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第 ４ 章   L C / M S に 用 い る M S 分 析 法 ４ ． １   よ り よ い イ オ ン 化 の 技 術   LC/MS の イ ン タ ー フ ェ イ ス は ① LC 分 離 後 の 溶 出 液 の 気 化 、 ② 試 料 の イ オ ン 化 、 ③ 大 気 圧 か ら 質 量 分 析 系 内 の 真 空 へ の 移 行 と い う 多 様 な 役 割 を 果 た し て い る 。 LC の 分 離 条 件 、 試 料 、 質 量 分 析 系 の 条 件 は こ れ ら の イ ン タ ー フ ェ イ ス の 役 割 を 妨 げ な い よ う に し な け れ ば な ら な い 。 本 マ ニ ュ ア ル は イ ン タ ー フ ェ イ ス と し て 最 近 、 主 に 用 い ら れ て い る 大 気 圧 化 学 イ オ ン 化 法 (APCI)、 エ レ ク ト ロ ス プ レ ー 法 (ESI)そ し て フ リ ッ ト FAB を 取 り 上 げ て い る 。 各 イ オ ン 化 法 の 理 論 は 2 章 に 詳 細 を 記 し た 。 本 章 で は そ れ ぞ れ の イ オ ン 化 法 に つ い て L C 分 離 条 件 に 対 す る 制 限 、 ま た イ オ ン 化 効 率 を 向 上 さ せ る た め の 工 夫 、 さ ら に イ ン タ ー フ ェ イ ス の 条 件 が イ オ ン 化 に 与 え る 影 響 に つ い て 述 べ る 。 ４ ． １ ． １   大 気 圧 化 学 イ オ ン 化 法 ( A P C I ) 4 .1.1 .1  L C 分 離 条 件 に 対 す る 制 限   LC/MS の 分 析 条 件 は L C の 分 離 条 件 、 MS 条 件 の 双 方 を 鑑 み て 、 適 切 な 条 件 を 設 定 し な け れ ば な ら な い 。 L C 分 離 の 手 法 、 ア プ リ ケ ー シ ョ ン に つ い て は 3 章 で 述 べ た 。 こ こ で は 溶 媒 、 pH 調 整 試 薬 、 イ オ ン ペ ア 剤 の APCI/MS に 与 え る 影 響 に つ い て 述 べ 、LC 分 離 の ア プ リ ケ ー シ ョ ン に 対 す る 制 限 に つ い て 記 す 。 (1)溶 媒 の 種 類   APCI は 気 相 で の 化 学 反 応 に よ る イ オ ン 生 成 法 で あ る の で 、 イ オ ン 化 に 関 し て は 溶 媒 の 種 類 、 性 質 に よ る 影 響 は ESI に 比 べ て 小 さ い 。   一 般 的 に 用 い ら れ る 溶 媒 は メ タ ノ ー ル 、 ア セ ト ニ ト リ ル 、 水 で あ る 。 有 機 溶 媒 100% あ る い は 水 100%を 溶 媒 と し て 用 い る こ と も 可 能 で あ る 。 と く に メ タ ノ ー ル ー 水 系 、 ア セ ト ニ ト リ ル ー 水 系 が 広 く 使 用 さ れ て い る 。 ESI と 比 較 し て 使 用 で き る 溶 媒 の 種 類 が 多 く 、 極 性 の 低 い 溶 媒 で も 使 用 可 能 で あ る 。   と く に 使 用 す べ き で な い 溶 媒 は 高 沸 点 、 高 粘 度 の も の で あ る 。 高 沸 点 、 高 粘 度 な 溶 媒 を 用 い る と 試 料 へ の イ オ ン キ ャ リ ア ー と な る 溶 媒 分 子 の 気 化 が 進 ま ず 、 試 料 の イ オ ン 化 が 起 こ り 難 く な る 可 能 性 が あ る 。 表 4.1.1-1 に LC に 用 い ら れ る 種 々 の 溶 媒 の 粘 度 と 沸 点 を ま と め た 。 一 般 的 に 水 （ 粘 度 ； 1.00cp、 沸 点 ； 100℃ ） よ り 、 粘 度 、 沸 点 が 高 い 溶 媒 の 使 用 は 望 ま し く な い 。 ま た 、 詳 細 は 後 述 す る が 、 溶 媒 の 気 化 を 充 分 に 進 行 さ せ る た め に 脱 溶 媒 の た め の 温 度 条 件 を 溶 媒 の 種 類 に よ り 変 化 さ せ る 必 要 が あ る 。

表 4.1.1-1    LCに 用 い る 溶 媒 の 粘 度 と 沸 点a 溶 媒 粘 度b_{( ρ /mPas) 沸 点 （ ℃ ）} n-ペ ン タ ン 0.23 36 イ ソ オ ク タ ン 0 . 5 99 ヘ キ サ ン 0.31 69 n-デ カ ン 0.92 174 シ ク ロ ヘ キ サ ン 1 . 0 81 シ ク ロ ペ ン タ ン 0.47 50 二 硫 化 炭 素 0.37 46 四 塩 化 炭 素 0.97 77 p-キ シ レ ン 0.64 140 イ ソ プ ロ ピ ル エ ー テ ル 0.37 68 ト ル エ ン 0.59 111 ベ ン ゼ ン 0.65 80 エ チ ル エ ー テ ル 0.23 35 ク ロ ロ ホ ル ム 0.57 62 塩 化 メ チ レ ン 0.44 40 メ チ ル イ ソ ブ チ ル エ ー テ ル 0.54 118 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン 0 . 4 66 二 塩 化 エ チ レ ン 0.79 57 メ チ ル エ チ ル ケ ト ン 0 . 4 80 ア セ ト ン 0.32 56 ジ オ キ サ ン 1.54 107 酢 酸 エ チ ル 0.45 77 酢 酸 メ チ ル 0.37 57 ジ メ チ ル ス ル ホ キ シ ド 2.24 189 ア ニ リ ン 4 . 4 184 ジ エ チ ル ア ミ ン 0.38 56 ニ ト ロ メ タ ン 0.67 101 ア セ ト ニ ト リ ル 0.37 82 ピ リ ジ ン 0.94 116 イ ソ プ ロ パ ノ ー ル 2.39 82 n-プ ロ パ ノ ー ル 2 . 2 97 メ タ ノ ー ル 0.61 78 エ タ ノ ー ル 1.19 64 エ チ レ ン グ リ コ ー ル 1 9 . 9 198 酢 酸 1.22 118 水 1.00 100 a 化 学 便 覧   日 本 化 学 会 編 な ど を 参 考 に し た 。 b 粘 度 は 20° C に お け る 値 を 示 し た 。 (2)pH 調 整 試 薬 の 影 響   3 章 で も 述 べ た よ う に L C 分 離 条 件 に お い て p H は 重 要 な フ ァ ク タ ー で あ る 。 移 動 相 へ の 様 々 な pH 調 整 試 薬 の 添 加 が 試 料 の よ り よ い 分 離 を 図 る た め に 用 い ら れ て い る 。 LC/APCI/MS へ の p H 調 整 試 薬 の 影 響 、 適 用 に つ い て 以 下 に 記 す 。

  リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム や 酢 酸 ナ ト リ ウ ム な ど の 不 揮 発 性 の p H 調 整 試 薬 は LC/APCI -MS へ 基 本 的 に 適 用 で き な い 。 こ れ は 、 こ れ ら の p H 調 整 試 薬 が イ オ ン 導 入 口 で あ る ス キ マ ー コ ー ン や 噴 霧 部 に 吸 着 し 、 析 出 す る こ と に よ り 、 目 詰 ま り を 生 じ さ せ 、 イ オ ン の 生 成 、 あ る い は 移 動 を 妨 げ る た め で あ る 。 さ ら に 不 揮 発 性 物 質 は 沸 点 上 昇 効 果 を 持 ち 、 溶 媒 の 沸 点 を 上 げ 、 溶 媒 の ス ム ー ズ な 気 化 に 悪 影 響 を 与 え る 恐 れ が あ り 、 こ の 点 か ら も 使 用 に 適 さ な い 。   揮 発 性 が あ る p H 調 整 試 薬 と し て LC に よ く 使 用 さ れ る ア ミ ン 類 は LC/APCI/MS 系 中 へ 添 加 す る と 、 そ の イ オ ン 化 効 率 が 非 常 に 高 い た め に 装 置 に 対 す る 汚 染 の 影 響 が 大 き い 。 こ の た め 、 そ の 使 用 は 避 け る べ き で あ る 。 一 方 、 ギ 酸 ア ン モ ニ ウ ム や 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム と い っ た 揮 発 性 の 緩 衝 剤 、 ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 、 水 酸 化 ア ン モ ニ ウ ム な ど 揮 発 し や す い 酸 ・ 塩 基 は 使 用 が 可 能 で あ る 。 最 も 一 般 的 に 用 い ら れ て い る の は 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム で あ る 。 な お 酢 酸 系 の pH 調 整 試 薬 の 使 用 は 酢 酸 イ オ ン と 正 に 荷 電 し た 溶 質 と の 間 で の 非 極 性 錯 体 の 形 成 に よ り カ ラ ム 効 率 が 低 下 す る こ と が あ る の で 注 意 が 必 要 で あ る 。 ま た p H 調 整 試 薬 が マ ス ス ペ ク ト ル に 与 え る 影 響 と し て は 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム な ど ア ン モ ニ ウ ム 塩 を 用 い た 場 合 に [M+NH4]+イ オ ン が 検 出 さ れ る こ と が 挙 げ ら れ る 。 表 4.1.1-2   pH 調 節 試 薬 の 種 類 と そ の p H 域 な ら び に APCI-MS へ の 適 用 性 試 薬 名 pH域 LC-APCI-MS へ の 適 用 性 緩 衝 液 H3PO4/KH2PO4/K2HPO4/ K O H 2∼ 11 不 揮 発 性 で あ り 、 不 適 正 。 酢 酸 /酢 酸 ナ ト リ ウ ム 3∼ 6 不 揮 発 性 で あ り 、 不 適 正 。 酢 酸 /酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム / N H4O H 5∼ 9 使 用 可 。 炭 酸 水 素 ア ン モ ニ ウ ム /炭 酸 ア ン モ ニ ウ ム /NH4O H 8∼ 10 不 揮 発 性 で あ り 、 不 適 正 。 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム /炭 酸 ナ ト リ ウ ム / N a O H 9∼ 11 不 揮 発 性 で あ り 、 不 適 正 。 H3BO3/Na3BO3/ N a O H 7∼ 11 不 揮 発 性 で あ り 、 不 適 正 。 酸 ・ 塩 基 ・ 塩 過 塩 素 酸 ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 1∼ 2 使 用 可 。 濃 度 0.05％ 以 下 で 使 用 。 ク エ ン 酸 2∼ 6 使 用 可 。 リ ン 酸 酢 酸 4∼ 6 使 用 可 。 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 6∼ 7 使 用 可 。 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム 不 揮 発 性 で 使 用 不 可 。 炭 酸 ナ ト リ ウ ム 不 揮 発 性 で 使 用 不 可 。 水 酸 化 ア ン モ ニ ウ ム 8∼ 10 使 用 可 。 ジ エ チ ル ア ミ ン 4 . 4∼ 6 . 4 使 用 可 で あ る が 、 装 置 の 汚 染 に 注 意 。   APCI に 使 用 が 可 能 な p H 調 整 試 薬 の 濃 度 の 上 限 は 一 般 的 に 100mM 程 度 で あ る 。 そ の 濃

