線虫C. elegansを用いた静水圧負荷に伴う生物応答の研究

線虫C. elegansを用いた静水圧負荷に伴う生物応答

の研究

著者

渡辺 尚

学位授与機関

Tohoku University

学位授与番号

11301甲第19370号

URL

http://hdl.handle.net/10097/00127816

博 士 論 文 （ 要 約 ）

線 虫 C. elegans を 用 い た 静 水 圧 負 荷 に 伴 う 生 物 応 答 の 研 究

令 和 元 年 度

東 北 大 学 大 学 院 生 命 科 学 研 究 科

生 態 シ ス テ ム 生 命 科 学 専 攻

渡 辺 尚

1 目 次 1. 序 論 1.1. 生 理 的 に 負 荷 さ れ る 静 水 圧 に つ い て 3 1.2. 生 理 的 に 負 荷 さ れ る 静 水 圧 の 生 物 メ カ ノ ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン 機 構 に つ い て 4 1.3. 静 水 圧 負 荷 の 利 用 と 生 体 分 子 の 物 理 化 学 的 変 化 に つ い て 5 1.4. 高 圧 力 顕 微 鏡 を 用 い た 研 究 に つ い て 7 1.5. 線 虫 の 各 種 ス ト レ ス 応 答 に 関 わ る DAF-16 転 写 因子 に つ い て 8 1.6. 本 研 究 で 目 指 す も の 9 2. 実 験 材 料 と 方 法 2.1. 本 実 験 に 使 用 し た 線 虫 の 系 統 と 培 養 条 件 10 2.2. 静 水 圧 加 圧 方 法 に つ い て １ (東 北 大 学 超 臨 界 セ ン タ ー の 方 法 ) 11 2.3. 静 水 圧 加 圧 方 法 に つ い て ２ (本 研 究 室 ・ 東 京 大 学 理 学 研 究 科 の 方 法 ) 11 2.4. 静 水 圧 加 圧 方 法 に つ い て ３ (岡 山 大 学 医 学 研 究 科 の 方 法 ) 11 2.5. 静 水 圧 加 圧 処 理 に よ る Ｎ 2 と daf-16 欠 損 型 線 虫 の 生 存 率 計 測 11 2.6. 静 水 圧 に よ る ラ イ ブ 観 察 と DAF-16 局 在 観 察 12 2.7. 一 度 だ け の 静 水 圧 加 圧 に よ る 生 存 率 測 定 13 2.8. 静 水 圧 負 荷 後 の マ イ ク ロ ア レ イ に よ る 網 羅 的 な 遺 伝 子 発 現 解 析 13 3. 結 果 3.1. Forkhead box O (FoxO) /DAF-16 が 関 連 す る 生 理 的 静 水 圧 に よ る 核 移 行 14

3.2. RNAi に よ る DAF-16 核 局 在 の メ カ ニ ズ ム の 探 索 と IMB-2 の 関 わ り 16

3.3. 静 水 圧 負 荷 後 の マ イ ク ロ ア レ イ に よ る 網 羅 的 な 遺 伝 子 発 現 解 析 17

3.4. 静 水 圧 加 圧 処 理 に よ る 線 虫 の 固 定 化 18

2 4. 考 察 4.1. 線 虫 C. elegans の DAF-16 は 生 理 的 静 水 圧 負 荷 に 応 答 し て 即 座 に 核 に 移 行 す る 20 4.2. 生 理 的 静 水 圧 負 荷 に 応 答 す る ヒ ト Transpotin-1/IMB-2 依 存 性 DAF-16 核 局 在 化 22 4.3. DAF-16 転 写 因 子 の 核 移 行 の メ カ ニ ズ ム 23 4.4. 静 水 圧 加 圧 処 理 に よ る 正 の 生 物 応 答 に つ い て 26 5. 引 用 文 献 27 6. 謝 辞 35

3 1. 序 論 1.1. 生 理的 に 負 荷 され る 静 水 圧に つ い て 生 物 が 活 動 す る 上 で 、 か ら だ の 各 組 織 や 器 官 に は 様 々 な 物 理 的 な 刺 激 が 負 荷 さ れ て い る 。 例 え ば 、 筋 肉 や 心 臓 で は そ の 収 縮 や 伸 展 に 伴 う 力 が 、 血 管 の 内 皮 で は 血 流 の 流 れ に 伴 う シ ェ ア ス ト レ ス が 、 骨 格 を は じ め と す る 体 全 体 に は 重 力 が 絶 え ず 負 荷 さ れ て い る 。 こ れ ら の 物 理 的 な 刺 激 や 力 は 、 そ れ ぞ れ の 組 織 や 器 官 の 恒 常 性 を 維 持 、 ま た 、 発 達 さ せ る 上 で 非 常 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 。 逆 に 、 病 気 に 伴 う 寝 た き り 状 態 が 長 く 続 く こ と や 宇 宙 飛 行 士 が 宇 宙 微 小 重 力 下 に 長 期 滞 在 す る こ と で 、 骨 や 筋 の 急 速 な 萎 縮 、 廃 用 性 萎 縮 が 生 じ 、 様 々 な 心 身 の 機 能 低 下 を 来 す こ と が 知 ら れ て き た (Barratt et al., 2008)。 メ カ ノ 刺 激 の 1 つであ る静水 圧と は、 静止し ている 液体 中の 任意の 面に作 用す る圧 力 で 全 て の 方 向 に 対 し て 等 し い 力 が 付 与 さ れ て い る 状 態 の こ と で あ り 、 深 海 の 生 き 物 な ど は 、 そ の 深 さ と 液 体 の 密 度 に 応 じ て 全 て の 方 向 か ら 均 等 に 圧 縮 す る よ う な 圧 力 (静水 圧＝ 水 圧 )を 受け てい る。 人 間のか らだ も、 心臓か ら下に 行く ほど 水圧が 強くな り、 手足 の末 端 で は 最 も 静 水 圧 が 高 い 状 態 に な っ て い る 。 従 っ て 、 長 い 時 間 に わ た っ て 立 ち 仕 事 を し た 際 に 、 足 が む く む 状 態 な ど は 良 く 知 ら れ て い る が 、 こ の 現 象 も 毛 細 血 管 の 内 圧 (血管 静水 圧 )の上 昇に 起因 する も のとい える 。 さ ら に 、 関 節 の 軟 骨 組 織 は 含 水 率 が 約 70％ と 高く剛 性も 有し ている (Montagne et al., 2017)こ と か ら 、 主 な メ カ ノ 刺 激 は 静 水 圧 の 影 響 と し て 捉 え ら れ る こ と が で き る 。 す な わ ち 、 歩 行 や 運 動 な ど の 度 に か か る 加 重 は 、 軟 骨 組 織 の 閉 ざ さ れ た 中 で は 静 水 圧 と し て の 負 荷 が 生 じ 、 こ の 生 理 的 な 静 水 圧 は 予 想 以 上 に 大 き く 、 大 気 圧 0.1MPa の数 十から 数百 倍に 及 ぶ こ と が 知 ら れ て い る。Hodge ら は (1986)、 股 関 節 の 手 術 に よ り 埋 め 込 ん だ 人 工 関 節 に 圧 力 セ ン サ ー を 導 入 し 、 術 後 1 年 以上 経過し 、通常 に戻 った 状態で 、座位 から 起立 した 際 、 股 関 節 に か か る 力 を 測 定 し た と こ ろ 、 瞬 間 的 に は 18MPa の静水 圧が負 荷さ れる こと を 明 ら か に し た （ Hodge et al., 1986）。 また Afohe ら は (1987)、 ヒ ト の 股 関 節 に か か る 通 常 の 圧 力 は 3～10MPa で あると 報告 され ている （Afohe et al., 1987）。

