食品中のシュウ酸定量分析の検討

群 馬 県 立 産 業 技 術 セ ン タ ー 研 究 報 告 （ 2013）

食 品 中 のシュウ酸 定 量 分 析 の検 討

関 口 昭 博 ・ 吉 野 功

Akihiro SEKIGUCHI, Isao YOSHINO

食 品 中 の シ ュ ウ 酸 の 定 量 を 目 的 に GC 法 と HPLC 法 を 検 討 し た 。 標 準 試 料 に つ い て 検 量 線 を 作 成 し た と こ ろ 、 い ず れ の 方 法 で も 高 い 直 線 性 を 示 し た 。 そ こ で 作 業 の 効 率 を 考 え て 、 エ ス テ ル 誘 導 体 化 を 必 要 と し な い HPLC 法 で 、 実 サ ン プ ル を 分 析 し た 。 水 溶 性 シ ュ ウ 酸 塩 で あ れ ば 、 ポ ス ト カ ラ ム BTB-HPLC 法 で 分 析 で き る こ と が 分 か っ た が 、 不 溶 性 シ ュ ウ 酸 塩 は 夾 雑 成 分 を 除 く た め の 前 処 理 を 工 夫 し な い と 分 析 が 難 し い こ と が 分 か っ た 。 キ ー ワ ー ド ： シ ュ ウ 酸 、 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

In order to determine oxalic acid contents in foods, we tried GC and HPLC analysis. In both analysis standard curves of oxalic acid exhibited high linearity. Therefore, in view of efficiency of work, we analyzed actual samples by HPLC which doesn’t require esterification. Soluble oxalate could be determined by post-column BTB-HPLC method. However insoluble oxalate was found to be difficult to determine without pretreatment of removing contaminant.

Keywords: oxalic acid, GC, HPLC

1 は じ め に シ ュ ウ 酸 は エ グ 味 の 主 成 分 と 言 わ れ 、 山 芋 や コ ン ニ ャ ク 芋 、 ホ ウ レ ン ソ ウ な ど に 多 く 含 ま れ て い る 有 機 酸 の 仲 間 で あ る 。 最 近 は 消 費 者 ク レ ー ム に 対 す る 原 因 解 明 の た め の 分 析 、 シ イ タ ケ 栽 培 の 生 育 指 標 の た め の 基 礎 デ ー タ 収 集 な ど 、 シ ュ ウ 酸 分 析 の 依 頼 が あ る 。 し か し シ ュ ウ 酸 の 定 量 分 析 に 関 し て は 対 応 で き て い な か っ た 。 シ ュ ウ 酸 以 外 の リ ン ゴ 酸 や 乳 酸 な ど の 有 機 酸 は 、 ポ ス ト カ ラ ム BTB-HPLC 法 で 定 量 分 析 し て い る が 、 不 溶 性 シ ュ ウ 酸 塩 の 分 析 を 目 的 と し た 食 品 か ら の 抽 出 に 塩 酸 を 用 い た 場 合 、 塩 酸 の 影 響 が 大 き く 、 塩 酸 の 大 き な ピ ー ク と 溶 出 時 間 が 近 い シ ュ ウ 酸 の 分 バ イ オ ・ 食 品 係 離 が 難 し い た め 、 こ の シ ス テ ム で は 分 離 定 量 で き な か っ た 。 有 機 酸 の 分 析 手 法 と し て 、 上 記 の HPLC 法 以 外 に 誘 導 体 化 に よ る GC 法 が 知 ら れ て い る 。HPLC 法 に 比 べ 、 分 解 能 が 高 い と い う メ リ ッ ト が あ る が 、 誘 導 体 化 が 必 要 で あ り 、 手 間 が か か る と い っ た デ メ リ ッ ト が あ る 。 一 方 HPLC 法 は 、 誘 導 体 化 の 必 要 は な く 、 前 処 理 が 比 較 的 簡 単 と い っ た メ リ ッ ト が あ り 、 こ れ ま で は 分 析 で き な か っ た も の の 、 分 析 手 法 と し て 捨 て が た い 。 そ こ で 本 研 究 で は 、GC 法 、 HPLC 法 の 両 方 で 、 特 に HPLC 法 は 、 上 記 の 有 機 酸 分 析 シ ス テ ム と は 別 の 条 件 で 、 シ ュ ウ 酸 の 定 量 分 析 を 試 み た 。 ２ 実 験 方 法