度 が 感 度 に 大 き な 影 響 を 与 え る 場 合 も あ る の で そ の 適 用 に は 注 意 を 要 す る 。 p H 調 整 試 薬 と そ の pH 域 、 さ ら に APCI/MS へ の 適 用 の 是 非 に つ い て 表 4.1.1-2 に ま と め る 。   pH 調 整 試 薬 に よ る 感 度 の 変 化 に つ い て は 4.2.2 で 述 べ る 。 (3)イ オ ン ペ ア 剤   イ オ ン ペ ア 剤 は L C 分 離 に ど う し て も 必 要 な 時 以 外 は LC/APCI/MS に 使 用 し な い ほ う が い い 。 イ オ ン ペ ア 剤 使 用 の 問 題 点 は p H 調 整 試 薬 と 同 様 に 噴 霧 部 や ス キ マ ー に お け る 詰 ま り の 要 因 と な る 点 、 イ オ ン 化 し た 試 料 と イ オ ン ペ ア 剤 が 二 次 的 に 反 応 し 、 試 料 イ オ ン を 中 性 化 す る こ と が あ る 点 が 挙 げ ら れ る 。 ま た 分 析 系 に 吸 着 し や す い イ オ ン ペ ア 剤 は バ ッ ク グ ラ ン ド の 原 因 と な り や す い 点 に も 留 意 す べ き で あ る 。   イ オ ン ペ ア 剤 の LC/APCI -MS へ の 適 用 は あ ま り 例 が な い 。 イ オ ン ペ ア 剤 と し て は テ ト ラ ブ チ ル ア ン モ ニ ウ ム オ キ サ イ ド の よ う な 揮 発 性 の 塩 が APCI -MS に 適 用 可 能 で あ る と 考 え ら れ る 。 主 な イ オ ン ペ ア 剤 と そ の 分 子 量 、 LC/APCI-MS へ の 適 用 に つ い て 表 4.1.1-3 に ま と め た 。 表 4.1.1-3  イ オ ン ペ ア 剤 の 種 類 、 構 造 式 、 分 子 量 な ら び に LC-APCI-MS へ の 適 用 性 試 薬 名 構 造 式 分 子 量 LC-APCI-MS へ の 適 用 性 塩 基 性 試 料 用 1-プ ロ パ ン ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム C H₃CH₂C H₂SO₃ Na 146.14 不 揮 発 性 の た め 適 さ ず 。 1-ブ タ ン ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム C H₃(CH₂)₃SO₃N a 160.16 不 揮 発 性 の た め 適 さ ず 。 1-ペ ン タ ン ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム C H₃(CH₂)₄SO₃N a 174.19 不 揮 発 性 の た め 適 さ ず 。 1-ヘ キ サ ン ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム C H3(CH2)5SO3N a 188.22 不 揮 発 性 の た め 適 さ ず 。 1-ヘ プ タ ン ス ル ホ ン 酸 ナ ト リ ウ ム C H3(CH2)7SO3N a 202.24 不 揮 発 性 の た め 適 さ ず 。 酸 性 試 料 用 ト リ ヘ キ シ ル ア ミ ン [CH3( C H2)5]3N 269.15 装 置 汚 染 の 影 響 が 大 き く 適 さ ず 。 ト リ ヘ プ チ ル ア ミ ン [CH3( C H2)6]3N 3 1 1 . 6 装 置 汚 染 の 影 響 が 大 き く 適 さ ず 。 ト リ オ ク チ ル ア ミ ン [CH3(CH2)7]3N 353.67 装 置 汚 染 の 影 響 が 大 き く 適 さ ず 。 水 酸 化 テ ト ラ エ チ ル ア ン モ ニ ウ ム (CH3C H2)4NOH 147.26 使 用 に 適 し て い る 。 水 酸 化 テ ト ラ ブ チ ル ア ン モ ニ ウ ム [CH3( C H2)3]4NO H 259.47 使 用 に 適 し て い る 。 4 .1.1 .2 イ オ ン 化 効 率 の 向 上   APCI/MS に よ る 測 定 に お い て イ オ ン 化 効 率 の 向 上 は 直 接 、 感 度 の 向 上 に つ な が る 。 測 定 し た い 分 子 の 性 質 を ふ ま え 、 で き る だ け イ オ ン 化 効 率 の よ い 分 析 条 件 を 設 定 す る こ と が 微 量 分 析 に は 重 要 で あ る 。

  質 量 分 析 条 件 の 探 索 の 第 一 歩 は ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド か ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド か の 選 択 で あ る 。 ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド と ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド は 機 器 的 に 変 換 で き 、 簡 単 に 実 測 す る こ と が 可 能 で あ る が 、 こ こ で は ど ち ら を 選 択 す れ ば い い か の 目 安 の 付 け 方 を 述 べ る 。 次 に 、 よ り よ く イ オ ン 化 が 進 行 す る よ う な 溶 媒 の 選 択 、 条 件 さ ら に ポ ス ト カ ラ ム の 使 用 法 に つ い て 記 す 。 (1)ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド か ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド か の 選 択   APCI は 基 本 的 に 気 相 で の イ オ ン 分 子 反 応 に よ る 化 学 イ オ ン 化 法 を 利 用 し て い る 。 こ の た め 、 プ ロ ト ン 移 動 反 応 に 代 表 さ れ る 化 学 反 応 に つ い て の 知 見 が 必 要 で あ る 。 最 初 に ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド で 起 こ る 正 イ オ ン の 移 動 反 応 に つ い て 述 べ る 。   APCI の ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド で 最 も 一 般 的 に 見 ら れ る の は 次 式 の よ う な プ ロ ト ン 移 動 反 応 で あ る 。   AH+  _{+  B →   BH}+  _{+  A} こ の 反 応 が 発 熱 性 (△ G<0 ） で あ る な ら ば 、 反 応 は 拡 散 律 速 支 配 と な り 、 大 き な 反 応 速 度 係 数 が 期 待 で き る 。 す な わ ち 、 反 応 効 率 が 高 く 、 イ オ ン 化 が 進 行 し や す く な り 、 高 感 度 な 検 出 が 可 能 と な る と 考 え ら れ る 。   こ の 反 応 の エ ン タ ル ピ ー 変 化 は 分 子 A , B の プ ロ ト ン 親 和 性 の 差 に よ り 与 え ら れ る 。 す な わ ち 、 A の プ ロ ト ン 親 和 力 よ り も B の プ ロ ト ン 親 和 力 が 大 き け れ ば 、 AH+_{か ら B へ の プ} ロ ト ン 移 動 が 起 こ り 、 BH+_{が 得 ら れ る 。 APCI で は 使 用 す る 溶 媒 か ら 生 成 す る イ オ ン が こ} の 式 の AH+_{、 す な わ ち 反 応 イ オ ン と な る 。 例 え ば 移 動 相 に メ タ ノ ー ル を 含 む 溶 媒 系 で は} 主 に (CH3O H ) H+が こ の 反 応 イ オ ン と な る 。 ( ( C H3OH)2H+が 反 応 イ オ ン と な る こ と も あ る 。） こ の と き 、 メ タ ノ ー ル の プ ロ ト ン 親 和 力 は 182.1kcal/mol で あ る の で 、 イ オ ン 化 し た い 物 質 の プ ロ ト ン 親 和 力 は こ れ よ り 大 き く な け れ ば い け な い 。   分 析 の 対 象 物 質 の プ ロ ト ン 親 和 力 が 分 か っ て い る 場 合 は 希 で あ る 。 例 え ば 含 酸 素 、 硫 黄 化 合 物 な ど の プ ロ ト ン 親 和 力 は 水 (1648kcal/mol) と ア ン モ ニ ア (202.3kcal/mol) の 中 間 く ら い で あ り 、 含 窒 素 化 合 物 の プ ロ ト ン 親 和 力 は ア ン モ ニ ア よ り 大 き い 。 付 録 に 様 々 な 物 質 の プ ロ ト ン 親 和 力 、 電 子 親 和 力 の デ ー タ 検 索 法 を 掲 載 し た 。   一 方 、 ネ ガ テ ィ ブ イ オ ン モ ー ド で は A- +  BH →   B- +  AH と い う プ ロ ト ン 移 動 反 応 が 一 般 的 で あ る 。 こ の プ ロ ト ン 移 動 反 応 の エ ン タ ル ピ ー 変 化 は 分 子 BH の 酸 性 度 、 あ る い は 結 合 解 離 エ ネ ル ギ ー と A-_{の プ ロ ト ン 親 和 力 の 差 に よ る 。 エ ネ} ル ギ ー 的 に は 溶 媒 分 子 イ オ ン A-の プ ロ ト ン 親 和 力 と 試 料 BH の 酸 性 度 を 見 る こ と に よ り 、 そ の 感 度 は 予 想 で き る 。 す な わ ち 、 溶 媒 分 子 イ オ ン A-の プ ロ ト ン 親 和 力 が 大 き い ほ ど 、 ま た BH の 酸 性 度 が 高 い ほ ど 、 感 度 は よ く な る と 考 え ら れ る 。   分 析 の 対 象 物 質 が プ ロ ト ン を 付 加 し た り 、 あ る い は 放 出 し た り す る に は プ ロ ト ン を 授 受 し う る 置 換 基 の 存 在 が 重 要 な フ ァ ク タ ー と な る 。 窒 素 な ど の 非 共 有 電 子 対 を 有 す る 原 子 か

ら な る 置 換 基 は プ ロ ト ン 付 加 し や す く 、 す な わ ち ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド で 感 度 が よ く 、 一 方 、 水 酸 基 や カ ル ボ キ シ ル 基 は 脱 プ ロ ト ン 化 し や す い の で 、 ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で 感 度 が い い 。   例 え ば ア ミ ノ 基 を 有 す る 農 薬 Linuron や Diuron は APCI の ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド で プ ロ ト ン 付 加 し た マ ス ス ペ ク ト ル が 観 測 で き る （ 図 4.1.1-1、 図 4.1.1-2）。 ま た エ ス ト ラ ジ オ ー ル と p-tert-ブ チ ル 安 息 香 酸 ( 図 4.1.1-3、 図 4.1.1-4) で は そ れ ぞ れ ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で プ ロ ト ン の 脱 離 し た マ ス ス ペ ク ト ル が 得 ら れ た 。 な お フ ラ ー レ ン (C6 0) は プ ロ ト ン 授 受 に 関 与 す る よ う な 置 換 基 を 有 さ な い が 、 APCI の ポ ジ テ ィ ブ イ オ ン モ ー ド で 検 出 で き る こ と が 知 ら れ て い る 。

図 4.1.1-1 Linuron の APCI-MS ス ペ ク ト ル

図 4.1.1-2 Diuron の APCI-MS スペクトル

Mobile phase ; MeOH:H2O=1:1

Flow rate ; 0.5ml/min Fragmentor voltage ; 50V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD

Linuron (200

µ

g/ml)