ま た 、 日 常 の 咀 嚼 時 に お け る 咬 合 力 に 関 し て は 、 3～6 歳園 児 163 人 を対象 とし た調 査 報 告 が あ る 。 富 士 フ ィ ル ム 社 の 圧 力 測 定 フ ィ ル ム (プ レス ケー ル)と いう感 圧紙 を用 いて、 画 像 解 析 す る 手 法 に よ る と 園 児 の 平 均 咬 合 圧 は お よ そ 40MPa であり 、瞬間 的に かか る最 大 咬 合 力 は 、 100MPa を超え るこ とも 報告さ れてい る(Higuchi, 2003)。すな わち 、歯 茎の

4 組 織 な ど に は 、 こ の 咬 合 力 に 対 す る 応 力 と し て 静 水 圧 が 負 荷 さ れ る も の と 考 え ら れ 、 こ の 園 児 の デ ー タ の 最 大 値 は 世 界 で 一 番 深 い と さ れ る マ リ ア ナ 海 溝 の 最 深 部 10,911m の 静水 圧 に 匹 敵 す る 。 一 方 で 、 こ の 「 噛 む 」 と い う 動 作 に よ り 歯 茎 が 丈 夫 に な る と と も に 、 顎 の 骨 や 顔 の 筋 肉 の 発 育 を 促 し 歯 並 び に も 良 い 影 響 が 及 ぶ 。 す な わ ち 、 通 常 の 生 活 で は 無 意 識 的 な 場 合 が 多 い 身 近 な メ カ ノ 刺 激 の １ つ で あ る 生 理 的 静 水 圧 の 負 荷 は 、 こ れ ら 組 織 や 器 官 の 恒 常 性 の 維 持 や 強 化 に 不 可 欠 で あ る と い え る 。 1.2. 生 理的 に 負 荷 され る 静 水 圧の 生 物 メ カノ ト ラ ン スダ ク シ ョ ン機 構 に つ いて 組 織 や 器 官 の 恒 常 性 維 持 、 発 達 に 欠 か せ な い メ カ ノ 刺 激 が 、 ど の よ う な 分 子 や 生 化 学 的 な 反 応 を 介 し て 各 々 細 胞 内 に 反 応 が 伝 わ る の か 、 つ ま り 、 メ カ ニ カ ル ス ト レ ス に よ っ て 活 性 化 さ れ る 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 機 構 「 メ カ ノ ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン 機 構 」 を 明 ら か に す る こ と は 恒 常 性 の 維 持 や 発 達 の 仕 組 み を 知 る う え で 重 要 な 鍵 と な る 。 こ れ ま で の 研 究 に よ り 、 生 理 的 静 水 圧 (日 常 の生活 で体 にか かって いる静 水圧)の負 荷が 、 軟骨な らび にそ の細 胞 に お い て マ ト リ ッ ク ス タ ン パ ク 質 や 血 管 内 皮 増 殖 因 子 の 発 現 を 誘 導 す る こ と 、 一 方 で 閾 値 を 超 え る 負 荷 は 、 逆 に 細 胞 死 や マ ト リ ッ ク ス の 崩 壊 に 伴 う 変 形 性 関 節 症 な ど こ れ ら 組 織 や 器 官 に 大 き な 損 傷 を 及 ぼ す こ と が 報 告 さ れ て き た (Ogura et al., 2018)。 例 え ば 、 0.5MPa の静水 圧を周 期的 に発 生させ ること で、 ヒト 関節軟 骨細胞 にお いて は 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス の 蓄 積 を 促 進 さ せ る こ と 、 一 過 性 の 静 水 圧 加 圧 に よ り 硫 酸 化 グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン の 量 を 有 意 に 増 加 さ せ る こ と が 報 告 さ れ た (Ogura et al., 2018)。また 同様 に 1 ～ 5 MPa の周期的 静水 圧(0.25Hz,3hr)を負荷 す ると正 常な 軟骨 細胞の 形態は 変化 させ ない 一 方 、 変 形 性 関 節 軟 骨 細 胞 に は 改 善 効 果 を 示 し 、 細 胞 小 器 官 の 数 を 増 加 さ せ る と い う 報 告 も な さ れ て い る (Pascarelli et al., 2015)。さら に 0.8～10MPa の静水 圧の 負荷は 、ア グリ カ ン お よ び 2 型コ ラーゲ ンなど の軟 骨基 質タン パク質 の遺 伝子 発現を 誘導す るこ と(Elder BD et al., 2009)、 ま た 、 １ MPa の 静 水 圧 負 荷 は MMP(Matrix metalloproteinase)-1 の よ う な マ ト リ ッ ク ス 分 解 酵 素 の 遺 伝 子 発 現 を 抑 制 す る CITED 2 転写 因子を 活性化 する こと (Leong et al., 2011)、 軟 骨 細 胞 に 周 期 的 な 張 力 や 静 水 圧 を 負 荷 す る こ と で 、 血 管 内 皮 増 殖 因 子 (VEGF)の発 現誘 導 が生じ るこ とな どが明 らかに され てき た(Wong et al., 2003;

Beckmann et al., 2014)。 ま た 高 橋 ら は 、 軟 骨 細 胞 様 細 胞 株 に お い て 、 1、 5、 10、 50MPa を 2 時 間 曝 露 し て も 細 胞 生 存 率 に は 影 響 が な い こ と を 報 告 し て お り 、 50MPa と い う 静 水 圧 は