GC 法 に つ い て は 、 ブ チ ル エ ス テ ル 誘 導 体 化 法 を 用 い た 。 誘 導 体 化 は 常 法１ ）_{に 従} っ た 。 シ ュ ウ 酸 や そ の 他 の 有 機 酸 標 準 試 料 を そ れ ぞ れ 誘 導 体 化 後 、GC に 注 入 し 、 溶 出 時 間 お よ び 検 量 線 の 直 線 性 を 確 認 し た 。 HPLC 法 に つ い て は 、 沖 ら の 方 法２ ）_{に 準} じ て 行 っ た （ 以 下 HPLC-UV 法 ）。 GC 法 同 様 に 溶 出 時 間 お よ び 検 量 線 の 直 線 性 を 確 認 し た 。 誘 導 体 化 の 手 順 、GC 条 件 お よ び HPLC 条 件 は そ れ ぞ れ 下 記 に 示 し た 。 標 準 物 質 で の 分 析 が 、GC 法 、 HPLC-UV 法 と も に 良 好 だ っ た こ と か ら 、 作 業 の 効 率 を 考 え 、 誘 導 体 化 を 必 要 と し な い HPLC-UV 法 に 絞 っ て 実 サ ン プ ル の 分 析 を 検 討 し た 。 実 サ ン プ ル は キ ャ ベ ツ 、 春 菊 、 ホ ウ レ ン ソ ウ （ 市 内 小 売 店 で 購 入 ） の ３ 点 を 分 析 し た 。 食 品 か ら の 抽 出 は 、 １N 塩 酸 ま た は 蒸 留 水 の ２ つ の 抽 出 溶 媒 を 検 討 し た 。 試 料 の 40 倍 量 の １ N 塩 酸 ま た は 蒸 留 水 を 加 え 、 121℃ で 30 分 間 加 熱 し た 後 、 0.45μ m の メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー で ろ 過 し た も の を HPLC に 供 し た 。 そ の 結 果 、 シ ュ ウ 酸 が ゼ ロ と の 報 告 が あ る キ ャ ベ ツ３ ）_{で シ ュ ウ} 酸 が 検 出 さ れ た た め 、 水 抽 出 の サ ン プ ル に 限 っ て HPLC-BTB ポ ス ト カ ラ ム 法 （ 以 下 BTB 法 ） で も 分 析 し た 。 ＜ 誘 導 体 化 の 手 順 ＞ 標 準 試 料 100mg に 1-ブ タ ノ ー ル ２ mL、 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム ２ ｇ 、 濃 硫 酸 0.2mL を 加 え 、100℃ 、 30 分 で エ ス テ ル 化 を 行 っ た 。 そ の 後 、 水 ５mL と ヘ キ サ ン ５ mL を 加 え よ く 混 合 し 、 ヘ キ サ ン 層 を 取 り 出 し た 。 残 っ た 水 層 に ヘ キ サ ン ５mL を 加 え 同 様 に 抽 出 し た 。 こ れ を ３ 回 繰 り 返 し 、 集 め た ヘ キ サ ン 層 を ヘ キ サ ン で 20mL に し た 。 こ こ に 無 水 炭 酸 ナ ト リ ウ ム を 0.5ｇ 加 え て 硫 酸 を 除 き 、1μ L を GC に 注 入 し た 。 ＜GC 条 件 ＞ 装 置 ： キ ャ ピ ラ リ ー ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ （ 島 津 製 作 所 ）、 注 入 口 温 度 ： 220 ℃ 注 入 量 ：1.0 μ L キ ャ リ ア ガ ス 流 量 ： 1.5ml/min （ He ）、 カ ラ ム ： DB-WAX （ 30m × 0.25mmI.D 、 0.25 μ m 、 J&W Scientific 製 ） 昇 温 条 件 ：50℃ (2min)→ 10℃ /min→ 170℃ →1.2 ℃ /min → 230 ℃ 、 検 出 器 ： 水 素 炎 イ オ ン 化 検 出 器(FID) 検 出 器 温 度 ： 240℃ ＜HPLC 分 析 条 件 ＞ ≪HPLC-UV 法 ≫ 装 置 ： 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ （ 島 津 製 作 所 ）、 カ ラ ム ：Unison UK-C18(4.6mmI.D. ×250mmL. Imtakt 社 製 ) 、 カ ラ ム 温 度 ：37 ℃ 、 移 動 相 :20mM H3PO4、流 速 ： 0.6mL/min、 検 出 器 ： フ ォ ト ダ イ オ ー ド ア レ イ 検 出 器 検 出 波 長 ：210nm 、 注 入 量 ： ５ μL ≪BTB 法 ≫ 装 置 ： 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ （ 日 本 分 光 ）、 カ ラ ム ： Excelpak CHA-E11 （ 300mmL. × 4.6mmI.D. Yokogawa analytical systems ） を ２ 本 連 結 、 移 動 相 ： ３ mM 硫 酸 、 移 動 相 流 速 ： 0.5ml/min 、 反 応 試 薬 ： BTB 溶 液 （0.1mM BTB, 15mM リ ン 酸 二 ナ ト リ ウ ム pH9.6 ）、 反 応 試 薬 流 速 ： 0.5ml/min 、 カ ラ ム 温 度 ：55 ℃ 、 注 入 量 ： 20 μ l 、 検 出 器 ：UV/VIS 多 波 長 検 出 器 （ 検 出 波 長 ：445nm） ＜ 標 準 試 料 ＞ GC 法 で は 、 シ ュ ウ 酸 の 他 、 測 定 対 象 食 品 等 に 含 ま れ て い る と 考 え ら れ る ギ 酸 、 酢 酸 、 乳 酸 、 フ マ ル 酸 、 コ ハ ク 酸 、 リ ン ゴ 酸 、 ピ ロ グ ル タ ミ ン 酸 、 ク エ ン 酸 、 α-ケ ト グ ル タ ル 酸 の 10 種 類 を 用 い た 。 濃 度 は い ず れ も 約 100mg を 精 秤 し 誘 導 体 化 を 行 っ た が 、 標 準 品 は 塩 や 水 和 物 と な っ て い る も の も 多 く 、 酸 と し て 60~100mg で あ っ た 。 ま た シ ュ ウ 酸 の 検 量 線 は 、0 、 50 、 100、 200mg を そ れ ぞ れ 誘 導 体 化 し て 作 成 し た 。 HPLC-UV 法 で は 、 こ れ ま で の 経 験 か ら シ ュ ウ 酸 と 溶 出 時 間 が 近 い と 思 わ れ る グ ル コ ン 酸 、 酒 石 酸 、 ギ 酸 、 リ ン ゴ 酸 、 乳 酸 、 酢 酸 の ６ 種 類 を 用 い て 、 ピ ー ク の 重 な り を 検 証 し た 。 シ ュ ウ 酸 の 検 量 線 は 0.1mg/100mL～ 500mg/100mL で 作 成 し た 。