Scan ;100-400

Cap.Vol．; 3500V

Corona current ; 4.0

µ

A

Drying gas temp. ; 350℃

Vaporizer temp.; 473℃

Drying gas flow ; 6.0 l/min

Neb. Pressure ; 60psig

positive mode

Mobile phase ; MeOH:H

O=1:1

Flow rate ; 0.5ml/min

Fragmentor voltage ; 80V

Injection volume ; 5

µ

l

Instrument ; HP1100MSD

図 4.1.1-3 17b-estradiol の APCI-MS ス ペ ク ト ル

図 4.1.1-4 p-t-Butylbenzoic acid の APCI-MS ス ペ ク ト ル

CH3 OH HO 17β-Estradiol 17β-estradiol (2.0µg/ml) Scan ;100-400 Cap.Vol．; 3500V Corona current ; 4.0µA Drying gas temp. ; 350℃ Vaporizer temp.; 473℃ Drying gas flow ; 6.0 l/min Neb. Pressure ; 60psig negative mode

Mobile phase ; MeOH:H2O=1:1

Flow rate ; 0.5 ml/min Fragmentor voltage ;150V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD t-Bu COOH 4-t-Butyl-benzoic acid p-t-Butylbenzoic acid (5.0µg/ml) Scan ;100-400 Cap.Vol．; 3500V Corona current ; 4.0µA Drying gas temp. ; 350℃ Vaporizer temp.; 473℃ Drying gas flow ; 6.0 l/min Neb. Pressure ; 60psig negative mode

Mobile phase ; MeOH:H2O=1:1

Flow rate ; 0.5 ml/min Fragmentor voltage ;70V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD

(2)溶 媒 の 選 択 と 検 出 感 度   APCI は 分 析 対 象 物 質 の 気 相 に お け る 反 応 に 基 づ い て い る の で 、 ESI と 比 較 し て 、 溶 媒 の 種 類 お よ び p H が 感 度 に 与 え る 影 響 は 小 さ い 。 留 意 点 と し て は 酸 性 条 件 の p H 調 整 試 薬 と し て LC-MS で 一 般 的 に 用 い ら れ る ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 が 正 イ オ ン と の 相 互 作 用 に よ り 、 分 析 物 の 測 定 感 度 を 下 げ る 可 能 性 が あ る こ と が 挙 げ ら れ る 。 こ の よ う な 作 用 を 防 ぐ た め に ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 の 移 動 相 中 の 濃 度 は 0.05%以 下 で 使 用 し た ほ う が い い 。 同 様 の 理 由 で 酢 酸 は 1％ 以 下 の 濃 度 で 使 用 す べ き で あ る 。   図 4.1.1-5 は 種 々 の ク ロ ロ フ ェ ノ ー ル 類 に つ い て p H を 4-10 の 範 囲 で 変 化 さ せ 、 フ ロ ー イ ン ジ ェ ク シ ョ ン 法 に よ り 、 APCI/MS の 感 度 の 変 化 を 示 し た も の で あ る 。 p H の 調 整 は ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 と 水 酸 化 ア ン モ ニ ウ ム に よ り 行 っ た 。 測 定 条 件 は 表 4.1.1-4 に 示 し た 。 こ の pH 領 域 で は 殆 ど 感 度 の 変 化 が な い こ と が 分 か る 。 表 4.1.1-4    ク ロ ロ フ ェ ノ ー ル 類 の APCI/MS 条 件 機 種 Hitachi M-1200 AP/ES キ ャ リ ア ー 流 量 1.0ml/min ス キ ャ ン 範 囲 100-400 ス キ ャ ン 速 度 50amu/sec ド リ フ ト 電 圧 70V マ ル チ プ ラ イ ヤ ー 電 圧 1,800V ニ ー ド ル 電 圧 3,000V フ ォ ー カ ス 電 圧 90V 分 解 能 48 霧 化 部 温 度 180℃ 脱 溶 媒 室 温 度 400℃ 第 一 細 孔 温 度 120℃ 試 料 注 入 量 20ml   APCI は ESI と 比 較 し て 、 プ ロ ト ン 以 外 の イ オ ン が 付 加 す る 擬 分 子 イ オ ン が 観 測 さ れ る こ と は ま れ で あ る 。 し か し 、 ア ン モ ニ ウ ム 共 存 条 件 で [M+NH4]+が 観 測 さ れ る こ と が あ る 。 定 量 イ オ ン 選 択 の 際 、 こ れ ら の 付 加 反 応 に も 注 意 し た い 。 し か し 、 ESI で し ば し ば 観 測 さ れ る ナ ト リ ウ ム 付 加 イ オ ン は ほ と ん ど 観 測 さ れ な い 。 ナ ト リ ウ ム イ オ ン と 安 定 な 錯 体 を 形 成 す る ジ ベ ン ゾ 18-ク ラ ウ ン -6-エ ー テ ル は ESI で は ナ ト リ ウ ム 付 加 イ オ ン が 観 測 さ れ る が 、 APCI で は プ ロ ト ン 付 加 体 、 H2O+付 加 体 の ピ ー ク が 得 ら れ た の み で 、 ナ ト リ ウ ム 付 加 イ オ ン は 見 ら れ な か っ た （ 図 4.1.1-6）。

図 4.1.1-5 種 々 の ク ロ ロ フ ェ ノ ー ル の pH に よ る 感 度 変 化

図 4.1.1-6 Dibenzo-18-crown-6-ether の APCI-MS ス ペ ク ト ル

Mobile phase ; MeOH:H2O=1:1

Flow rate ; 0.5 ml/min Fragmentor voltage ;50V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD O O O O O O O H+ O O O O O O O H3O +

(3)ポ ス ト カ ラ ム   LC 分 離 の 移 動 相 条 件 の ま ま で は イ オ ン 化 が 充 分 、 進 行 せ ず 、 感 度 が 得 ら れ な い 場 合 、 カ ラ ム 分 離 後 、 添 加 剤 を 含 ん だ 溶 媒 を 加 え 、 MS に よ る 検 出 を 効 率 的 に す る ポ ス ト カ ラ ム 法 が 用 い ら れ る 。 液 相 で の 試 料 イ オ ン 化 反 応 が あ ま り 影 響 し な い APCI で は ESI と 比 較 し 、 ポ ス ト カ ラ ム 法 の 導 入 例 は 少 な い 。 4 .1.1 .3   イ オ ン 化 条 件 の 最 適 化 (1)移 動 相 の 流 量   APCI は 気 体 と な っ た 溶 媒 分 子 へ の コ ロ ナ 放 電 が 測 定 対 象 物 質 の イ オ ン 化 に つ い て 最 初 の 反 応 と な る 。 す な わ ち 、 流 量 が 大 き い ほ ど イ オ ン 化 さ れ た 溶 媒 分 子 が 増 え 、 感 度 が 増 す 傾 向 が あ る 。 し か し 、 溶 媒 は 気 化 す る と 体 積 が 膨 張 し 、 MS の 真 空 度 に 影 響 を 与 え て し ま う 。 MS の 真 空 を 保 つ た め に LC か ら の 溶 媒 の 流 量 は 制 限 さ れ る 。 機 器 の 発 達 に よ り 数 ml/min の 大 流 量 が 可 能 な 技 術 も 報 告 さ れ て い る が 、 一 般 的 に 流 量 と し て は 0.1-1.0ml/min の 範 囲 で 使 用 さ れ て い る 。 実 際 、 LC/APCI/MS の 測 定 例 を 見 る と 、1.0ml/min の 流 量 で 行 わ れ て い る も の が 多 い 。 (2)ド リ フ ト 電 圧   イ ン タ ー フ ェ イ ス に お い て 生 成 し た イ オ ン を 質 量 分 析 部 に 導 入 す る た め に 印 加 す る 電 圧 を ド リ フ ト 電 圧 と い う 。 な お ド リ フ ト 電 圧 は 機 種 に よ り フ ラ グ メ ン タ ー 電 圧 、 エ ク ス ト ラ ク ト 電 圧 、 コ ー ン 電 圧 な ど と 呼 ば れ る こ と も あ る 。 ド リ フ ト 電 圧 を 高 く す る こ と に よ り 、 イ ン タ ー フ ェ イ ス に あ る 窒 素 原 子 と イ オ ン の 衝 突 が 激 し く な り 、 イ オ ン の フ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン が 進 む 。 こ れ を CID(collision induced dissociation)と 呼 ぶ 。 CID に よ り フ ラ グ メ ン ト イ オ ン が 検 出 で き 、 物 質 の 定 性 あ る い は 構 造 の 推 定 に 役 立 つ 。 一 方 、 SIM モ ー ド で 擬 分 子 イ オ ン を 選 択 す る 場 合 に は CID の 起 き に く い 条 件 の ド リ フ ト 電 圧 を 選 択 す る ほ う が い い 。 ド リ フ ト 電 圧 が 低 す ぎ る と 質 量 分 析 部 へ の イ オ ン の 導 入 量 が 減 少 し 、 感 度 の 低 下 に つ な が る 。 こ の た め 、 各 分 析 物 質 に つ い て ド リ フ ト 電 圧 を 変 化 さ せ 、 最 も 感 度 が よ く な る ド リ フ ト 電 圧 を 選 択 す る 操 作 が 必 要 と な る 。   例 え ば 4-ニ ト ロ 安 息 香 酸 に つ い て は ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド 、 ド リ フ ト 電 圧 50Ｖ で 、 プ ロ ト ン 脱 離 し た ピ ー ク 166 が 唯 一 の ピ ー ク と し て 得 ら れ る 。（ 図 4.1.1-7） し か し 、 ド リ フ ト 電 圧 を 90Ｖ と 上 げ る と カ ル ボ キ シ ル 基 が 切 れ る フ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン が 進 み 、 166 の ピ ー ク 強 度 は 下 が り 、 フ ラ グ メ ン ト イ オ ン の 122 の ピ ー ク が 得 ら れ て く る （ 図 4.1.1-8）。   ま た 分 析 対 象 物 質 の 分 子 量 も ド リ フ ト 電 圧 の 選 択 に 大 き く 影 響 す る 。 分 子 量 が 972 と 比 較 的 高 分 子 量 で あ る β - シ ク ロ デ キ ス ト リ ン は ド リ フ ト 電 圧 100 Ｖ 以 下 で は 分 子 イ オ ン ピ ー ク は 観 測 さ れ ず 、 最 適 ド リ フ ト 電 圧 は 150 Ｖ で あ っ た (図 4.1.1-9)。 こ れ は 100V 以 下 で

は シ ク ロ デ キ ス ト リ ン の 脱 プ ロ ト ン し た イ オ ン を 引 き 抜 く エ ネ ル ギ ー が 不 十 分 な た め で あ る と 考 え ら れ る 。

図 4.1.1-9 a-Cyclodextrin の APCI-MS ス ペ ク ト ル

Mobile phase ; MeOH:H₂O=1:1 Flow rate ; 0.5 ml/min

Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD 図4.1.1-8 4-Nitrobenzoic acidのAPCI-MSスペクトル (Fragmentor voltage ; 90V) NO2 COOH 4-Nitro-benzoic acid 0 25 50 75 100 125 Abundance 100 125 150 175 200 m/z 166.1 0 25 50 75 100 125 Abundance 100 125 150 175 200 m/z 122.1 166.1 α-Cyclodextrin (1000µg/ml) Scan ;300-1000 Cap.Vol．; 3500V Corona current ; 4.0µA Drying gas temp. ; 350℃ Vaporizer temp.; 473℃ Drying gas flow ; 6.0 l/min Neb. Pressure ; 60psig negative mode