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日 常 的 条 件 で あ る 可 能 性 を 示 唆 し て い る (Takahashi, 1997)。

し か し な が ら 、 過 剰 な 静 水 圧 の 負 荷 は 、 軟 骨 お よ び 軟 骨 細 胞 に 有 害 な 影 響 、 炎 症 や 損 壊 な ど を 誘 発 す る 。 そ の 際 、 MMP のアッ プレ ギュレ ーシ ョン によっ てアポ トー シス の増 加 お よ び 細 胞 外 マ ト リ ク ス の 成 分 の 低 下 を も た ら し 、 骨 関 節 炎 を 導 く こ と が 報 告 さ れ て い る (Elder et al., 2009; Buckwalter et al., 2006; Loenign et al., 2000)。さ らに近 年、Montagne ら (2017)によ る軟 骨前 駆細胞 を用 いた トラン スクリ プト ーム 解析で は、25MPa の静水 圧を 1、 4、 24 時 間 そ れ ぞ れ 持 続 的 に 加 圧 し た 結 果 、 骨 ・ 軟 骨 細 胞 分 化 に お い て 重 要 な 因 子 で あ る SOX-9 やア グリ カ ンおよ び 2 型コ ラーゲ ンなど の遺 伝子 発現が 大幅に 低下 し、 これ ら 複 数 の 遺 伝 子 発 現 の 変 動 は 、 軟 骨 組 織 の 分 解 を 促 進 す る 方 向 に 向 か う こ と 、 す な わ ち 、 過 剰 な 静 水 圧 負 荷 は 変 形 性 関 節 症 発 症 の き っ か け に な る こ と が 示 唆 さ れ た (Montagne et al., 2017)。 一 方 で 、 こ れ ら の 生 理 学 的 静 水 圧 の 負 荷 か ら 大 規 模 な 転 写 発 現 制 御 に 至 る メ カ ノ ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン 機 構 の 分 子 機 序 に つ い て の 多 く は 不 明 で 、 今 後 の 重 要 な 課 題 の 1 つ といえ る 。 そ の よ う な 状 況 の な か で 、 近 年 、 ヒ ト 乳 腺 上 皮 細 胞 を 用 い た 研 究 か ら 、 そ の 細 胞 に 伸 展 刺 激 、 繰 り 返 し の ス ト レ ッ チ 刺 激 を 加 え る こ と で 細 胞 骨 格 ア ク チ ン ス ト レ ス フ ァ イ バ ー の 発 達 が 生 じ る 際 に 、 YAP(Yes-associated protein)タンパ ク質 の細胞 内局在 が細 胞質 から核 へ 移 行 し 、 転 写 活 性 化 補 助 因 子 と し て 働 く こ と が 報 告 さ れ て き た (Codelia et al., 2014)。

こ の メ カ ノ ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン に は 、 c-Jun N-terminal kinase(JNK)の 活性化 によ る Hippo シ グ ナ ル が 阻 害 さ れ 、YAP の脱リン 酸化 を促 すこと によ り核 に移行 し、そ して 転写 の活 性 化 に つ な が る こ と が 証 明 さ れ た (Codelia et al., 2014)。また 、ヒ ートシ ョック によ って YAP-1 の 核 蓄 積 が 誘 導 さ れ 、 そ の 後 細 胞 質 に 移 行 し yap-YAP-1 遺 伝 子 の 欠 損 は 老 化 を 促 進 す る こ と が 示 さ れ た (Iwasa et al., 2013)。す なわ ち組 織 や器官 特異 的な メカノ トラン スダ クシ ョン機 構 の 存 在 が 示 唆 さ れ た が 、 生 理 的 な 静 水 圧 刺 激 に 伴 う 軟 骨 組 織 や 細 胞 に お け る 遺 伝 子 発 現 の 変 動 に お い て 、 YAP の活性 化を 支持 する報 告はな い。 1.3. 静 水圧 負 荷 の 利用 と 生 体 分子 の 物 理 化学 的 変 化 と生 体 に 及 ぼす 影 響 に つい て 古 く 100 年 以上 前から 、加熱 処理 の代 わりに 、生の 食品 に高 い静水 圧を加 えて 、殺 菌 や 加 工 、 調 理 が 行 わ れ て き た 。 Hite ら(1899)は、静 水圧 処理 を施す ことで 、牛 乳の 食味を 大 き く 変 化 す る こ と な く 、 微 生 物 を 殺 菌 し 保 存 性 を 高 め る こ と を 報 告 し て い る 。 1946 年

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に ノ ー ベ ル 物 理 学 賞 を 受 賞 し た Bridgman は、 殻付き 卵 に 500-600MPa の静 水圧を かけ る と 卵 白 な ら び に 卵 黄 が 凝 固 す る こ と を 報 告 し て い る (Bridgman, 1914)。Hayashi らは

