Title
Interferon-γ produced by bone marrow-derived cells attenuates
atherosclerotic lesion formation in LDLR-deficient mice( 内容の
要旨(Summary) )
Author(s)
丹羽, 民和
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第585号
Issue Date
2004-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14550
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氏 名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 丹 羽 民 和(岐阜県) 博 士(医学) 甲第 585 号 平成16 年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当
Interferon-γ PrOduced by bone marrow-derived ce"s attenuates
atherosc]eroticlesion formationin LDLR-deficient mice
(主査)教授 清 島 満 (副査)教授 藤 原 久 義 教授 小 澤 修 論文内容の要旨 動脈硬化症は変性リボ蛋白と免疫担当細胞や炎症細胞との相互作用により血管壁内で引き起こされる一種の慢 性炎症であると考えられている｡この動脈硬化巣の進展には血管内皮細胞,血管平滑筋細胞,マクロファージお よびリンパ球の4種類の細胞が関与している｡これらの細胞はさまざまなサイトカインを産生し相互に影響し合っ ている｡インターフェロンーγ(IFN-γ)は自然免疫と獲得免疫に作用する代表的なTblサイトカインであり動 脈硬化発症や進展に影響を与えていると考えられている｡ApolipoproteinE(apoE)-/rやlowdesitylipoprotein receptor(LDLR) /.などのノックアウト動脈硬化モデルマウスにおいても,IFN-γの動脈硬化発症や進展に与え る影響が確認されており,それらのデータはIFN-γの動脈硬化促進作用を示している｡IFN-γは主に活性化丁 細胞,N招田胞やマクロファージなどの骨髄由来細胞が産生することから,血管壁内でのこれらの細胞のIFN-γ 産生をブロックすれば,動脈硬化巣の進展を阻止できるはずである｡この仮説を実証するために骨髄移植により LDLR′マウスの骨髄をIFN-γノーマウスの骨髄で置き換え,このキメラマウスにおける動脈硬化巣形成を検討し た｡ [材料と方法] 1)骨髄細胞を置き換えたキメラマウスの作製 6過齢の堆LDLR./マウス(C57BL/6j系)に10Gy TBIの放射線を4時間間隔で2分割照射し,第2回目照射か ら4時間後にIFN-γ′マウス(C57BL/6j系)の大腿骨,脛骨より採取した骨髄細胞5Ⅹ106個を尾静脈より注射 した｡このIFN-γノ骨髄李移殖したLDLR+マウス(IFN-γ+BMTマウス)に高脂肪食(1.25%コレステロール, 15.1%脂肪,0.5%コール酸含有)を負荷した｡高脂肪食負荷後3週,6過,12週での血液分析,脂質解析,動脈 硬化巣の定量をおこなった｡IFN-γ+/+骨髄(wildマウス骨髄)を移殖したLDLRJ/Lマウス(IFN-γ+/+BMTマウ ス)をコント占-ルとして両群を比較検討した｡なお,骨髄移植3週後の血液サンプルよりDNAを抽出し,PCR 解析により末梢血中の白血球置換を確認した｡ 2)血液,組織 ′ 前日より絶食させたマウスを麻酔後,下行大静脈より血液採取し,PBS還流後JL､臓と大動脈を取り出し,心臓 上部をOCTに包埋した｡大動脈基支部は10〝に薄切し,オイルレッド0,エラスチカワンギーソン,ピクロシリ ウスレッド,および免疫組織染色をおこなった｡大動脈はホルマリン固定後長軸方向に切り開き,オイルレッド 0染色をおこなった｡ 3)血祭リボ蛋白解析 自動分析装置により血祭総コレステロール,中性脂肪,ALT,ASTを測定した｡また,FPLCにより血中リ ボ蛋白分画を測定した｡
4)動脈硬化巣の定量 大動脈基支部は100〟おきに6枚のオイルレッド標本をImageJにて画像処理し,6点における動脈硬化巣面積 を定量した｡また,動脈硬化巣内の細胞核数を全視野カウントした｡大動脈内表面の動脈硬化巣割合を①大動 脈弓部②胸大動脈部③腹大動脈部の3ケ所で定量した｡ 5)免疫組織化学染色 OCT包埋アセトン固定切片に対して,MOMA2,CD4,CD8,a-SMAの特異抗体を用い動脈硬化巣内細胞成 分解析をおこなった｡また,抗IFN一γ抗体により動脈硬化巣内でのインターフェロンーγ産生を調べた｡ [結果] 1.高脂食負荷6週後にIFN-γイ BMTマウスの動脈硬化領域がバルサルバ洞,大動脈弓部,腹大動脈部において コントロールマウスより有意に大きかったが,高脂肪食12週後には有意差が消失した｡ 2.動脈硬化領域内単位面積当たりのマクロファージ,T細胞や平滑筋細胞成分は時間の経過とともにいずれも減 少したが,両群に有意の差はなかった｡ 3.動脈硬化巣内細胞数カウントにより,高脂食負荷3週,6過,12過後のいずれの時点においても細胞密度の有 意な低下がIFN-γ,/ BMTマウスにおいて認められた｡これはIFN-γ-/-BMTマウスにおける細胞間質成分の 増加によるものであることがシリウスレッドにより確認された｡ 4.IFN-γ免疫組織染色によりIFN-γ+/+BMTマウスにおいてはプラーク形成細胞にIFN-γが認められたが,多 くはマクロファージによるものとみられた｡一方,IFN-γ / BMTマウスにおいても動脈硬化巣近傍の紡錘型 細胞にIFN-γ産生が確認された｡ [考察] IFN-γはおもに活性化丁細胞により分泌されることから,我々は骨髄由来細胞のIFN-γ産生をブロックすれ ば動脈硬化進展を阻止できると考えた｡しかし予想に反して,高脂肪食6週の時点ではIFN-γノ BMTマウスはI FN-γ+/+BMTマウスより大動脈弁基支部,大動脈弓部,腹大動脈部において有意に増加した｡これらの結果は 骨髄由来細胞の産生するIFN-γは抗動脈硬化的な役割をもち,骨髄由来でない細胞の産生するIFN-γが動脈硬 化形成にはより大きな比重を占めていることが考えられた｡事実,血管内皮や血管平滑筋細胞がIFN-γを産生 しているとの報告もあり,我々もIFN-γノーBMTマウスにおけるIFN-γ産生を免疫組織染色で確認できた｡ 以上の結果より,骨髄由来細胞以外の産生するIFN一γが動脈硬化発症初期においてはより重要な役割を果た していると考えられ,骨髄由来細胞の産生するIFN-γは動脈硬化形成の進行を遅らせるが,この抑制はコラー ゲンなどの細胞間質成分の産生抑制によるものであることが示唆された｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 丹羽民和は,ノックアウト動脈硬化モデルであるLDLR /マウスにおけるIFN-γの動脈硬化に対する 作用をIFN-γ./.マウス骨髄を移植したキメラマウス群とwildマウス骨髄を移植したコントロール群とを比較する ことにより検討した｡その結果,発症初期においては骨髄由来細胞の産生するIFN-γが抗動脈硬化的作用をも ち,骨髄由来以外の細胞が産生するIFN-γが発症早期にはより重要であることを明らかにした｡これらの知見 は,動脈硬化学および臨床検査医学の発展に少なからず寄与するものと考える｡ [主論文公表誌]
Interferon-γprOduced by bone marrow-derived cells attenuates atheroscleroticlesion formationin LDLR-deficient mice
Journalof Atherosclerosis and Thrombosis(in press)