Mobile phase ; MeOH :H₂O=1:1 Flow rate ; 0.5 ml/min

Fragmentor voltage ;150V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD

(3)ニ ー ド ル 電 圧   APCI は ニ ー ド ル 電 極 に 高 電 圧 を か け 、 気 化 し た 溶 媒 分 子 と ニ ー ド ル 電 極 間 の コ ロ ナ 放 電 を 経 て イ オ ン 化 反 応 を 起 こ す 。し た が っ て ニ ー ド ル 電 極 に は 適 当 な 高 電 圧 が 必 要 と な る 。 一 般 的 に ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド で は 3000∼ 4000 V、 ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で は -2500∼ -3500 V 程 度 の ニ ー ド ル 電 圧 で 使 用 す る 。 と く に 特 殊 な 手 法 を 用 い な い 限 り は そ れ ぞ れ 3000 V， -2500 V と ニ ー ド ル 電 圧 を 固 定 し て 測 定 す れ ば い い 。 (4)温 度 条 件   APCI は 溶 媒 の 気 化 、 除 去 の た め に 温 度 を イ ン タ ー フ ェ イ ス で か け る 必 要 が あ る 。 溶 媒 の 気 化 が 充 分 に 起 こ ら な け れ ば APCI の イ オ ン 化 効 率 は 低 く な る 。 し た が っ て 溶 媒 組 成 に よ り 充 分 な 気 化 が 起 こ る イ ン タ ー フ ェ イ ス 温 度 を 設 定 し な け れ ば な ら な い 。 図 4.1.1-10 に メ タ ノ ー ル / 水 系 溶 媒 組 成 比 と そ の 適 切 な イ ン タ ー フ ェ イ ス の 温 度 の 関 係 を 一 例 と し て 示 し た 。   基 本 的 に 温 度 を 上 げ る ほ ど 、 溶 媒 の 気 化 が 起 こ り 、 イ オ ン 化 が 効 率 よ く 進 み や す く な る が 、 同 時 に 試 料 の 熱 分 解 反 応 が 起 こ り や す く な る 。 と く に 熱 分 解 性 の 試 料 を 分 析 す る 場 合 は 移 動 相 の 溶 媒 の 気 化 と 測 定 対 象 物 質 の 熱 分 解 性 と い う 二 つ の 観 点 か ら イ ン タ ー フ ェ イ ス の 温 度 を 選 択 す る 必 要 が あ る 。

図 4.1.1-10 移 動 相 流 量 1ml/minに お け る 移 動 相 の 溶 媒 組 成 と

      霧 化 器 の 最 適 温 度 の 関 係

(5)LC/APCI-MS 条 件 設 定 の た め の 手 順   LC/APCI-MS の 条 件 は LC 分 離 条 件 と APCI-MS 条 件 の 双 方 に つ い て 最 適 と な る バ ラ ン ス が 取 れ た も の に し な け れ ば な ら な い 。 以 下 に そ の 一 般 的 な 手 順 を 記 す 。 物 質 に よ り L C 分 離 、 MS の 感 度 に 大 き な 差 が 出 る の で 分 析 し た い 物 質 毎 に こ の 操 作 を 行 う こ と が 必 要 で あ る 。 ①   フ ロ ー イ ン ジ ェ ク シ ョ ン に よ る 測 定 a, 溶 媒 は メ タ ノ ー ル :水 =1:1 あ る い は ア セ ト ニ ト リ ル :水 =1:1 で 行 う 。 b, 数 μ g/ml 以 上 の 濃 度 の 試 料 溶 液 を 用 い 、 SCAN で マ ス ス ペ ク ト ル を 得 る 。 c, ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド か ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド か の 選 択 す る 。 d, ド リ フ ト 電 圧 の 最 適 値 の 探 査 す る 。 ② LC 分 離 条 件 の 検 討 a, 溶 媒 の 種 類 、 グ ラ ジ エ ン ト 、 カ ラ ム 温 度 な ど を 考 慮 し 、 適 切 な 分 離 条 件 を 見 つ け る 。 b,  分 離 で き な い 場 合 は 揮 発 性 p H 調 整 試 薬 や イ オ ン ペ ア 剤 の 利 用 を 考 え る 。 ③ イ ン タ ー フ ェ イ ス 温 度 の 最 適 化 a, 移 動 相 の 水 分 量 な ど 溶 媒 組 成 か ら そ の 沸 点 の 高 低 を 判 断 し 、 さ ら に 、 分 析 物 の 熱 安 定 性 を 考 慮 に 入 れ 、 イ ン タ ー フ ェ イ ス 温 度 を 決 め る 。

④ LC-APCI-MS 測 定 （ SCAN → SIM)

4 .1.1 .4 APCI/MS ス ペ ク ト ル の 例   図 4.1.1-11 ∼ 図 4.1.1-15 に 外 因 性 内 分 泌 か く 乱 化 学 物 質 と し て 挙 げ ら れ て い る 化 合 物（ ポ リ ク ロ ロ ビ フ ェ ニ ル オ ー ル 、 2,4-ジ ク ロ ロ フ ェ ノ ー ル 、 ビ ス フ ェ ノ ー ル A, ジ エ チ ル ス チ ル ベストロール）の APCI/MS ス ペ ク ト ル を 示 す 。 こ れ ら の 化 合 物 は い ず れ も 水 酸 基 を 持 ち 、 ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で 測 定 し た と こ ろ M - H ア ニ オ ン の ピ ー ク が 得 ら れ た 。 こ れ ら の 化 合 物 は ESI の ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で も 検 出 可 能 で あ る 。

図 4.1.1-11 2’,3,3’,4’,5-pentachloro-4-biphenylol の APCI-MS ス ペ ク ト ル

Mobile phase ; MeOH:H2O=1:1 Flow rate ; 0.5 ml/min

Fragmentor voltage ;130V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD OH Cl Cl Cl Cl Cl 2,3,3',4',5-Pentachlorobipheniyl-4-ol

図 4.1.1-12 2,2’,3,4’,5,5’,6-heptachloro-4-biphenylol の APCI-MS ス ペ ク ト ル

図 4.1.1-13 2,4-Dichlorophenol の APCI-MS ス ペ ク ト ル

Mobile phase ; MeOH:H₂O=1:1 Flow rate ; 0.5 ml/min

Fragmentor voltage ;130V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD OH Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl 2,2',3,4',5,5',6-Heptachlorobipheniyl-4-ol 2,4-Dichlorophenol (5.0µg/ml) Scan ;100-400 Cap.Vol．; 3500V Corona current ; 4.0µA Drying gas temp. ; 350℃ Vaporizer temp.; 473℃ Drying gas flow ; 6.0 l/min Neb. Pressure ; 60psig negative mode

Mobile phase ; MeOH:H₂O=1:1 Flow rate ; 0.5 ml/min

Fragmentor voltage ;90V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD OH Cl Cl 2,4-DIchlorophenol

図 4.1.1-14 Bisphenol A の APCI-MS ス ペ ク ト ル

図 4.1.1-15 Diethylstilbestrol の APCI-MS ス ペ ク ト ル

Bisphenol A (5.0

µ

g/ml)

Scan ;100-400

Cap.Vol．; 3500V

Corona current ; 4.0

µ

A

Drying gas temp. ;℃

Vaporizer temp.; 473℃

Drying gas flow ; 6.0

Neb. Pressure ;

negative mode

Mobile phase ; MeO :H

O=1:1

Flow rate ; 0.5

Fragmentor

Injection volume ;

µ

l

Instrument ;

Mobile phase ; MeOH:H₂O=1:1 Flow rate ; 0.5 ml/min

Fragmentor voltage ;130V Injection volume ; 5µl Instrument ; HP1100MSD HO OH Diethylstilbestrol

４ ． １ ． ２ エ レ ク ト ロ ス プ レ ー (ESI) 法 ESI 法 は 、 静 電 噴 霧 現 象 を 利 用 し て 、 溶 液 中 に 存 在 す る イ オ ン を 、 そ の ま ま 気 相 中 の イ オ ン と し て 取 り 出 す 方 法 で あ る 。 従 っ て 、 ESI で は キ ャ ピ ラ リ ー 先 端 か ら の 帯 電 液 滴 の 生 成 効 率 は 、 キ ャ ピ ラ リ ー 先 端 の 大 き さ と 電 界 強 度 、 移 動 相 の 流 量 、 電 気 伝 導 度 や 表 面 張 力 に 代 表 さ れ る 噴 霧 溶 媒 の 性 質 な ど に 大 き く 依 存 す る 。 こ の 章 で は 、 LC 条 件 の LC/MS/ESI 法 へ 適 用 す る 場 合 の 留 意 点 、 主 に 移 動 相 及 び 移 動 相 の pH 調 整 等 に つ い て 述 べ 、 さ ら に イ オ ン 化 効 率 を 向 上 さ せ る た め の イ ン タ ー フ ェ ー ス 及 び MS に 関 す る 技 術 等 、 分 析 条 件 最 適 化 に つ い て 記 述 す る 。 4.1.2.1 溶 媒 の 選 択 ESI で は 、 帯 電 し た 液 滴 を 生 成 さ せ る こ と 、 そ し て 溶 媒 を 蒸 発 さ せ る こ と に よ っ て 液 滴 を 分 裂 さ せ 、 さ ら に 微 少 な 高 い 電 荷 を 持 っ た 液 滴 が 生 成 さ れ る こ と が 望 ま れ る 。 従 っ て 、 溶 媒 は 気 化 し 易 く 、 か つ 表 面 張 力 が 小 さ く 、 粘 性 が 低 い こ と が 要 求 さ れ る 。 ESI に 適 し て い る と 考 え ら れ て い る 一 般 的 な 溶 媒 を 表 4.1.2-1 に 示 す 。 表 4.1.2-1 ESI に 適 す る 溶 媒 溶 媒 粘 性 率＊ 1 c P 表 面 張 力＊ 1 Nm- 1 沸 点 ℃ 水 1 . 0 0.073 100 メ タ ノ ー ル 0.61 0.022 78 ア セ ト ニ ト リ ル 0.37 0.029 82 エ タ ノ ー ル 1.19 0.022 64 プ ロ パ ノ ー ル 2.20 0.024 97 イ ソ プ ロ パ ノ ー ル 2.39 0.021 82 ブ タ ノ ー ル 2.95 0.025 83 ア セ ト ン 0.32 0.024 56 ギ 酸 1.80 0.038 101 酢 酸 1.22 0.028 118 ジ ク ロ ロ メ タ ン 0.44 0.028 40 ジ メ チ ル ス ル ホ キ シ ド (DMSO)＊ 2 2.24 0.043 189 ＊ 1_{： 20℃ で の 値} ＊ 2_{： 使 用 す る と き は 10%以 下 で の 使 用 が 望 ま し い 。}