200MPa で タ ン パ ク 質 を 処 理 す る こ と で ア ル コ ー ル デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ や ヘ モ グ ロ ビ ン 、 β -ラ ク ト グ ロ ブ リ ン が 分 解 さ れ る こ と を 明 ら か に し 、 高 圧 処 理 を 利 用 し た 食 品 加 工 を 提 言 し た (Hayashi et al., 1987)。日本 の㈱ 明治 屋では 、Hayashi らの 提唱 を 受けて 、加 熱処 理の代 わ り に 400-500MPa で高圧処 理を 常温 にて 10～30 分間 行い、 香味 ・ 色合い の変 化し ない ジ ャ ム の 開 発 に 成 功 し た (Kimura et al., 1994)。また 、Cheftel (1992)も、高 圧処 理は 食品 の 風 味 お よ び 栄 養 素 含 量 を 低 下 さ せ な い の で 、 熱 処 理 の 有 利 な 代 替 物 で あ る こ と を 明 ら か に し て い る 。 近 年 ア メ リ カ の ス タ ー バ ッ ク ス 社 で は 、 600MPa の高圧処理 によ り微 生物の 繁 殖 を 制 御 し た ジ ュ ー ス を 販 売 し て い る (Yamamoto, 2015)。 こ の よ う に 、 100MPa 以上の 高い 静水 圧を利 用した 食品 加工 や殺菌 消毒に 関す る事 例が 報 告 さ れ 実 用 化 さ れ て き た が 、 そ れ ら は 、 圧 力 凝 固 に よ る タ ン パ ク 質 の 変 性 、 さ ら に 、 タ ン パ ク 質 の み に 限 ら ず 、 非 共 有 結 合 で 高 次 構 造 を 作 り 上 げ て い る 核 酸 や 多 糖 類 、 細 胞 膜 (脂 質 と タ ン パ ク 質 の 複 合 体 )な ど 、 生 体 高 分 子 の 立 体 構 造 が 、 高 い 圧 力 に よ っ て 不 可 逆 的 な 変 化 を 来 す 結 果 と 考 え ら れ て い る (Hayashi, 1991)。 静 水 圧 の 負 荷 は 、 生 体 高 分 子 の 分 子 内 あ る い は 分 子 間 の 水 素 結 合 等 を 切 断 し 、 ま た 各 種 分 子 や イ オ ン な ど が 空 隙 を 埋 め る な ど 、 不 可 逆 的 な 構 造 変 化 を 生 じ さ せ る 。 熱 に よ る 生 体 高 分 子 の 変 性 は 広 く 知 ら れ て い る が 、 熱 と 圧 力 は 、 物 質 の 状 態 変 化 と 平 衡 的 性 質 は 逆 の 作 用 と い え る 。 す な わ ち 、 物 資 を 加 熱 す る と 固 体 か ら 液 体 、 気 体 へ と 変 化 す る の に 対 し て 、 加 圧 す る と 逆 に 気 体 か ら 液 体 、 固 体 へ と 変 化 す る 。 し か し な が ら 、 い ず れ も 、 こ れ ら の 物 理 化 学 的 変 化 が 生 体 高 分 子 に 対 し て 影 響 を 及 ぼ し 、 殺 菌 や 加 工 、 調 理 に つ な が る も の と い え る 。 次 に 、 100MPa に至ら ない静 水圧 の負 荷が、 生体高 分子 に及 ぼす事 例につ いて 述べ る。 Noma ら (2018)は 、 50MPa の 高 い 静 水 圧 の 負 荷 が 温 度 依 存 的 に 枯 草 菌 胞 子 の 疎 水 性 を 増 大 す る こ と を 報 告 し て い る (Noma et al., 2018)。 また、Pribenszk ら(2005)は 20～40MPa の高 い 静 水 圧 を 、 イ ノ シ シ の 精 子 に か け て か ら 凍 結 保 存 す る と 、 解 凍 後 の 精 子 の 運 動 性 を 増 加 さ せ る こ と を 報 告 し た (Pribenszk et al., 2005)。 Salmon ら(1975)は、有 糸分裂 を行 って いる HeLa 細 胞 に 、 68MPa の 加 圧 を 施 す と 、 紡 錘 糸 微 小 管 が 急 速 に 脱 重 合 す る こ と を 見 出 し 、 圧 力 が 解 放 さ れ て か ら 10 分後に 再び微 小管 が 重合し 、戻 る現 象が見 出され た(Salmon et al., 1975)。 ま た 、 Hayashi ら (2016)は 細 胞 サ イ ズ の 人 工 脂 質 膜 を 使 い 、 生 物 か ら 単 離 精 製

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し た チ ュ ー ブ リ ン を ジ ャ イ ア ン ト リ ポ ソ ー ム 内 に 封 入 し 、 圧 力 の 負 荷 と 解 放 を 繰 り 返 す 実 験 を 行 っ た 。 60MPa の圧力を 負荷 する と 0.1MPa(１気圧)条 件下 で形 成され てい た人 工脂 質 膜 の 膜 突 起 が わ ず か 数 十 秒 で 短 縮 す る こ と を 見 出 し た (Hayashi et al., 2016)。さら に、 Bartlett ら (1995)は 、 深 海 に 生 存 す る Photobacterium species strain SS9 の 膜 貫 通 型 DNA 結 合 タ ン パ ク 質 の ToxR は、27.2MPa(272 気圧)の加圧 に伴 う細 胞膜の 流動性 の低 下に より活 性 化 し 、 外 膜 タ ン パ ク 質 OmpH 遺伝 子の発 現 を誘導 し、 その 結果、 高圧環 境に 適応 する こ と を 発 見 し た (Bartlett et al., 1995)。す なわ ち 、深海 微生 物に みられ た ToxR は圧 力セン サ ー 転 写 因 子 の 一 つ と も い え る 。 1.4. 高 圧力 顕 微 鏡 を用 い た 研 究に つ い て Taniguchi ら (2003)に よ る と 、 1880 年 代 に は 深 海 か ら 採 取 さ れ た 生 物 を 対 象 に 高 圧 顕 微 鏡 に よ る 観 察 が 実 施 さ れ て い る と 報 告 し て い る 。 1970 年にな って か ら、Salmon ら(1975) は 卵 母 細 胞 の 紡 錘 体 を 観 察 す る の に 高 圧 顕 微 鏡 を 使 用 し て い る 。 し か し Salmon ら(1975) は 、 HeLa 細胞 に 68MPa を負 荷した 後に 圧力 を開放 し細 胞を 固定す るの に 10 分を 要し て お り ラ イ ブ 観 察 を 行 え て い な い 。 観 察 の た め に 重 要 な 生 体 試 料 を 封 入 す る 圧 力 チ ャ ン バ ー は 、 そ れ ま で 耐 圧 性 を 重 視 す る ば か り に ダ イ ヤ モ ン ド や サ フ ァ イ ヤ と い っ た 硬 度 が 非 常 に 高 い 素 材 を 用 い て き た 。 し か し 、 そ れ ら は 対 物 レ ン ズ で 想 定 さ れ る 屈 折 率 と は 大 き く 異 な り 解 像 度 の 低 下 が 問 題 視 さ れ て い た (Nishiyama et al., 2016)。そこ で Nishiyama ら(2013)は、そ れま で高い 静水 圧で ある が 故 に 、 耐 圧 性 能 を 重 視 し て 開 発 さ れ て き た 顕 微 鏡 の 低 い 分 解 能 の 問 題 点 の 改 良 に 取 り 組 ん だ 。 す な わ ち 高 圧 顕 微 鏡 の か な め と な る 高 圧 力 チ ャ ン バ ー を 改 良 し 、 顕 微 鏡 と し て の 光 学 性 能 を 高 め る た め に 、 高 圧 力 チ ャ ン バ ー の 観 察 窓 に ガ ラ ス 基 板 を 使 用 し た 高 圧 顕 微 鏡 を 開 発 し た 。 こ の 顕 微 鏡 の 開 発 に よ り 、 Nishiyama ら(2013)は大腸 菌の べん 毛モー ター が 80MPa～ 120MPa の 静 水 圧 を か け る と 逆 回 転 す る も の の 割 合 が 増 え る こ と を 発 見 し 、 細 胞 機 能 を ダ イ ナ ミ ッ ク に 変 化 さ せ 、 そ れ を ラ イ ブ 観 察 で き る 新 た な 手 法 を 開 発 し た 。 ま た Nishiyama ら (2016)はブ タの 脳か ら精製 した チュ ーブリ ンで微 小管 を調 整し、 高圧力 チャ ンバ ーの窓 剤 に 微 小 管 を 固 定 さ せ る こ と で 、 可 逆 的 に 微 小 管 が 重 合 ・ 脱 重 合 を 繰 り 返 し 形 態 変 化 す る 様 子 を 観 察 す る こ と に 成 功 し た 。