３ 結 果 ３ ． １ GC 結 果 標 準 試 料 10 成 分 の ク ロ マ ト グ ラ ム を 図 １ の A と B に 分 け て 示 し た 。 シ ュ ウ 酸 標 準 品 の 検 量 線 を 図 ２ に 示 し た 。 分 離 は 良 好 で 、 検 量 線 も 200mg ま で の 誘 導 体 化 で あ れ ば 、 直 線 性 が 得 ら れ る こ と が 分 か っ た 。 実 サ ン プ ル を 想 定 し た 場 合 、 ホ ウ レ ン ソ ウ の よ う に 、 シ ュ ウ 酸 を 100 ｇ あ た り 1000mg 程 度 含 有 す る 食 品 だ と し て も 、 試 料 採 取 量 が 10g 以 下 で あ れ ば こ の 検 量 線 内 で 測 定 可 能 で あ る た め 、 実 質 的 に は 200mg ま で の 検 量 線 で 十 分 と 思 わ れ る 。 図 ２ の 横 軸 は 、 誘 導 体 化 後 の GC に 注 入 し た 検 体 中 の シ ュ ウ 酸 濃 度 を 示 し た 。 ち な み に 図 １ の A に あ る よ う に ピ ロ グ ル タ ミ ン 酸 と α-ケ ト グ ル タ ル 酸 は ２ 本 の ピ ー ク が 現 れ た 。 分 解 に よ る も の と 思 わ れ る が 、 誘 導 体 化 、 そ し て 高 温 で の GC 分 析 が 検 体 に 大 き な 負 荷 を 与 え て い る こ と が わ か っ た 。 図 1A 有 機 酸 標 準 品 の ク ロ マ ト グ ラ ム （ GC 法 ） シ ュ ウ 酸 を 含 め た ４ 成 分 。 そ れ ぞ れ の ク ロ マ ト グ ラ ム を 重 ね 書 き 。 図 1B 有 機 酸 標 準 品 の ク ロ マ ト グ ラ ム （ GC 法 ） シ ュ ウ 酸 を 含 め た ７ 成 分 。 そ れ ぞ れ の ク ロ マ ト グ ラ ム を 重 ね 書 き 。 図 ２ シ ュ ウ 酸 標 準 品 の 検 量 線 （ GC 法 ） 横 軸 は シ ュ ウ 酸 ０ 、 50、 100、 200mg を ブ チ ル エ ス テ ル 化 、 ヘ キ サ ン 抽 出 し 、 20mL に メ ス ア ッ プ 後 の 濃 度 ３ ． ２ HPLC 結 果 標 準 試 料 ７ 成 分 の ク ロ マ ト グ ラ ム を 図 ３ に 示 し た 。 分 離 は ベ ー ス ラ イ ン 付 近 で グ ル コ ン 酸 お よ び 酒 石 酸 と 重 な る 部 分 が あ る が 、 グ ル コ ン 酸 は 、 食 酢 で み ら れ る 成 分 で あ り 、 酒 石 酸 は ブ ド ウ 酒 で み ら れ る 成 分 で あ る な ど 、 シ ュ ウ 酸 を 含 ん だ 試 料 に は あ ま り 見 ら れ な い 成 分 の た め 、 影 響 は 少 な い と 考 え た 。 図 ４ に 1N 塩 酸 で 調 製 し た シ ュ ウ 酸 標 準 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム を 示 し た 。 食 品 か ら の 抽 出 に 用 い る 塩 酸 の 影 響 に つ い て は 、 シ ュ ウ 酸 と 塩 酸 の 溶 出 時 間 の 差 は 約 0.5 分 で 、 ベ ー ス ラ イ ン 分 離 は で き て い な い が 、BTB 法 と は 比 較 に な ら な い ほ ど 改 善 し た 。 塩 酸 の 影 響 の 度 合 い は 、 塩 酸 と シ ュ ウ 酸 そ れ ぞ れ の 濃 度 と の 相 対 的 な 関 係 に よ る が 、 図 ４ に 示 し た よ う に 、 た と え ば 1N 塩 酸 で あ れ ば 、 シ ュ ウ 酸 7.5mg/100mL ま で の 定 量 に は ほ と ん ど 影 響 が な い と 思 わ れ た 。 個 々 の 食 品 の ケ ー ス で 注 意 す る 必 要 は あ る が 、 本 研 究 の 条 件 で は 、 塩 酸 の 影 響 は 小 さ い と 判 断 し た 。 ま た 比 較 し た 他 の 6 つ の 有 機 酸 試 料 が い ず れ も 50mg/100mL で あ る の に 対 し て 、 シ ュ ウ 酸 は 5mg/100mL で あ り 、 210nm に お け る 吸 光 強 度 が 高 く 、 感 度 が 良 い こ と が わ か っ た （ 図 ３ ）。 こ れ は 夾 雑 成 分 の 多 い 実 試 料 を 分 析 す る 上 で も 有 利 な 点 で あ る 。 検 量 線 は 図 ５ に 示 し た よ う に 200mg/100mL ま で は 直 線 性 が 得 ら れ た 。 し か し 50mg/100mL 以 下 に な る と 測 定 値 が 低 く な る 傾 向 が あ っ た 。 理 由 は 分 か ら な い が 、 よ り 正 確 に デ ー タ を 得 る に は 、 サ ン ギ酸 シュウ酸 乳酸 酢酸 フマル酸 リンゴ酸 クエン酸 Intensity min Intensity シュウ酸 コハク酸 ピログルタミン酸（分解？） α-ケトグルタル酸（分解？） min R² = 0.9945 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 面積値 ppm