表 4.1.2-1 の 中 で 、 特 に 表 面 張 力 の 大 き い 水 は 、 気 化 熱 も 大 き く 、 ま た 溶 媒 和 が 強 い の で 擬 分 子 イ オ ン の 生 成 を 抑 制 す る た め 、 そ の 比 率 を 大 き く し な い 方 が よ い 。 電 気 伝 導 度 の 高 い ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 や 、 イ オ ン が 生 成 し な い ト ル エ ン そ の 他 ベ ン ゼ ン 、 四 塩 化 炭 素 、 ヘ キ サ ン 、 ク ロ ロ ホ ル ム 、 二 硫 化 炭 素 、 シ ク ロ ヘ キ サ ン 及 び 芳 香 族 炭 化 水 素 類 等 は ESI に は 適 当 で な い と 言 わ れ て い る 溶 媒 で あ る 。 4.1.2.2 pH 調 整 試 薬 イ オ ン 解 離 性 物 質 に つ い て L C で の 最 適 な 分 離 を 得 る た め に は p H 調 整 を 必 要 と す る 場 合 が 多 い 。 こ の よ う な 場 合 L C で は 、 ほ と ん ど が リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム や 酢 酸 ナ ト リ ウ ム な ど 無 機 塩 の 緩 衝 液 を 使 用 し て い る 。 こ れ ら は 不 揮 発 性 の 物 質 で あ り 、 ３ ． ２ ． ３ で も 記 述 し た よ う に LC/MS で は 特 に イ ン タ ー フ ェ ー ス 部 で の 流 路 系 の 目 詰 ま り を 起 こ す こ と に な る 。 さ ら に 不 揮 発 性 の た め 脱 溶 媒 に 過 剰 の エ ネ ル ギ ー を 必 要 と し 溶 質 分 子 の よ り 微 細 な 液 滴 の 生 成 を 妨 げ る こ と に な る 。 ま た 、 イ オ ン 化 効 率 の 低 下 及 び イ オ ン 強 度 が 減 少 す る こ と に よ る 感 度 低 下 の 原 因 に つ な が る 。 従 っ て 、ESI で は 揮 発 性 物 質 を 使 用 す る 必 要 が あ る 。 使 用 可 能 な p H 調 整 試 薬 は 前 項 ３ ． ２ ． ３ 移 動 相 の ｐ H 調 整 の 項 の 表 3.2.3-2 の 上 段 に 示 す 揮 発 性 試 薬 で あ り 、 一 般 的 に よ く 使 わ れ て い る 緩 衝 液 は 、 酢 酸 、 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 及 び ギ 酸 等 で あ る 。 表 4.1.2-3 水 ／ 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 系 ｍ ／ ｚ イ オ ン 35 NH3・NH4+ 3 6 H2O・ NH4+ 54 (H2O )2・NH4+ 77 (CH3COOH・ NH3・NH4-18) + 78 CH3COOH・ NH4+ Negative で は 、 (CH3COOH) 2-H−：119 _CH 3COOH・H2O-H−：77 表 4.1.2-4 ア セ ト ニ ト リ ル ／ 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 系 ｍ ／ ｚ イ オ ン 41 CH3CN+ 59 CH3CN NH4+ 77 CH3CN H2O NH4+ 1 0 0 (CH3CN)2 NH4+ 表 4.1.2-2 メ タ ノ ー ル ／ 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 系 ｍ ／ ｚ イ オ ン 50 CH3OH・ NH4+ 68 CH3OH・ H2O・ NH4+ 82 (CH3OH)2・NH4+

た だ し 、 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 使 用 し た 場 合 に は 、 試 料 イ オ ン に ア ン モ ニ ウ ム イ オ ン が 付 加 し た イ オ ン を 形 成 し 、 そ の た め 擬 分 子 イ オ ン の ピ ー ク 強 度 が 低 下 す る こ と が あ る 。 ま た 、 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム は ア セ ト ニ ト リ ル に は 溶 解 し 難 い の で 、 移 動 相 に ア セ ト ニ ト リ ル を 使 用 す る 時 は 注 意 す る 。 表 4.1.2-2∼ 表 4.1.2-4 に 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 等 ア ン モ ニ ウ ム 塩 を 使 用 し た 場 合 に マ ス ス ペ ク ト ル と し て 現 わ れ る イ オ ン を 示 す 。 p H 調 整 試 薬 の 濃 度 は 、 特 に ESI の 場 合 は 、 イ オ ン 化 効 率 に 影 響 を 及 ぼ す の で 低 濃 度 (10mM 程 度 )で の 使 用 が 適 当 で あ る 。 4.1.2.3 イ オ ン ペ ア ( I P C ) 剤 I P C 剤 が 、 強 酸 性 及 び 強 塩 基 性 物 質 の 分 析 に 用 い ら れ る こ と は 、 ３ ． ２ ． ４ I P C 試 薬 の 項 で 述 べ た 。 IPC 試 薬 の 使 用 に つ い て も p H 調 整 試 薬 の 場 合 と 同 様 の 問 題 が あ る 。 不 揮 発 性 の 物 質 は 噴 霧 部 や ス キ マ ー 部 の 目 詰 ま り の 原 因 と な り 、 ま た 、 気 相 で の 微 細 な 液 滴 の 生 成 時 に 目 的 イ オ ン と 二 次 的 反 応 を 起 こ し 目 的 イ オ ン を 中 性 化 し 、 ESI で 要 求 さ れ る 帯 電 し た 液 滴 の 生 成 を 妨 げ る こ と に な る 。 I P C 試 薬 を 使 用 す る 場 合 は 、 表 3.2.3-4 及 び 表 3.2.3-5 を 参 考 に 揮 発 性 の も の を 選 択 す る 。 LC 分 析 で 一 般 的 に 使 用 さ れ て い る 揮 発 性 の I P C 試 薬 は 、 ト リ エ チ ル ア ミ ン や ヘ キ サ フ ル オ ル 酪 酸 及 び 水 酸 化 テ ト ラ ブ チ ル ア ン モ ニ ウ ム な ど で あ り 、 こ れ ら は 、 LC/MS で も 使 用 可 能 で あ る 。 但 し 、 ア ミ ン 系 の 試 薬 は 分 析 部 の 流 路 系 に 吸 着 し 易 く バ ッ ク グ ラ ン ド の 原 因 に な る 。 と こ ろ で 、 LC/MS で IPC 試 薬 を 用 い た 実 際 の 分 析 例 は ほ と ん ど 報 告 さ れ て い な い の が 現 状 で あ る 。 4.1.2.4 イ オ ン 化 の 向 上 ESI 法 は 、 静 電 噴 霧 現 象 を 利 用 し て イ オ ン 化 す る 方 法 で あ る こ と は す で に 述 べ た 。 ESI キ ャ ピ ラ リ ー 先 端 か ら の 帯 電 液 滴 の 生 成 効 率 及 び イ オ ン 化 に 影 響 す る 重 要 な 点 と し て 、 そ の メ カ ニ ズ ム か ら 主 に 、 次 の よ う な こ と が 考 え ら れ る 。 ① ESI イ ン タ ー フ ェ ー ス の キ ャ ピ ラ リ ー 先 端 に お け る 帯 電 し た 液 滴 の 生 成 ② 帯 電 し た 液 滴 の 微 細 化 ③ ク ー ロ ン 力 の 反 発 に よ る 液 滴 の 分 裂 上 記 ① ∼ ③ に 影 響 を 与 え る 要 因 に は 、 移 動 相 溶 媒 と 流 量 、 噴 霧 ガ ス 流 量 及 び 脱 溶 媒 を 伴 っ た イ オ ン の 脱 離 や イ オ ン 収 束 の た め に 印 可 す る 電 圧 な ど で あ る 。 こ の 項 で は 、 主 に こ れ ら の 要 因 を 最 適 化 す る 方 法 な ど に つ い て 記 述 す る 。 (1)正 あ る い は 負 イ オ ン モ ー ド の 選 択

ESI 法 に よ る イ オ ン 化 は ソ フ ト な イ オ ン 化 で あ り 、 イ オ ン 性 及 び プ ロ ト ン 親 和 性 の 高 い 化 合 物 を イ オ ン 化 し 、 正(ポ ジ テ ィ ブ )あ る い は 負 (ネ ガ テ ィ ブ)イ オ ン の 分 子 量 情 報 を 示 す ス ペ ク ト ル が 得 ら れ る 。 正 あ る い は 負 イ オ ン の ど ち ら の モ ー ド を 選 択 す る か は 各 々 物 質 に よ っ て 異 な り 、 ま た 、 得 ら れ る 感 度 に も 大 き な 違 い が み ら れ る 。 従 っ て 、 モ ー ド の 選 択 は 重 要 で あ る 。 一 般 に 塩 基 性 の 強 い N 原 子 等 を 含 む 化 合 物 は 、 正 イ オ ン モ ー ド の 測 定 で （ M + H）＋_{イ オ ン を 、 カ ル ボ ン 酸 や ス ル ホ ン 酸 な ど は 、 負 イ オ ン モ} ー ド の 測 定 で （ M - H）−_{イ オ ン が 得 ら れ る 。 図 4.1.2-1 に 置 換 基 に よ る イ オ ン 化 モ ー ド の 選} 択 例 を 示 す 。 (2)溶 媒 の 選 択 キ ャ ピ ラ リ ー 先 端 に お け る 帯 電 し た 液 滴 の 生 成 効 率 は 、 キ ャ ピ ラ リ ー 先 端 の 大 き さ と 電 界 強 度 及 び ESI で 生 成 さ れ る 帯 電 液 滴 の 大 き さ(半 径 )は 溶 媒 の 密 度 、 流 量 及 び 表 面 張 力 と 正 の 関 係 に あ る と い う こ と か ら 、移 動 相 の 流 量 (流 速 ) 、 電 気 伝 導 度 や 表 面 張 力 に 代 表 さ れ る 噴 霧 す る 溶 媒 の 性 質 な ど に 依 存 す る 。 通 常 、 ESI イ ン タ ー フ ェ ー ス 部 の キ ャ ピ ラ リ ー 先 端 は 、_±3∼ 5 k V 程 度 の 高 電 圧 が 印 可 さ れ て い る こ と が 適 当 と さ れ 、 キ ャ ピ ラ リ ー は 外 形 約 0.2mm 、 プ ロ ト ン 化 し や す い ( + )イ オ ン R - N H2 R-NH-R′ R2-PH、 R2-PH３ R - O H、 R - S H R-OR、 R-C=O RCOOH RSO３H RPO３H ( − ) イ オ ン プ ロ ト ン を 引 き 抜 か れ や す い 図 4.1.2-1 置 換 基 に よ る イ オ ン 化 モ ー ド の 選 択 例 R1 ：N R２ ＋ HA R3 Base Acid R1 ＋ _{N R} ２ ＋ A− R3 Sample： (M+H)＋ ポ ジ テ ィ ブ イ オ ン モ ー ド ネ ガ テ ィ ブ イ オ ン モ ー ド R C O− _{＋ H： B} Sample： (M-H) − O R C OH ＋ ： B Acid Base O