8 こ の Nishiyama らが 開 発した 高圧 顕微 鏡は、 生体試 料を 基板 などに 固定す る必 要が な く 、 ど の 方 向 か ら も 一 様 な 機 械 刺 激 を 与 え る こ と が で き る 。 こ の 高 圧 顕 微 鏡 を 用 い る こ と で 、 生 体 試 料 に 対 し て ラ イ ブ 観 察 で き る と い う 利 点 を 生 か し 、 線 虫 C. elegans を用 いた 静 水 圧 負 荷 に 伴 う 生 物 応 答 の 観 察 に 活 か せ る こ と が 期 待 で き た 。 静 水 圧 を 駆 使 し た 研 究 で は 、 多 細 胞 生 物 そ の も の を 扱 っ た 研 究 は 散 見 さ れ な い 。 線 虫 C. elegans を 用 い た 本 研 究 が 多 細 胞 生 物 に 対 し 静 水 圧 負 荷 を 与 え て 生 物 応 答 を 測 定 す る 最 初 の 研 究 に な っ た 。 1.5. 線 虫の 各 種 ス トレ ス 応 答 に関 わ る DAF-16 転 写 因子 に つ い て

モ デ ル 生 物 の 1 つ線 虫 Caenorhabditis elegans(C. elegans)は、 多細胞 生物と して 最初 に全 ゲ ノ ム 情 報 が 解 読 さ れ 、 そ れ ら は 約 2 万の遺 伝子か ら構 成さ れる。 また、 そ の 4 割 はヒト に お い て も 保 存 さ れ た 共 通 な 遺 伝 子 で 、 様 々 な ヒ ト 疾 患 モ デ ル と し て も 利 用 さ れ て い る 。 線 虫 を 用 い た メ カ ノ 刺 激 の 応 答 に 関 す る 先 行 研 究 に は 、 Kim ら(2007)による 遠心 機を 用い た 過 重 力 影 響 に 関 す る 報 告 が あ る 。 こ の 中 で 、 100G の過重 力の 負荷 、3 時間 後に 約半 数 の 個 体 で 、 DAF-16 転 写因子 が細 胞質 から核 に移行 する 現象 が、DAF-16::GFP 融合タン パ ク 質 の 観 察 に よ っ て 捉 え ら れ た 。 ま た 、 こ の 100G 過重時に おい ても 線虫は 摂食 し、 この 応 答 は 飢 餓 に よ る 影 響 で は な い こ と も 確 認 さ れ た 。 一 方 で 、 こ の 100G によ る DAF-16::GFP の 核 移 行 は 、 線 虫 の touch neuron で 発 現 し て い る MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC mechanosnsory channel の 欠 損 変 異 系 統 に よ り 有 意 に 低 下 す る こ と 、 ま た 、 神 経 伝 達 物 質 セ ロ ト ニ ン の 投 与 に よ っ て も 低 下 す る こ と か ら 、 核 移 行 に は touch neuron を介し 、最 終的に DAF-16 転 写 因 子 を 経 た メ カ ノ シ グ ナ ル ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン の 経 路 が 存 在 す る こ と が 示 さ れ た (Kim et al., 2007)。

一 方 で 、 こ の DAF-16 は、広 くヒ トに まで保 存され た Forkhead box O (FoxO)ファ ミリ ー 転 写 因 子 で 、 こ の 転 写 因 子 は 、 細 胞 の 増 殖 、 分 化 、 寿 命 、 さ ら に は 様 々 な ス ト レ ス 応 答 、 飢 餓 、 高 温 、 酸 化 ス ト レ ス な ど に 関 わ る 因 子 で あ る こ と が 知 ら れ て い る (Succinate, 1996; Kimura et al., 1997; Ogg et al., 1997; Tatar et al., 2003; Kenyon, 2010; Martins et al., 2015)。 DAF-16 は 、 こ れ ら ス ト レ ス に 応 答 し て 、 細 胞 質 か ら 核 に 移 行 し 、 多 数 の 制 御 遺 伝 子 の 活 性 化 や 抑 制 の 制 御 を 行 う 。 ま た 、 そ の 際 、 細 胞 質 で は リ ン 酸 化 型 で 存 在 し 、 脱 リ ン 酸 化 さ れ る こ と に よ り 核 内 に 移 行 す る こ と も 、 ヒ ト 培 養 細 胞 を 用 い た 実 験 系 を 中 心 に 報 告 さ れ て

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い る (Ogg et al., 1997; Toker and Cantley, 1997; Kenyon, 2010; Martins et al., 2015)。こ の脱 リ ン 酸 化 に よ る 核 移 行 に 関 し て は 、 上 述 し た 伸 展 刺 激 に 応 答 す る メ カ ノ 転 写 因 子 YAP との 類 似 性 が 認 め ら れ る 。 ま た 、 近 年 、 ヒ ト な ら び に 線 虫 に お い て 、 酸 化 ス ト レ ス に よ る 生 体 内 の 還 元 化 状 態 の 変 化 に 応 じ て 、 FoxO4 の分 子内 SS 結 合が 乖離 し 、その 結果 、核 内移行 す る 新 規 メ カ ニ ズ ム に つ い て 明 ら か に な り 、 リ ン 酸 化 以 外 の 核 移 行 制 御 機 構 の 存 在 も 知 ら れ て き た (Putker et al., 2013)。 1.6. 本 研究 で 目 指 すも の 以 上 の 知 見 を 踏 ま え る と 、 100MPa を越す高 い静水 圧負 荷を 加える とこに よる 研究 は多 く さ れ て お り 、 食 品 化 学 の 分 野 等 で の 応 用 が 達 成 さ れ て い る が 、 100MPa 以下で我 々が 瞬 間 的 に 接 す る 静 水 圧 や 、 普 段 無 意 識 的 に も 間 断 な く 体 験 し て い る 生 理 学 的 静 水 圧 負 荷 に よ る 生 物 影 響 に 関 し て は 、 殆 ど 明 ら か に さ れ て い な い 。 そ こ で 問 題 点 と し て 以 下 の も の が 挙 げ ら れ る 。 ① 生 理 学 的 静 水 圧 に よ る 正 や 負 の 影 響 に は ど の よ う な 現 象 が 存 在 す る の か ② 生 理 学 的 静 水 圧 を 暴 露 す る 時 間 に 応 じ て 生 体 反 応 に ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ す の か ③ 高 圧 顕 微 鏡 で 多 細 胞 生 物 の 分 子 学 的 メ カ ニ ズ ム を 追 い か け る こ と が で き る の か 本 研 究 で は 、 モ デ ル 生 物 線 虫 C. elegans に関 して高 圧顕 微鏡 を使用 した生 理学 的静 水圧 実 験 を 行 う こ と で 、 以 下 の こ と を 明 ら か に し た い と 考 え 研 究 を 行 っ た 。 ① 1MPa～数 十 MPa の生 理学的 静水 圧負 荷がも たらす 生物 影響 ② 線虫 C. elegans を 用い 、個体 レベ ルで 特に DAF-16/FoxO に着 目した 静水圧 負荷 の影 響 に よ る 分 子 応 答 ③ 静 水 圧 負 荷 に よ る 遺 伝 的 変 異 体 を 用 い た 遺 伝 生 理 学 的 な 解 析 を 行 い 、 多 細 胞 生 物 に お け る 静 水 圧 負 荷 に 伴 う 新 た な メ カ ノ ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン 機 構

