の研究からもわかるように，. 荷後 2 日目にはそれまでの線維芽細胞様から球形の細. ペリサイトが多分化能を持つ細胞であることは明らか. 胞に形態変化を起こし，同時に Sox2 の発現が認めら. である．しかし，なせそのような能力を有しているの. れ る よ う に な り（図 2A），Tuj1 や MAP2 と い っ た. であろうか．iNSPC の遺伝子解析をすると，iPS 作製. ニューロンマーカーも発現した（図 2B）．すなわち，. にても Tuj1 の産生は見られなかった．しかし OGD 負. に必要な山中 4 因子のうち，Oct4 を除く Sox2 と Klf4,. OGD 負荷をかけた hPC（OGD-hPC）は iPCs/ 虚血ペリ. c-myc を発現していることが判明しており，幹細胞と. サイトと類似の特性を持ち，Sox2 発現とともに Neural. しての性質を持っている．しかしペリサイトが多く含. lineage を獲得したと考えられる．. まれているはずの正常脳組織にはこれらの遺伝子発現. 6．虚血ペリサイトと iNSPC の関係. はなく，また Spheroid も形成されない．このことは， 正常のペリサイトからは傷害誘導性神経幹細胞はでき ず，虚血負荷がかかった組織のペリサイト，すなわち. 一方，iPC の遺伝子解析から，PDGFRβ 陽性細胞の. 虚血ペリサイト（ischemic pericyte; iPC）のみが多分化. 抽出直後はニューロンマーカーの発現は弱く，むしろ. 能を持つことを示唆している．すなわち，iPC は何ら. CDH5，CD105，CD106 といった間葉系マーカーの発. ─ 146 ─.
(3) 図３㻌 脳ペリサイトをめぐる脳保護と再生. 虚血ペリサイト（iPC）の間葉系細胞と神経系細胞への分化 Ａ㻌 Mesenchymal Angioblastic Transition (MAT). Ｂ㻌 ECM. Ｃ㻌 MatriGel. Ｄ㻌. Tube formation. 血管内皮細胞. CD31. 1st Spheroid PDGFRb+. Mesenchymal Epithelial Transition (MET). Ｇ㻌. Ｆ㻌. Tuj1/Iba1. Ｅ㻌 NCM. ミクログリア. Neurosphere. MAP2. ニューロン. 図 3．虚血ペリサイト（iPC）の間葉系細胞と神経系細胞への分化. 現が強いことがわかっている．この細胞を血管系に誘. る18, 19）．iPC-spheroid を作製早期に神経系培地で分化. 導する培地で培養すると Mesenchymoangioblast を経. させると，Iba1 陽性のミクログリアに分化した（図. て ，Flk1 や CD31 といった血管系マーカーを発現. 3G）．脳梗塞 3 日目には梗塞巣内の Iba1 陽性ミクログ. 16）. し，CD31 陽性の血管内皮細胞に分化させることがで. リアはほとんど消失するが，残存する Iba1 陽性細胞. きた（図 3A∼D）．このことから，iPC は血管内皮細胞. は血管壁に存在し，これが PDGFRβ 陽性であること. に分化する能力のあることが明らかとなった．この. もわかっている．これらの所見から iPC はミクログリ. iPC を神経系に誘導する培地で培養すると，発現遺伝. アにも分化する可能性がある．. 子は間葉系マーカーの減少に伴い，Sox2, MAP2 の発. 以上，まとめると. 現増強と，GFAP, Aquaporin4, O4 といった神経系マー. 1．虚血ペリサイトは MAT で Mesenchymoangioblast を 経て血管内皮細胞になる．. カーの新たな発現が見られるようになった．このこと は，iPC は当初間葉系優位な幹細胞であったものが，. 2．虚血ペリサイトは MET を経て iNSPC になる．. MET（mesenchymal-epithelial transition） と類似の機構. 3．虚血ペリサイトはミクログリアになる．. 17）. を介して神経系へ転換したと推測される（図 3E, F）． この中で Sox2 の役割を検討するため，Sox2/GFP 発現. iPS に代表されるように，c-myc や Klf4, Sox2, Oct3/4. レンチウイルスを用いて Sox2 強制発現 iPC を作製. などの外因性の転写因子の導入が成体の体性細胞を脱. し，その遺伝子発現を検討すると，Sox2 発現ととも. 分化して幹細胞にすることはよく知られている．ペリ. に MAP2 や Mash1，Neurogenin2 と ニ ュ ー ロ ン マ ー. サイトにも同様に Sox2 の強制発現により Neural lineage. カーの発現が増強した．反対に siRNA による Sox2 の. への転換が促進されるという報告がある20）．しかし，. Knock down は iPC の MAP2 発現を減弱せしめた．こ. 種々の臓器の傷害後の再生過程では，ある細胞が自然. れらの結果により，Sox2 が本来間葉系である虚血ペ. に脱分化して幹細胞化するという事実も報告されるよ. リサイトを神経系へ誘導することが示唆された14）．. うになってきた21, 22）．本研究も含め，内因性の体性細 胞が生理的機序に基づいて多能性幹細胞に転換するの. 7．ペリサイトからのミクログリア産生. であれば傷害組織にとっては極めて都合が良いと思わ れる．. 前述したようにペリサイトのマーカーとしては. 本稿で述べたように，虚血ペリサイト（iPC）は単な. PDGFRβ や NG2, CD146（MCAM）, αSMA（α smooth. る血管細胞ではなく，in vitro では神経幹細胞や，血管. muscle actin）等がある．iPC からなる Spheroid を観察. 細胞，ミクログリアへの分化能を有する多能性幹細胞. すると，これらのほとんどが NG2 陽性である．NG2. である．これらは in vivo では脳虚血などの負荷に. は一方では OPC（oligodendrocyte precursor cell）ある. よって自然に生まれると考えられる．また，ヒト脳梗. いはミクログリアのマーカーとしても知られてい. 塞でも産生されることが示唆され23），梗塞脳での役割. ─ 147 ─.