内 径 0.1mm 程 度 の も の が 一 般 的 で あ る 。 そ こ で 、 こ の 先 端 部 で の 帯 電 液 滴 の 生 成 は 、 移 動 相 溶 媒 の 性 質 に 大 き く 関 係 す る こ と に な る 。 さ ら に 、 脱 溶 媒 を ス ム ー ス に 行 い 帯 電 液 滴 を さ ら に 微 細 化 す る 過 程 に お い て も 溶 媒 は 重 要 な 役 目 を 担 っ て い る 。 LC/MS 分 析 で は 、 L C の 分 離 条 件 か ら 使 用 す る 溶 媒 が 決 定 さ れ る 場 合 が 多 い 。 基 本 的 に は 、 前 章 3.2.2 移 動 相 の 選 択 で 示 し た よ う な 溶 媒 は LC/MS で も 使 用 可 能 で あ る が 、 表 面 張 力 の 大 き い 溶 媒 、 粘 度 の 高 い 溶 媒 な ど は ESI で は 好 ま し く な い 。 ま た 、 電 気 伝 導 度 の 高 い 溶 媒 も イ オ ン 化 を 阻 害 す る 。 現 在 、 LC 分 析 の ほ と ん ど は 前 項 ３ ． ２ ． １ で 記 述 し た よ う に 水 分 と 再 現 性 等 の 問 題 か ら 逆 相 系 で 分 離 さ れ る こ と が 多 く 、 移 動 相 に は メ タ ノ ー ル や ア セ ト ニ ト リ ル が 使 用 さ れ て い る 。 従 っ て 、 逆 相 系 で の 分 離 分 析 の 多 く な る LC/MS 分 析 で も 、 ま ず こ れ ら の 溶 媒 で 試 み る と よ い 。 実 際 に 、 LC/MS 分 析 で メ タ ノ ー ル や ア セ ト ニ ト リ ル が 一 般 的 に 使 用 さ れ て い る 。 し か し 、 分 析 対 象 物 質 に よ っ て は 、 使 用 す る 溶 媒 に よ っ て イ オ ン 強 度 に 大 き な 差 が 見 ら れ る 場 合 が 起 こ る 。 特 に 、 メ タ ノ ー ル で は 高 感 度 検 出 可 能 で あ る 物 質 が 、 プ ロ ト ン ド ナ ー に な り 難 い ア セ ト ニ ト リ ル で は 感 度 が 非 常 に 悪 い 場 合 が あ る の で 注 意 す る 。 (3)流 量 LC か ら 溶 出 し た 溶 媒 が MS へ 導 入 さ れ る と 気 化 さ れ て 、 体 積 の 膨 張 （ 表 4.1.2-5） を 起 こ し MS の 真 空 度 が 劣 化 す る 。 MS で は 高 真 空 を 保 つ 必 要 性 か ら LC か ら の 溶 媒 の 流 量 が 制 限 さ れ る が 、 そ れ 以 上 に 、 図 4.1.2-2 に 示 す よ う に イ オ ン 化 法 に よ り 流 量 の 制 限 が あ る 。 無 極 性 中 極 性 高 極 性 ESI APCI TSP PB 移 動 相 流 量 (ml/min) 2.0 1.0 Frit-FAB or CF-FAB 図 4.1.2-2 LC/MS イ ン タ ー フ ェ ー ス と 流 量

APCI：Atomospheric pressure chemical ionization 、 ESI ：Electrospray ionization P B：Particle beam 、 TSP ：Themospray 、Frit-FAB：Frit-Fast atom bombardment

特 に 、 ESI 法 で は 、 キ ャ ピ ラ リ ー 先 端 か ら の 帯 電 液 滴 の 生 成 効 率 は 、 4.1.2.1 溶 媒 の 選 択 の 項 で 示 し た よ う な 溶 媒 の 性 質 に 加 え 、 移 動 相 流 量 に も 大 き く 依 存 す る 。 ESI の キ ャ ピ ラ リ ー は 通 常 内 径 が 0.1mm 程 度 で あ り 、 流 量 が 多 い と 微 細 な 液 滴 が 生 成 さ れ に く く 、 イ オ ン 強 度 が 減 少 す る 。 一 般 的 に は 、 数 十 μ l ∼ 200μ l 程 度 で 使 用 さ れ て い る 。 ESI で は 、 分 析 カ ラ ム に セ ミ ミ ク ロ カ ラ ム を 使 用 し 、 0.2ml/min の 流 量 で 分 析 す る こ と が 多 い 。 し か し 、 通 常 の 分 析 カ ラ ム (内 径 4.6mm、 長 さ 150mm)を 使 用 し 、 1ml/min 程 度 の 流 量 で 分 析 す る 場 合 は 、 L C の 溶 出 液 を ESI キ ャ ピ ラ リ ー へ 導 入 さ れ る 前 に Tee な ど を 用 い て ス プ リ ッ ト す る こ と も 多 い 。 参 考 ま で に 、 表 4.1.2-6 に は 一 般 に 使 用 さ れ て い る LC 分 析 カ ラ ム の カ ラ ム 内 径 と 流 量 の 関 係 を 示 し た 。 (4)キ ャ ピ ラ リ ー 電 圧 目 的 物 質 を 含 む L C 溶 出 液 か ら 静 電 噴 霧 現 象 に よ っ て 帯 電 し た 液 滴 を 生 成 さ せ る た め に ESI キ ャ ピ ラ リ ー に 印 可 す る 電 圧 を 言 う 。 そ し て 、 対 極 と の 間 で 電 場 を 発 生 さ せ る 。 こ の 条 件 で 、 キ ャ ピ ラ リ 先 端 か ら 流 出 す る 溶 液 表 面 は 、 尖 っ た 先 端 で 平 衡 状 態 と 推 定 さ れ る 円 錐 形 の Taylor cone と 呼 ば れ る 状 態 と な り 、 理 想 的 な 帯 電 液 滴 の 流 れ が 放 出 さ れ る 。 通 常 は 、_±3∼ 5kV の 高 電 圧 が 印 可 さ れ て い る 。 印 可 電 圧 が 高 す ぎ る と こ の 状 態 が く ず れ 、 複 数 の 先 端 を 持 つ ス プ レ ー に な り 、 さ ら に 高 く す る と コ ロ ナ 放 電 が 起 こ る 。 ま た 、MS ス ペ ク ト ル の ノ イ ズ が 増 大 す る 原 因 に な る 。 (5)ド リ フ ト 電 圧 イ ン タ ー フ ェ ー ス の 大 気 圧 下 に お い て 生 成 し た イ オ ン を 差 動 排 気 部 へ 導 入 す る た め に 印 可 す る 電 圧 を ド リ フ ト 電 圧 (メ ー カ ー に よ っ て 他 の 呼 称 を 用 い て い る 場 合 も あ る )と 言 う 。 表 4.1.2-5 LC か ら MS へ 導 入 さ れ た 場 合 の 液 体 (移 動 相 溶 媒 )の 体 積 ( cm3_/min)

column Conventional Semi-micro Micro 内 径 （ mm） 4.0~4.6 1.0~2.0 0.2~0.5 流 速（ml/min） 1.0 0.2 0.005 Methanol 550 110 3 Water 1240 248 6 表 4.1.2-6 LC の カ ラ ム 内 径 と 流 量 内 径(mm) 流 量 ( μ l/min) 0.32 3 - 8 1.0 30 - 60 2.0 200 - 400 4.6 800 - 2000

ド リ フ ト 電 圧 を 高 く す る と 噴 霧 ガ ス(主 に 窒 素 )と の 衝 突 が 激 し く な り イ オ ン の フ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン が 起 こ る 。 そ の た め 目 的 と す る イ オ ン ( 主 に 擬 分 子 イ オ ン )の 生 成 効 率 が 悪 く な る 。 API 法 特 有 の CID(collision induced dissociation)法 は 、 こ の ド リ フ ト 電 圧 を 利 用 し て 噴 霧 ガ ス (中 性 分 子)と 多 数 回 衝 突 さ せ て フ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン 起 こ す こ と を 目 的 と し た 方 法 で あ る 。 CID 法 は ソ フ ト イ オ ン 化 に お け る 分 子 構 造 情 報 を 得 る 手 段 と し て は 効 果 的 で あ る が 、 し か し 、 擬 分 子 イ オ ン を 生 成 さ せ る と い う 目 的 か ら は 好 ま し く な い 。 最 適 な ド リ フ ト 電 圧 は 、 物 質 に よ っ て 異 な る 。 例 え ば 、 同 じ カ ル ボ ン 酸 類 で あ っ て も 分 子 量 に よ っ て 最 適 な 電 圧 値 が 異 な る 。 従 っ て 、 数 種 の 物 質 が 混 合 さ れ た 試 料 を 測 定 す る 場 合 は 、 個 々 の 物 質 に つ い て の 最 適 値 を 求 め る 必 要 が あ る 。 装 置 に よ っ て は 、 ド リ フ ト 電 圧 を も 含 め た イ ン タ ー フ ェ ー ス 部 等 の 条 件 に つ い て 最 適 化 す る 支 援 ソ フ ト が 提 供 さ れ 自 動 設 定 可 能 で あ る 。 (6)ポ ス ト カ ラ ム 法 一 般 に 有 機 化 合 物 は 有 機 溶 媒 中 で は 中 性 で 存 在 す る 。 ESI で は イ オ ン の 状 態 で 存 在 す る こ と が 望 ま し い 。 そ の た め に 、 LC で 分 離 さ れ た 後 に L C ポ ン プ 等 に よ っ て p H 調 整 試 薬 や イ オ ン ペ ア 試 薬 を 供 給 し て イ オ ン 化 を 促 進 さ せ る 場 合 や 、 ま た 次 の よ う な 方 法 に よ る ポ ス ト カ ラ ム 法 を 行 う 。 ・ 移 動 相 に 用 い た 水 の 混 合 比 率 を 小 さ く す る こ と で 水 と の 溶 媒 和 を 弱 く し 、 目 的 物 質 の イ オ ン 性 を 高 め る ・ イ オ ン 性 の 高 い 緩 衝 液 を 用 い た 分 析 で は 、 よ り 弱 い 酸 を 添 加 し て 緩 衝 液 の 濃 度 を 薄 め る と と も に こ の 酸 と の 弱 い イ オ ン ペ ア ー を 生 成 さ せ て 脱 離 し や す い イ オ ン と す る（ HFBA と TFA の 存 在 下 で プ ロ ピ オ ン 酸 を 添 加 す る と 感 度 が 増 加 す る 。 図 4.1.2-4 参 照 ） ・ サ ン プ ル に プ ロ ト ネ ー シ ョ ン す る 部 位 が な い 場 合 、 金 属 を 付 加 さ せ て プ ロ ト ン 化 す る （ 50μ M 程 度 の 酢 酸 サ ト リ ウ ム を 添 加 し て [M+Na]+_{を 生 成 さ せ る こ と で 感 度 を 上 げ る こ} と が あ る ） ・ イ ン タ ー フ ェ ー ス （ 特 に ESI） に 適 し た 流 量 を 保 つ た め に 溶 媒 を 増 加 、 ま た は 減 少 さ せ る 図 4.1.2-3 に ポ ス ト カ ラ ム 法 を 用 い る 場 合 の 構 成 例 を 示 す 。 図 4.1.2-3 ポ ス ト カ ラ ム 法 を 用 い る 場 合 の 構 成 例 HPLC (UV) ┬ Pump ｲﾝﾀｰﾌｪｰｽ ( A P I Needle) Mixing Tee