10 2. 実 験 材 料 と 方 法

2.1. 本 実 験 に 使 用 し た 線 虫 の 系 統 と 培 養 条 件

実 験 に 用 い た 線 虫 は ， Caenorhabditis Genetic Center （CGC）から 本 所属研 究室 が入 手 し た 系 統 を 用 い た 。

Bristol N2 (Wild type) CF1038: daf-16(mu86)Ⅰ

HBR4: goeIs3[Pmyo-3::GCaMP3.35::unc-54-3’utr, unc-119]Ⅴ RW1596: myo-3(st386)Ⅴ; stEx30[Pmyo-3::GFP + rol-6]

SD1347: ccIs4251[Pmyo-3::GFP::LacZ + Pmyo-3::mitochondrial GFP]Ⅰ TJ356: zIs356 [daf-16p::daf-16a/b::GFP + rol-6(su1006)]

yap-1（ tm1416）： ihEx33[yap-1(SA):: green fluorescent protein (GFP), Pmyo-2::mCherry] ihIs34[yap-1::GFP, lin-15(+)], lin-15(n765)

XA3501:ruIs32 [pie-1p::GFP::H2B + unc-119(+)] III. ojIs1 [pie-1p::GFP::tbb-2 + unc-119(+)]

線 虫 の 培 養 は ， 1974 年に発 表さ れた Sulston and Brenner の 方法 を参 考にし 、直 径 5.5cm プ レ ー ト を 用 い て nutrient growth medium（NGM）寒天 培地（ 以下 の 成分） 上に 餌と して 大 腸 菌 OP50 をまいた 。温度 条件 は 20°C で 飼育を 行っ た。 また、 線虫の 取り 扱い に際し て は 、 線 虫 を 培 地 か ら 洗 い 分 取 す る と き に は M9 緩衝液 （以 下の成 分）を 用い 、大 腸菌液 体 培 地 を 作 製 す る と き は Sulston and Brenner(1974)が発 表され た S basal medium にコ レス テ ロ ー ル を 添 加 し た SB（＋C）を 使用し た(表 1)。

11 2.2. 静 水 圧 加 圧 方 法 に つ い て １ （ 東 北 大 学 超 臨 界 セ ン タ ー の 方 法 ） 東 北 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 附 属 超 臨 界 溶 媒 工 学 研 究 セ ン タ ー に て 、 2016 年～2018 年 に か け て 5MPa～40MPa の静水 圧加 圧装 置を用 い、20℃に 保ち なが ら 5 分～1 時 間の 加圧 実 験 を 行 っ た 。 線 虫 は ボ ト ル 型 の ポ リ エ チ レ ン 容 器 (タ レビ ン：4mL)に空気 が入 らな いよう に 入 れ た 。 線 虫 は 直 径 5.5cm プ レー ト上 で、 餌とし て大 腸菌 OP50 をまい て育 て、M9 緩 衝 液 で 洗 い 流 し て 、 容 器 に 入 れ た 。 2.3. 静 水 圧 加 圧 方 法 に つ い て ２ （ 本 研 究 室 ・ 東 京 大 学 理 学 研 究 科 の 方 法 ） シ ン テ ッ ク 社 の 高 圧 学 習 用 セ ル 『 SEED』を用 い、既 存の 顕微 鏡部分 を外し 本研 究室 （東 京 大 学 鍵 研 究 室 で は 付 随 し た 光 学 顕 微 鏡 の ま ま 使 用 ） に て 、 蛍 光 顕 微 鏡 下 お よ び 実 体 顕 微 鏡 下 で 、 観 察 お よ び 記 録 ・ 計 測 を 行 っ た 。 銅 板 の ガ ス ケ ッ ト の 小 さ な 穴 (0.5～1.5mm)に線 虫 を 入 れ て 撮 影 し 記 録 を 行 っ た (銅 板の 直径 ： 1cm, h=1mm の円 盤) 。 尚、こ の装 置の 通常 の サ フ ァ イ ア ア ン ビ ル セ ル の 加 圧 部 の 突 起 は 直 径 1mm 程度 であ り、 銅板の ガス ケッ トの 穴 が 0.5-0.8mm のも の まで使 用可 能で あるが 、大人 の線 虫(長 さ：1.0-1.2mm)は入 らな い。 本 実 験 で は 、 主 に 子 供 で あ る L1 幼虫 を観察 対象と して 使用 したが 。大人 の線 虫を 使用す る と き は 、 サ フ ァ イ ア ア ン ビ ル セ ル の 加 圧 部 突 起 の 直 径 を 2mm に特 注した もの を使 用 し 、 銅 板 の ガ ス ケ ッ ト の 直 径 を 1.5mm ま で拡 大した もの を使 用する ことで 実験 を行 うこ と が で き た 。 2.4. 静 水 圧 加 圧 方 法 に つ い て ３ （ 岡 山 大 学 医 学 研 究 科 の 方 法 ） 岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 薬 学 総 合 研 究 科 シ ス テ ム 生 理 学 の 成 瀬 研 究 室 に お い て 、 近 畿 大 学 の Nishiyama ら が開 発 した高 圧顕 微鏡 を用い 、2～100MPa まで の静 水圧を 発生 させ 曝露さ せ な が ら ラ イ ブ 観 察 で き る 装 置 を 用 い て 実 験 を 行 っ た 。 2.5. 静 水 圧 加 圧 処 理 に よ る Ｎ 2 と daf-16 欠 損 型 線 虫 の 生 存 率 計 測 野 生 型 で あ る Ｎ 2 と daf-16 欠損型 であ る CF1038: daf-16(mu86)I の 線 虫を用 いて 、毎 日 ５ 分 間 か つ 1MPa の加 圧処理 を施 し、 生理的 静水圧 加圧 によ る寿命 延長効 果の 計測 を行