(4) 図４㻌 虚 血 ペ リ サ イ ト （ i P C ）脳循環代謝 第 をめぐる脳修 機 構2 号 26復 巻 第 アストロサイト. 血管周皮細胞 （ペリサイト）. iPC. 脳血管. ミクログリア ニューロン 血管内皮細胞. Neurovascular Unit. オリゴデンドロサイト. 図 4．虚血ペリサイト（iPC）をめぐる脳修復機構. は今後解明されることが期待される．脳梗塞患者の. 838, 1998. iPC 研究が進めば BBB/NVU をはじめとする脳組織の. 8） Farrington-Rock C, Crofts NJ, Doherty MJ, Ashton BA,. 再構成をめざした神経再生療法が可能となるかもしれ. Griffin-Jones C, Canfield AE: Chondrogenic and adipo-. ない（図 4）．. genic potential of microvascular pericytes. Circulation 110: 2226–2232, 2004 9） Dore-Duffy P, Katychev A, Wang X, Van Buren E: CNS. 文 献. microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell. 1） Mignone JL, Kukekov V, Chiang AS, Steindler D, Enikolopov G: Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP. activity. J Cereb Blood Flow Metab 26: 613–624, 2006 10） Karow M, Sánchez R, Schichor C, Masserdotti G, Ortega F,. transgenic mice. J Comp Neurol 469: 311–324, 2004. Heinrich C, Gascón S, Khan MA, Lie DC, Dellavalle A,. 2） Louissaint A Jr, Rao S, Leventhal C, Goldman SA: Coor-. Cossu G, Goldbrunner R, Götz M, Berninger B: Repro-. dinated interaction of neurogenesis and angiogenesis in. gramming of pericyte-derived cells of the adult human. the adult songbird brain. Neuron 34: 945–960, 2002. brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell 11: 471–. 3） Arvidsson A, Collin T, Kirik D, Kokaia Z, Lindvall O: Neuronal replacement from endogenous precursors in the. 476, 2012 11） Nakagomi T, Taguchi A, Fujimori Y, Saino O, Nakano-. adult brain after stroke. Nat Med 8: 963–970, 2002. Doi A, Kubo S, Gotoh A, Soma T, Yoshikawa H,. 4） Taguchi A, Soma T, Tanaka H, Kanda T, Nishimura H,. Nishizaki T, Nakagomi N, Stern DM, Matsuyama T: Iso-. Yoshikawa H, Tsukamoto Y, Iso H, Fujimori Y, Stern. lation and characterization of neural stem/progenitor cells. DM, Naritomi H, Matsuyama T: Administration of CD34+. from post-stroke cerebral cortex in mice. Eur J Neurosci. cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model. J Clin Invest 114: 330–338, 2004. 29: 1842–1852, 2009 12） Nakagomi N, Nakagomi T, Kubo S, Nakano-Doi A, Saino. 5） Nakano-Doi A, Nakagomi T, Fujikawa M, Nakagomi N,. O, Takata M, Yoshikawa H, Stern DM, Matsuyama T,. Kubo S, Lu S, Yoshikawa H, Soma T, Taguchi A, Mat-. Taguchi A: Endothelial cells support survival, prolifera-. suyama T: Bone marrow mononuclear cells promote pro-. tion, and neuronal differentiation of transplanted adult. liferation of endogenous neural stem cells through vascu-. ischemia-induced neural stem/progenitor cells after cere-. lar niches after cerebral infarction. Stem Cells 28: 1292– 1302, 2010. bral infarction. Stem Cells 27: 2185–2195, 2009 13） Nakagomi T, Molnár Z, Nakano-Doi A, Taguchi A, Saino. 6） Zhang J, Takahashi HK, Liu K, Wake H, Liu R, Maruo T,. O, Kubo S, Clausen M, Yoshikawa H, Nakagomi N, Mat-. Date I, Yoshino T, Ohtsuka A, Mori S, Nishibori M: Anti-. suyama T: Ischemia-induced neural stem/progenitor cells. high mobility group box-1 monoclonal antibody protects. in the pia mater following cortical infarction. Stem Cells. the blood-brain barrier from ischemia-induced disruption. Dev 20: 2037–2051, 2011. in rats. Stroke 42: 1420–1428, 2011. 14） Nakagomi T, Molnár Z, Taguchi A, Nakano-Doi A, Lu S,. 7） Doherty MJ, Ashton BA, Walsh S, Beresford JN, Grant. Kasahara Y, Nakagomi N, Matsuyama T: Leptomenin-. ME, Canfield AE: Vascular pericytes express osteogenic. geal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke. potential in vitro and in vivo. J Bone Miner Res 13: 828–. brain. Stem Cells Dev 21: 2350–2354, 2012. ─ 148 ─.