図 ３ 主 な 有 機 酸 標 準 品 の ク ロ マ ト グ ラ ム （ HPLC-UV 法 ） シ ュ ウ 酸 は 5mg/100mL、 そ の 他 は 50mg/100mL 5μ L 注 入 図 ４ 1N 塩 酸 で 調 製 し た シ ュ ウ 酸 標 準 品 の ク ロ マ ト グ ラ ム （ HPLC-UV 法 ） 図 ５ シ ュ ウ 酸 標 準 品 の 検 量 線 （ HPLC-UV 法 ） プ ル 中 の シ ュ ウ 酸 濃 度 の 近 傍 の 上 下 ２ 点 間 で 検 量 線 を 作 成 す る ほ う が 良 い と 思 わ れ る 。 ３ ． ３ 実 サ ン プ ル の 分 析 結 果 実 サ ン プ ル を HPLC-UV 法 で 検 討 し た 。 図 ６ に 1N 塩 酸 で 抽 出 し た キ ャ ベ ツ の ク ロ マ ト グ ラ ム を 示 す が 、 シ ュ ウ 酸 の 位 置 に ピ ー ク が 現 れ た 。 図 に は 示 さ な い が 水 抽 出 で も シ ュ ウ 酸 の 位 置 に ピ ー ク が 現 れ た 。 し か し キ ャ ベ ツ は シ ュ ウ 酸 が ゼ ロ と の 報 告 が あ る３ ）_{。 そ こ で 水 抽 出 サ ン プ ル に 限 っ て} BTB 法 で 分 析 し た と こ ろ 、 図 ７ の ク ロ マ ト グ ラ ム を 得 た 。 図 ７ の 上 が キ ャ ベ ツ の 水 抽 出 の 結 果 で 、 下 が ホ ウ レ ン ソ ウ の 水 抽 出 の 結 果 で あ る 。 シ ュ ウ 酸 の ピ ー ク が キ ャ ベ ツ で 見 ら れ な い こ と か ら 、HPLC-UV 法 で 得 ら れ た シ ュ ウ 酸 の ピ ー ク （ 図 ６ ） に は 、 シ ュ ウ 酸 以 外 の 成 分 が 重 な っ て い た こ と が 分 か っ た 。 抽 出 に 塩 酸 を 使 用 し な け れ ば 水 溶 性 シ ュ ウ 酸 塩 に 限 っ て は BTB 法 で も 測 定 で き る た め BTB 法 で 改 め て 分 析 し た と こ ろ 、 キ ャ ベ ツ と 春 菊 の シ ュ ウ 酸 含 量 は ゼ ロ で 、 ホ ウ レ ン ソ ウ は 453mg/100g だ っ た 。 不 溶 性 シ ュ ウ 酸 に つ い て は 、 抽 出 に 塩 酸 を 用 い る た め BTB 法 で 分 析 で き な い の は 、 す で に 述 べ た と お り で あ る 。 そ の た め 新 た に HPLC-UV 法 を 検 討 し 、 塩 酸 の 影 響 を 小 さ く し た が 、 逆 に 夾 雑 成 分 を 除 く 必 要 が 生 じ た 。 結 果 と し て 、 実 サ ン プ ル の シ ュ ウ 酸 分 析 は 、 水 溶 性 シ ュ ウ 酸 塩 で あ れ ば BTB 法 で 測 定 で き る こ と が 分 か っ た が 、 不 溶 性 シ ュ ウ 酸 塩 は 夾 雑 成 分 を 除 く た め の 前 処 理 を 工 夫 し な い と 難 し い こ と が 分 か っ た 。 夾 雑 成 分 を 除 く 方 法 の 一 つ と し て 、 エ タ ノ ー ル 可 溶 分 を 除 い た 後 に 、 不 溶 性 シ ュ ウ 酸 塩 を 抽 出 す る 方 法 が 報 告 さ れ て い る ４ ）_{。 抽 出 方 法 に つ い て は 今 後 の 課 題 と し} た 。 図 ６ キ ャ ベ ツ 1N 塩 酸 抽 出 の ク ロ マ ト グ ラ ム （ HPLC-UV 法 ） シュウ酸 グルコン酸 酒石酸 ギ酸 リンゴ酸 乳酸 酢酸 min 塩酸 R² = 0 . 9 9 9 8 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 0 50 100 150 200 250 面積値 m g / 1 0 0 m L

１ 回 目

図 ７ 実 サ ン プ ル の ク ロ マ ト グ ラ ム （ BTB 法 ） 上 ： キ ャ ベ ツ 水 抽 出 、 下 ： ホ ウ レ ン ソ ウ 水 抽 出 （ BTB 法 ） 参 考 文 献 １ ） 松 本 清 編 ： 食 品 分 析 学 、 166 （ 2006 ） 培 風 館 ２ ) 沖 ほ か ： 日 作 九 支 報 、 77 、 68-72 （ 2011） ３ ） 大 川 ほ か ： 三 重 大 学 教 育 学 部 研 究 紀 要 、 自 然 科 学 、 50、 79-87（ 1999） ４ ） 村 上 ほ か ： 岡 山 大 学 農 学 部 学 術 報 告 、 96、 25-28（ 2007）