12 い 、 daf-16 遺伝 子の 欠 損によ る影 響を 測定し た。 直 径 3cm のシ ャーレ の 中で大 腸菌 が添 加され た液体 培地 を入 れて、 それぞ れの 線虫 を 加 圧 群 と 無 加 圧 群 に 分 け て 飼 育 し た 。 大 腸 菌 は LabTIE 社の凍 結乾 燥し た OP50 を使 用し SB(＋ C)緩 衝 液 を 用 い 調 整 し た 。 生 理 的 静 水 圧 加 圧 に よ る 生 存 率 測 定 で は 、 そ れ ぞ れ の 線 虫 は 卵 か ら 孵 化 し て 10 時 間以 内 の L1 を 用い た。30mL ロ ック タイプ のテ ル モシリ ンジ(ss-30Lz)を 使い、2mL の エッ ペ ン ド ル フ チ ュ ー ブ に 培 地 ご と に 線 虫 を 入 れ 、 20℃の水 20mL と 線虫が 入った エッ ペン ドル フ チ ュ ー ブ に 空 気 が 入 ら な い よ う に 封 入 し た 。 そ し て 10mL の窒 素 ガスを 入れ て HENKE 社 製 シ リ ン ジ キ ャ ッ プ (赤コー ド：H20416)で 封入し た。 シリ ンジ内 の窒素 ガス の体 積が 1mL に な る よ う に 注 意 し て ネ ジ を 押 し 込 ん で 固 定 し 5 分 間 加 圧 し た 。 尚 、 卵 を 生 み 出 す 3 日 目 か ら 注 意 深 く L1 線虫を 取り 除き 、親と 一緒に なら ない ように 区別し た。 2.6. 静 水 圧 に よ る ラ イ ブ 観 察 と DAF-16 局 在 観 察 線 虫 の 静 水 圧 応 答 を ラ イ ブ 観 察 す る 手 法 は 以 下 の ３ つ の 方 法 で あ る 。 ① 2.3.に示し たシ ン テック 社の 高圧 学習用 セル『SEED』を用 いた 方法 ② 2.4.Nishiyama らが 開発し た高 圧顕 微鏡を 用いた 方法 ③ 2.5.に示し たシ リ ンジを 用い た方 法 い ず れ の 場 合 に も ， 一 長 一 短 が あ る 。 例 え ば 、 ① で は 価 格 が 安 価 で あ り 扱 い や す い が 、 加 圧 部 分 の 体 積 が 小 さ い の で 一 度 に 入 れ る サ ン プ ル 数 が 限 ら れ 、 ま た 圧 力 の 値 が 観 察 中 で も 分 か ら な い 。 ② で は 、 詳 細 な ラ イ ブ 観 察 を 行 え る 利 点 が あ る が 、 サ ン プ ル を 回 収 す る の に あ た り 緩 衝 液 と サ ン プ ル が 混 合 さ れ 加 圧 後 の サ ン プ ル 回 収 が 困 難 で あ る 。 ③ で は 肉 眼 で の ラ イ ブ 観 察 が 可 能 で あ り 、 反 応 前 後 の サ ン プ ル の 出 し 入 れ が 速 や か で あ る が 、 シ リ ン ジ 内 の 空 気 を 圧 縮 す る た め 大 き な 静 水 圧 （ 例 え ば 50 気圧 以上 に相 当す る 5MPa 以上） を 加 圧 す る の に は 、 プ ラ ス チ ッ ク 製 の シ リ ン ジ が 耐 え 切 れ ず 破 損 す る 可 能 性 が あ る 。 静 水 圧 加 圧 に は シ リ ン ジ の 耐 久 限 度 と 圧 力 に よ る 破 損 な ど を 避 け 安 全 性 を 考 慮 し な け れ ば な ら な い 。 し か し 、 ① ～ ③ の 良 さ を 組 み 合 わ せ る こ と で 、 条 件 に 適 し た 線 虫 C. elegans の ライ ブ 観 察 を す る こ と が 可 能 と な っ た 。

13 加 圧 処 理 後 、 線 虫 を 1%パラホ ルム アルデ ヒ ドで 1 分以 内に 固定し 、蛍光 顕微 鏡(BX51, Olympus)、 ま た は 蛍 光 ス テ レ オ 顕 微 鏡 (SMZ18, Nikon)で 観 察 し 、 蛍 光 画 像 を CCD カ メ ラ (DP73, Olympus)で 記 録 し た 。 2.7. 一 度 だ け の 静 水 圧 加 圧 に よ る 生 存 率 測 定 方 法 2.4 に より 、N2 の L1 幼虫 を使 用し 、一 度 だけの 静水 圧加 圧処理 が及ぼ す影 響を 調 査 し た 。 20MPa, 30MPa, 70MPa(およ びコ ント ロール)の加 圧処 理を 行 った後 、大 腸菌 入り の 液 体 培 地 に L1 幼虫 を直 径 3cm の シャー レ の中に 戻し 、そ れぞれ の線虫 を加 圧群 と無加 圧 群 に 分 け て 飼 育 し た 。 大 腸 菌 は LabTIE 社 の凍結 乾燥 した OP50 を使用 し SB(＋C)バッ フ ァ ー を 用 い 調 整 し た 。 L1 幼 虫が 成長 して 卵 を産む よう にな ったら 注意し て卵 や新 たに 生 ま れ た L1 幼 虫を取 り除く よう に注 意した 。生存 率は 加圧 処理後 、全て 死亡 する までの 21 日 間 測 定 を 行 っ た 。 2.8. 静 水 圧 負 荷 後 の マ イ ク ロ ア レ イ に よ る 網 羅 的 な 遺 伝 子 発 現 解 析 実 験 で 使 用 し た 線 虫 約 300 匹 を M9 buffer を用 いて回 収し 、100μ L 以 下にな るよ うに 分 取 し 、 2 mL 容 量のス ク リュー キャ ップ プラス チック チュ ーブ に入れ た。そ の容 器に 1 mL TRIzol reagent（ Gibco BRL CO., Ltd.） を 加 え -80℃ に て 凍 結 融 解 し た 。 後 日 解 凍 の 時 に ジ ル コ ニ ウ ム ビ ー ズ （ 直 径 0.5 mm, 0.3 g）を入 れ、Micro Smash MS-100R (Tomy Seiko, Japan) を 用 い て 5,000 rpm 60 秒 を ２ 回 行 う こ と で 線 虫 を 破 砕 し た 。 そ の 後 、 ク ロ ロ ホ ル ム 処 理 、 イ ソ プ ロ パ ノ ー ル 沈 殿 法 に 従 い 粗 抽 出 物 を 純 化 し total RNA を得た。