(5) 脳ペリサイトをめぐる脳保護と再生. 15） Nakagomi T, Kubo S, Nakano-Doi A, Sakuma R, Lu S,. 53: 754–768, 2006. Narita A, Kawahara M Taguchi A, Matsuyama T: Brain. 20） Karow M, Sánchez R, Schichor C, Masserdotti G, Ortega F,. vascular pericytes following ischemia have multipotential. Heinrich C, Gascón S, Khan MA, Lie DC, Dellavalle A,. stem cell activity to differentiate into neural and vascular. Cossu G, Goldbrunner R, Götz M, Berninger B: Repro-. lineage cells. Stem Cells 33: 1962–1974, 2015. gramming of pericyte-derived cells of the adult human. 16） Vodyanik MA, Yu J, Zhang X, Tian S, Stewart R, Thom-. brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell 11: 471–. son JA, Slukvin II: A mesoderm-derived precursor for mesenchymal stem and endothelial cells. Cell Stem Cell 7:. 476, 2012 21） Yanger K, Zong Y, Maggs LR, Shapira SN, Maddipati R,. 718–729, 2010. Aiello NM, Thung SN, Wells RG, Greenbaum LE, Stanger. 17） Acloque H, Adams MS, Fishwick K, Bronner-Fraser M,. BZ: Robust cellular reprogramming occurs spontaneously. Nieto MA: Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. during liver regeneration. Genes Dev 27: 719–724, 2013 22） Luz-Madrigal A, Grajales-Esquivel E, McCorkle A,. Clin Invest 119: 1438–1449, 2009. DiLorenzo AM, Barbosa-Sabanero K, Tsonis PA, Del. 18） Zawadzka M, Rivers LE, Fancy SP, Zhao C, Tripathi R,. Rio-Tsonis K: Reprogramming of the chick retinal pig-. Jamen F, Young K, Goncharevich A, Pohl H, Rizzi M,. mented epithelium after retinal injury. BMC Biol 12: 28,. Rowitch DH, Kessaris N, Suter U, Richardson WD, Frank-. 2014. lin RJ: CNS-resident glial progenitor/stem cells produce. 23） Nakayama D, Matsuyama T, Ishibashi-Ueda H, Nakagomi. Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of. T, Kasahara Y, Hirose H, Kikuchi-Taura A, Stern DM,. CNS demyelination. Cell Stem Cell 6: 578–590, 2010. Mori H, Taguchi A: Injury-induced neural stem/progenitor. 19） Yokoyama A, Sakamoto A, Kameda K, Imai Y, Tanaka J:. cells in post-stroke human cerebral cortex. Eur J Neurosci. NG2 proteoglycan-expressing microglia as multipotent. 31: 90–98, 2010. neural progenitors in normal and pathologic brains. Glia. Abstract Neuroprotection and neurogenesis by brain vascular pericytes Tomohiro Matsuyama and Takayuki Nakagomi Laboratory of Neurogenesis and CNS Repair, Institute for Advanced Medical Sciences, Hyogo College of Medicine, Hyogo, Japan Vascular pericytes (PCs) are a component of the blood-brain barrier (BBB)/neurovascular unit together with astrocytes and endothelial cells. Besides their crucial role in maintaining the BBB, increasing evidence shows that PCs have a potential to be a multipotent stem cell activity. However, their multipotency has not been considered in the pathological brain, such as after an ischemic stroke. Here, we examined whether brain vascular PCs undergoing ischemia (iPCs) have multipotential stem cell activity and differentiate into neural and vascular lineage cells to reconstruct the BBB/neurovascular unit. Using PCs extracted from ischemic regions (iPCs) from mouse brains and human brain PCs cultured under oxygen/glucose deprivation, we show that PCs developed stemness presumably through reprogramming. The iPCs revealed a complex phenotype of angioblasts, in addition to their original mesenchymal properties, and multidifferentiated into cells from both a neural and vascular lineage. These data indicate that under ischemic/hypoxic conditions, PCs can acquire multipotential stem cell activity and can differentiate into major components of the BBB/neurovascular unit. Thus, these findings support the novel concept that iPCs can contribute to both neurogenesis and vasculogenesis (neurovasculogenesis) at the site of brain injuries. Key words: cerebral infarction, pericyte, neural stem cell, neurovasculogenesis, CNS repair. ─ 149 ─.
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