図 4.1.2-4 酸 添 加 に よ る 感 度 の 増 加 （ 各 20%添 加 ）（ HP 社 1998 年 LC/MSD ｾ ﾐ ﾅ ｰ ﾃ ｷ ｽ ﾄ よ り ） ポ ス ト カ ラ ム 用 ポ ン プ か ら 供 給 さ れ る 流 量 は 、 移 動 相 流 量 に 加 算 さ れ る 。 従 っ て 、 ESI イ ン タ ー フ ェ ー ス に 導 入 さ れ る 流 量 に つ い て は 適 切 な 流 量 に 調 整 す る 必 要 が あ る 。 ま た 、 ポ ス ト カ ラ ム 用 ポ ン プ か ら 供 給 さ れ る 流 量 が 多 い 場 合 は 、 試 料 が 希 釈 さ れ 試 料 の MS へ の 導 入 量 が 減 少 す る な ど の 難 点 が あ る 。 ま た 、 添 加 す る 試 薬 濃 度 に つ い て も イ オ ン 化 効 率 に 影 響 を 及 ぼ し 、 ピ ー ク 強 度 が 変 化 す る 。 カ ル ボ ン 酸 類 に ト リ エ チ ル ア ミ ン を 添 加 し た 場 合 の 一 例 を 図 4.1.2-5 に 示 す 。 添 加 濃 度 は 0%、 0.05%、 0.1%、 0.5%で あ る 。 図 4.1.2-5 添 加 試 薬 濃 度 と 応 答 シ グ ナ ル 比 2.0 1.0

benzoic acid o-toluic acid salicylic acid phenoxacetic acid

0% 0.05% 0.1% 0.5% Signal ratio 10 15 16 6 ΔSignal ／ S i g n a l (%) 20 10 1.5

Formic Acetic Propionic Butyric Valeric Acid

4.1.2.5 多 価 イ オ ン ス ペ ク ト ル ESI 法 の 特 徴 の 一 つ は 、 他 の イ オ ン 化 法 で は 見 ら れ な い 多 価 イ オ ン ス ペ ク ト ル が 生 成 す る こ と で あ る 。 ペ プ チ ド や タ ン パ ク 質 な ど 数 千 か ら 数 万 の 分 子 量 を も つ 化 合 物 が 、 加 熱 気 化 さ れ る こ と 無 く 、 (M+nH)n +_{や (M-nH)}n -_{の 多 価 イ オ ン と し て 得 ら れ 、 高 分 子 量 物 質 の 質} 量 を 決 定 す る こ と が 可 能 で あ る 。 し か し 、 QMS で 多 価 イ オ ン を 測 定 す る 場 合 は 、 QMS の 分 解 能 が 低 い こ と か ら 、 分 子 量 の 精 確 さ に か け る こ と が あ る 。 多 価 イ オ ン を 測 定 す る 場 合 に は 、 装 置 の マ ス 軸 を 精 密 に 合 わ せ る こ と が 重 要 で あ る 。 次 式 に 示 さ れ る よ う に 、 多 価 イ オ ン か ら の 分 子 量 は 電 荷 の 数 を 基 本 に し た 掛 け 算 で 計 算 さ れ る の で 、マ ス 軸 の ず れ が 大 き い と 分 子 量 の ず れ も 大 き く な る 。 多 価 イ オ ン の ス ペ ク ト ル か ら 分 子 量 の 計 算 は 次 式 に よ っ て 行 う 。 n2=n1+1 n ： イ オ ン の 電 荷 数 n1< n2 n1=m1/(m2-m1) mn ： 得 ら れ た ス ペ ク ト ル の 質 量 数 m1< m2 M1=n1(m1-ｘ ) Mn ： ２ つ の ス ペ ク ト ル の 質 量 数 か ら 計 算 さ れ た 分 子 量 MW=ave(M1,M2,M3….) MW ： 求 め る 物 質 の 平 均 分 子 量 ｘ ： 付 加 し て い る ア ダ ク ツ イ オ ン の 質 量 数（ 通 常 は 水 素 ） 計 算 ソ フ ト が 各 メ ー カ か ら 提 供 さ れ て い る 。 図 4.1.2-6 に 示 す よ う な ス ペ ク ト ル が 得 ら れ た 場 合 の 計 算 例 を 示 す 。 図 4.1.2-6 多 価 イ オ ン の ス ペ ク ト ル 例 n1=496／ ( 5 7 8 . 5− 496) M1=6(496-1) =6.012 = 2970.0 n2=578.5／ ( 6 9 4 . 0− 578.5) M2=5(578.5-1) =5.008 =2887.5 n3=694.0／ ( 8 6 7 . 3− 694.0) M3=4(694.0-1) =4.004 =2772 求 め る 分 子 量 =M1、 M2、 M3 、 - - - の 平 均 値 m3： 694.0 m 4 ： m 1： 496 m 2： 578.5 △ =82.5 △ =115.5 △ =173.3 m/z 500 600 700 800 900 m4:867.3 m3:694.0 m1:496 m2:578.5

4.1.2.6 LC/ESI/MS 条 件 設 定 の た め の 手 順 LC/ESI/MS の 分 析 条 件 は L C 分 離 条 件 と ESI/MS 条 件 が と も に 最 適 と な る よ う な 条 件 で あ る こ と が 理 想 的 で あ る 。 以 下 に 条 件 選 択 の た め の 簡 単 な 手 順 を 示 す 。 ① フ ロ ー イ ン ジ ェ ク シ ョ ン に よ る 測 定 a 溶 媒 は メ タ ノ ー ル ： 水 （ １ ： １ ） あ る い は ア セ ト ニ ト リ ル ： 水 （ １ ： １ ） を 使 用 。 ( 一 般 に LC で は 逆 相 モ ー ド で の 分 離 と 考 え て 良 い ) b ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド か ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド か の 選 択 目 的 物 質 の マ ス ス ペ ク ト ル を 得 る た め に ま ず SCAN モ ー ド で 行 う 。 濃 度 は 十 分 に 正 確 な マ ス ス ペ ク ト ル が 確 認 で き る よ う な 濃 度（ お お よ そ 数 μ g / m l） と す る 。 c ド リ フ ト 電 圧 の 最 適 値 の 探 査 ( 物 質 に よ っ て 異 な る ) ② LC 分 離 条 件 の 検 討 a 分 離 カ ラ ム 及 び 移 動 相 溶 媒 の 選 択 、 グ ラ ジ エ ン ト 条 件 あ る い は カ ラ ム 温 度 な ど を 考 慮 し 、 適 切 な 分 離 条 件 を 見 つ け る 。 b 分 離 が 不 十 分 で あ れ ば p H 調 整 試 薬 あ る い は イ オ ン ペ ア ー 試 薬 の 利 用 を 考 え る 。 こ れ ら 試 薬 は 揮 発 性 で あ る こ と 及 び 分 析 系 へ の 吸 着 等 の 問 題 が 無 い こ と を 確 認 す る 。 ③ イ ン タ ー フ ェ ー ス の 条 件 検 討 (上 記 ① 、 ② か ら の 情 報 を も と に 、 カ ラ ム を 接 続 し て 実 際 の LC 分 析 条 件 で イ ン タ ー フ ェ ー ス の 条 件 検 討 を す る 。 ) a 分 析 対 象 物 質 に 最 適 な キ ャ ピ ラ リ 電 圧 、 ド リ フ ト 電 圧 等 の 選 択 物 質 に よ っ て ド リ フ ト 電 圧 な ど の 最 適 な 条 件 が 異 な る と き は 複 数 の 値 を 設 定 す る こ と に な る - - - プ ロ グ ラ ミ ン グ で の 設 定 以 上 ① ∼ ③ か ら 分 析 対 象 物 質 の モ ニ タ ー イ オ ン (LC/MS で は ほ と ん ど が 擬 分 子 イ オ ン ) と 保 持 時 間 の 関 係 か ら L C 分 離 能 が 十 分 で あ る こ と を 確 認 す る 。

④ LC-ESI-MS 測 定 (SCAN SIM) 標 準 試 料 及 び 実 試 料 等 の 測 定

4 . 1 . 2 . 7   参 考 文 献

Paul Kebarle and Liang Tang ;AnalChem.,1993,65,972A-986A Robert D.Voyksner; Environ. Sci. Technol.,1994,28,118A-127A

質 量 分 析 法 の 新 展 開 ： 土 屋 正 彦 、 大 橋 守 、 上 野 民 夫 ； 現 代 化 学 ・ 増 刊 15、 東 京 化 学 同 人 LC/MS の 実 際 ( 天 然 物 の 分 離 と 構 造 決 定 ) ： 原 田 健 一 、 岡 尚 男 ； 講 談 社 サ イ エ ン テ フ ィ ク 化 学 便 覧 基 礎 編 改 定 四 版 ： 日 本 化 学 会 ； 丸 善

４ ． １ ． ３ CF(Frit)-FAB 法 4.1.3.1 LC 分 離 条 件 に 対 す る 制 限 Frit-FAB で は 、 被 検 成 分 と マ ト リ ッ ク ス イ オ ン と の 間 で 起 こ る 酸 塩 基 反 応 が 、 主 な イ オ ン 生 成 反 応 で あ る た め 、 被 検 成 分 と マ ト リ ッ ク ス と の 関 係 は 強 く イ オ ン 化 に 影 響 す る 。 し か し 、 移 動 相 や 緩 衝 液 の イ オ ン 化 へ の 影 響 は API 等 に 比 べ る と 少 な い 。 特 に 、 移 動 相 は 大 部 分 が Frit 内 で 気 化 す る た め 、 API の よ う に 移 動 相 の 組 成 が 強 く イ オ ン 化 に 影 響 す る こ と は 稀 で あ る 。 従 っ て 、LC 分 離 条 件 に 対 す る 制 限 も 比 較 的 少 な く て 済 む 。 た だ し 、 Frit-FAB イ オ ン 化 で は マ ト リ ッ ク ス に 関 連 し た LC 条 件 の 制 限 が い く つ か あ る 。 こ こ で は 、 主 に グ リ セ リ ン を マ ト リ ッ ク ス に 用 い た Frit-FAB 法 に つ い て 、 そ の 留 意 点 や イ オ ン 化 効 率 を 促 進 さ せ る た め の 技 術 等 に に つ い て 述 べ る 。 (1) 移 動 相 溶 媒 Frit-FAB の 移 動 相 溶 媒 は 、 フ リ ッ ト 内 で 容 易 に 揮 発 し 、 測 定 成 分 を イ オ ン 化 す る 上 に お い て 影 響 の 少 な い 溶 媒 が 理 想 的 で あ る 。 グ リ セ リ ン を マ ト リ ッ ク ス と し た 場 合 で は 、 水 、 メ タ ノ ー ル 、 ア セ ト ニ ト リ ル が 主 に 移 動 相 溶 媒 と し て 使 用 さ れ て い る 。 ま た 、 こ れ ら の 有 機 溶 媒 は 、 グ リ セ リ ン で は FAB イ オ ン 化 さ れ に く い と い う 利 点 も あ る 。 ヘ キ サ ン も Frit-FAB で は 使 用 で き る が 、 グ リ セ リ ン は ヘ キ サ ン に 溶 け な い た め 、 ヘ キ サ ン に 可 溶 な 他 の マ ト リ ッ ク ス を 選 択 す る 必 要 が あ る 。 マ ト リ ッ ク ス と 移 動 相 の 組 み 合 わ せ は 、「4.1.3.6 参 考 文 献 1) 」 に 詳 し く 記 載 さ れ て い る の で 参 照 さ れ た い 。 図 4.1.3-1 に 、 メ タ ノ ー ル ／ 水 (1:1) を 移 動 相 と し た と き の ポ ジ テ ィ ブ 及 び ネ ガ テ ィ ブ イ オ ン 化 に お け る バ ッ ク グ ラ ウ ン ド の マ ス ス ペ ク ト ル を 示 す 。 移 動 相 に は 、 pH 調 整 剤 と し て 酢 酸 を 20mM に な る よ う に 、 ま た マ ト リ ッ ク ス と し て グ リ セ リ ン を 1v/v%と な る よ う に 各 々 添 加 し た 。 酢 酸 は 溶 媒 中 で 解 離 し て 負 イ オ ン と し て 存 在 す る た め 、 ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で は ベ ー ス ピ ー ク と し て 酢 酸 由 来 の m/z 59 （ CH3COO-） が 大 変 強 く 現 れ る 。 ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で は 、 そ の 他 に グ リ セ リ ン 付 加 体 の m/z 151（ [Gly + CH3COO]-） が 、 ま た グ リ セ リ ン の プ ロ ト ン 脱 離 イ オ ン m/z 91（ [Gly-H]-） が 見 ら れ る 。 ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド で は 酢 酸 由 来 の ピ ー ク は 観 察 さ れ ず 、 グ リ セ リ ン の プ ロ ト ン 付 加 イ オ ン m/z 93（ [Gly+H]+_{） 及 び m/z 185 （ [2Gly+H]}+_{） の イ オ ン が 強 く 現 れ る 。 装 置 及 び 測 定} 条 件 を 表 4.1.3-1 に 示 す 。

Positive Negative 図 4.1.3-1 測 定 モ ー ド の 違 い に よ る バ ッ ク グ ラ ウ ン ド の マ ス ス ペ ク ト ル 表 4.1.3-1 装 置 及 び 測 定 条 件 装 置 名 日 本 電 子 製 JMS-700 イ ン タ ー フ ェ イ ス ： Frit-FAB 移 動 相 流 量 ： 0.5 mL/min イ オ ン 化 法 ： 高 速 原 子 衝 撃 法 （ FAB ） ， 衝 突 ガ ス Xe 中 性 原 子 加 速 電 圧 ： ６ kV イ オ ン 源 温 度 ： 55 ℃ （ scan） ， 80℃ （ S I M） イ オ ン 加 速 電 圧 ： 10 kV イ オ ン 源 圧 力 ： ２ × 10-2 _torr MS 測 定 条 件 (Scan) ： 範 囲 m/z 45∼ 500， ス ピ ー ド 1 sec/cycle MS 測 定 条 件 (SIM) ： チ ャ ン ネ ル 数 ６ ， ス イ ッ チ ン グ 100msec/ch

(2) 緩 衝 液

Frit-FAB に お け る 移 動 相 の pH 緩 衝 液 と し て は 、 揮 発 性 の あ る 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム が よ く 使 用 さ れ て い る 。 ま た 、 マ ト リ ッ ク ス と し て 用 い る こ と が 出 来 る エ タ ノ ー ル ア ミ ン が LC-Frit-FAB-MS の 場 合 に は 有 用 で あ る と の 報 告 が あ る ［ K. Kamei, et al.(1988)］。 移 動 相 の pH 調 整 に は 、 通 常 の 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ で 使 わ れ て い る ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 、 塩 酸 、 パ ー フ ル オ ロ 酪 酸 、 酢 酸 、 ギ 酸 、 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 等 が 使 用 で き る 。 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（HPLC） で よ く 使 わ れ る リ ン 酸 緩 衝 液 等 の 不 揮 発 性 緩 衝 液 は 、APCI や ESI の よ う に 目 詰 ま り を 引 き 起 こ し 装 置 に 負 荷 を 与 え る よ う な 影 響 は な い が 、 緩 衝 液 自 体 の FAB イ オ ン 化 に よ る イ オ ン 化 効 率 が 高 過 ぎ る た め 、 被 検 成 分 の イ オ ン 化 が 妨 害 さ れ て し ま う 、 と い う 問 題 が あ る 。 ま た 、 生 成 す る イ オ ン へ の ナ ト リ ウ ム や リ ン 酸 イ オ ン 等 の 付 加 が 起 こ り 、 マ ス ス ペ ク ト ル が 複 雑 化 し 、 解 析 が 困 難 に な る な ど 、 実 際 の 使 用 頻 度 は 低 い 。 4.1.3.2 イ オ ン 化 効 率 の 向 上 (1) 測 定 モ ー ド の 選 択 水 質 汚 濁 防 止 法 等 の 法 規 制 対 象 物 質 の 中 か ら 水 溶 性 の 8 種 の 農 薬 を 選 択 し 、 Frit-FAB を 用 い て ポ ジ テ ィ ブ 及 び ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で の マ ス ス ペ ク ト ル を 測 定 し た 。 対 象 物 質 を 表 4.1.3-2 に 、 そ の 構 造 式 を 図 4.1.3-2 に そ れ ぞ れ 示 し た 。 移 動 相 に は 、 酢 酸 を 20mM 及 び グ リ セ リ ン を 0.2 %の 濃 度 で 含 む メ タ ノ ー ル /水 (1:1)を 用 い た 。 試 料 の 注 入 は 、 対 象 物 質 濃 度 100mg/L の メ タ ノ ー ル 溶 液 を 各 々 作 成 し 、 そ の 20 μL を 連 続 フ ロ ー イ ン ジ ェ ク シ ョ ン で 注 入 し た 。 装 置 及 び 測 定 条 件 を 表 4.1.3-1 に 、 ポ ジ テ ィ ブ 及 び ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で FAB イ オ ン 化 に よ る マ ス ス ペ ク ト ル を 図 4.1.3- ３ ∼ 図 4.1.3-10 に 示 す 。 多 数 の フ ラ グ メ ン ト イ オ ン の ピ ー ク が 観 察 さ れ 、 APCI 法 及 び ESI 法 と 比 較 し て 、 フ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン が 起 こ り や す い こ と が わ か る 。 以 下 に 、 各 々 の 測 定 モ ー ド で の 各 物 質 毎 の マ ス ス ペ ク ト ル の 特 徴 を 述 べ る 。 a) ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で イ オ ン 強 度 の 高 い 物 質 ＜ ア シ ュ ラ ム 、 ト リ ク ロ ピ ル 酸 及 び メ コ プ ロ ッ プ ＞ こ れ ら ３ 物 質 は 酸 性 で あ る た め 、 ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で[M-H]-_{の 疑 分 子 イ オ ン が 明 瞭 に 観} 察 さ れ た 。 ま た 、 こ れ ら の 物 質 は ポ ジ テ ィ ブ モ ー ド で も イ オ ン 強 度 は 低 い も の の[M+H]+ の 疑 分 子 イ オ ン あ る い は M+_{の 分 子 イ オ ン が 測 定 さ れ 、FAB イ オ ン 化 で は 比 較 的 安 定 に イ} オ ン 化 す る こ と が 可 能 で あ っ た 。 b) 両 方 の 測 定 モ ー ド で イ オ ン 強 度 の 高 い 物 質

＜ オ キ シ ン 銅 、 ベ ン ス リ ド 、 チ ウ ラ ム ＞ オ キ シ ン 銅 は 、 ポ シ テ ィ ブ モ ー ド で は 、 オ キ シ ン と 銅 の 1:1 錯 体 の m/z 208 が ベ ー ス ピ ー ク と な り 、 ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド で は 、 オ キ シ ン の プ ロ ト ン 脱 離 イ オ ン が ベ ー ス ピ ー ク と な っ た 。 イ オ ン 強 度 は ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド の 方 が 強 か っ た 。 チ オ リ ン 酸 エ ス テ ル で あ る ベ ン ス リ ド は 、 ポ シ テ ィ ブ 及 び ネ ガ テ ィ ブ モ ー ド の 両 方 で イ オ ン 強 度 の 強 い フ ラ グ メ ン ト イ オ ン が 出 現 し 、 分 子 構 造 か ら 比 較 的 容 易 に 類 推 で き る フ ラ グ メ ン ト イ オ ン を 生 成 し た 。 し か し 、 チ ウ ラ ム の フ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン の 解 析 は 難 し く 、 ま た 、 選 択 イ オ ン 検 出 法 で の 定 量 イ オ ン に 使 う に は 支 障 の あ る 質 量 数 の イ オ ン で あ っ た 。 ３ 物 質 と も Frit-FAB で は イ オ ン 化 効 率 の 高 い フ ラ グ メ ン ト イ オ ン を 得 る こ と が で き た が 、 分 子 イ オ ン あ る い は 疑 分 子 イ オ ン は 観 察 さ れ な か っ た 。 c) イ ミ ダ ク ロ プ リ ド 及 び エ ト フ ェ ン プ ロ ッ ク ス 両 物 質 と も Frit-FAB で は 、 安 定 し た マ ス ス ペ ク ト ル を 得 る こ と が 出 来 な か っ た 。 イ ミ ダ ク ロ プ リ ド が ポ シ テ ィ ブ モ ー ド で 疑 分 子 イ オ ン を 含 む 比 較 的 構 造 解 析 に 有 用 な イ オ ン を 得 る こ と が で き た が 、 イ オ ン 強 度 は 他 の 物 質 に 比 べ 低 か っ た 。 表 4.1.3-2 Frit-FAB に よ る マ ス ス ペ ク ト ル 測 定 対 象 物 質 [mg/mL] 基 準 値 等 № 物 質 名 用途 CAS 番号 環 境_{基 準} 要 監 視_{指 針 値} 排 水_{基 準} ｺﾞﾙﾌ場_{指 針 値} 公 共 水_{指 針 値} 1 オキシン銅 殺 菌 10380-28-6 0.04 0.4 2 チウラム 殺 菌 137-26-8 0.006 0.06 0.06 3 アシュラム 除 草 3337-71-1 2 4 トリクロピル* 除 草 55335-06-3 0.06 5 ベンスリド(SAP) 除 草 741-58-2 1 0.1 6 メコプロップ(MCPP) 除 草 16484-77-8 0.05 7 イミダクロプリド 殺 虫 13861-41-3 0.2 8 エトフェンプロックス 殺 虫 80844-07-1 0.08 * ） ト リ ク ロ ピ ル 及 び ト リ ク ロ ピ ル 酸 の 合 算 値

ト リ ク ロ ピ ル 酸 図 4.1.3-2 マ ス ス ペ ク ト ル 測 定 対 象 物 質 オ キ シ ン 銅 チ ウ ラ ム ア シ ュ ラ ム ベ ン ス リ ド メ コ プ ロ ッ プ イ ミ ダ ク ロ プ リ ド エ ト フ ェ ン プ ロ ッ ク ス

図 4.1.3-3 ア シ ュ ラ ム の FAB マ ス ス ペ ク ト ル（ 左 :ポ シ テ ィ ブ ， 右:ネ ガ テ ィ ブ ） 図 4.1.3-4 ト リ ク ロ ピ ル 酸 の FAB マ ス ス ペ ク ト ル（ 左 : ポ シ テ ィ ブ ， 右 :ネ ガ テ ィ ブ ） 図 4.1.3-5 メ コ プ ロ ッ プ の FAB マ ス ス ペ ク ト ル （ 左 :ポ シ テ ィ ブ ， 右 :ネ ガ テ ィ ブ ） H2N SO2 + [M + H]+

[M-H]

M

[M-H]

-図 4.1.3-6 オ キ シ ン 銅 の FAB マ ス ス ペ ク ト ル（ 左 :ポ シ テ ィ ブ ， 右:ネ ガ テ ィ ブ ） 図 4.1.3-7 ベ ン ス リ ド の FAB マ ス ス ペ ク ト ル（ 左 :ポ シ テ ィ ブ ， 右:ネ ガ テ ィ ブ ） 図 4.1.3-8 チ ウ ラ ム の FAB マ ス ス ペ ク ト ル （ 左 :ポ シ テ ィ ブ ， 右 : ネ ガ テ ィ ブ ） N O - N O Cu + + H -SP(OCH(CH3)2)2 - S H2NCH2CH2S2P(OCH(CH3)2)2 + H + -SCN(CH3)2 - S