得 ら れ た RNA は宇宙 開発機 構 東端 晃主 任研 究員、 株式 会社 エイ・ イー・ エス に外 注 し 、 解 析 デ ー タ を 得 た 。

14 3. 結 果

3.1. 静 水 圧 負 荷 に 伴 う 線 虫 の Forkhead box O (FoxO) /DAF-16 の 核 移 行

線 虫 FoxO/DAF-16 転 写 因子は 、飢 餓、 酸化ス トレス 、高 温ス トレス 、放射 線照 射な ど 様 々 な ス ト レ ス に 応 答 し て 細 胞 質 か ら 核 に 移 行 し 活 性 化 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 そ こ で 、 静 水 圧 の 負 荷 に よ っ て も DAF-16 が活 性 化する かど うか 、簡易 型の静 水圧 負荷 装置シ ン テ ッ ク 社 『 SEED』を 用いて(実験 材料 と方 法 2.3 参照)、TJ356 系統(DAF-16::GFP 組換 え 遺 伝 子 を 有 す る )の GFP シグナ ルの ライ ブ観 察を行 った 。TJ356 L1 幼虫 を M9 緩衝 液で 満 た し た 直 径 0.5mm の銅 板ガス ケッ トに 入れ、 気泡が 入ら ない ように して、 上下 から サフ ァ イ ア ア ン ビ ル セ ル で 挟 み 、 蛍 光 顕 微 鏡 下 で DAF-16::GFP シグナ ル の加圧 に伴 う変 化を ラ イ ブ 観 察 し た 。 そ の 結 果 、 加 圧 前 の 線 虫 は ガ ス ケ ッ ト 内 で 活 発 に 動 き 、 DAF-16::GFP の シ グ ナ ル は 体 全 体 の 細 胞 質 に 広 く 分 散 し て い た 。 徐 々 に 、 ハ ン ド ル を 回 し 加 圧 す る こ と で 、 線 虫 の 動 き が 鈍 く な り 、 最 終 的 に は 直 線 状 に な っ て 動 き が 完 全 に 停 止 し た 。 そ の 状 態 で 観 察 を 続 け る と 、 2 分後に は DAF-16::GFP のシグ ナル の核 移行が 、咽頭 周辺 の筋 細胞な ら び に 腸 細 胞 、 上 皮 細 胞 な ど で 観 察 さ れ は じ め 、 5 分 後に はほ とん どが核 内に 移行 した。 す な わ ち 、 静 水 圧 の 負 荷 に よ っ て 速 や か に DAF-16::GFP の活性化 が 生じる こと が明 らか に な っ た 。 さ ら に 、 同 圧 力 状 態 で 15 分間保 持し、 その 後 、ハン ドル を戻 し減圧 するこ とで 、線 虫 の 動 き が 戻 る と と も に 、 DAF-16::GFP は数 分 内に細 胞質 に戻 ること を確認 した 。 簡 易 型 SEED を用いた 系では 、線 虫に かかる 静水圧 の力 を測 ること ができ ない ので 、 Nishiyama ら が 開 発 し た 高 圧 顕 微 鏡 (実 験 材 料 と 方 法 2.4 参 照 )を 用 い て 、 同 じ く TJ356 系 統 の L1 幼 虫に 対して 、20MPa，40MPa，70MPa の加圧を 行っ た。 その結 果、 圧力 を増す に つ れ て 線 虫 の 動 き が 緩 慢 に な る と と も に 、 70MPa を負 荷し た際に 、速や かに 動き が停 止 し 直 線 状 に な る こ と を 確 認 し た 。 ま た 、 DAF-16::GFP の 核移行 は、20MPa の圧 力で は 5 分 後に ほぼ 9 割の個 体で 核移 行 が 観 察 さ れ 、 40MPa 以上で は 5 分 後に は全て の個体 で DAF-16::GFP の核移 行を 観察 し た 。 高 圧 顕 微 鏡 下 に お い て も 70MPa の静水 圧加圧 を 5 分 負荷 して から圧 力を減 じる こと で 、 線 虫 の 運 動 性 が 回 復 す る と と も に 、 数 分 内 に お い て DAF-16::GFP が核か ら細 胞質 へ

15 の 再 移 行 す る こ と も 確 認 し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 簡 易 型 SEED を用いた静 水圧 加圧 実験の 再 現 性 が 得 ら れ 、 SEED で観察し た線 虫が 固 定化さ れる 条件 はほ ぼ 70MPa の加圧 であ っ た こ と を 示 し た 。 Nishiyama ら (2013)の 高 圧 顕 微 鏡 シ ス テ ム は 、 加 圧 を 示 す ゲ ー ジ 目 盛 り の 最 小 値 が 1MPa で あ る 。 従 っ て 検 出 限 界 に 近 い 5MPa 未満 の 圧力負 荷実 験に は適さ ないと 判断 し、 シリン ジ を 用 い た 1MPa の加 圧(実験 材料 と方 法 2.5 参照)を 行っ た。 但し 、 この際 には 、シ リン ジ か ら サ ン プ ル を 取 り 出 し 、 線 虫 を 1%パラ フォル ムア ルデ ヒドで 固定す るの に約 1 分間 を 要 し た 。 そ の 結 果 、 コ ン ト ロ ー ル 区 で は 用 い た L1 幼 虫の 約 2 割 弱の個 体に おい て核移 行 し て い る も の が 観 察 さ れ た が 、 1MPa 5 分間 の加圧 後 は 5 割 の個体 におい て核 移行 が観 察 さ れ 、 さ ら に 20 分間 の加圧 で は 9 割 の個体 にまで 核移 行が 生じ、1MPa の静水圧 負荷 に よ っ て も 、 DAF-16 の活性 化が 有意 に生じ ること を確 認し た。 以 上 の 結 果 か ら 、 静 水 圧 の 負 荷 の 強 さ や 時 間 に 応 じ て 、 線 虫 の FoxO/DAF-16 転写因 子 は 速 や か に 活 性 化 さ れ 、 細 胞 質 か ら 核 に 移 行 す る こ と を 明 ら か に し た 。 ま た 、 こ れ ま で の 報 告 の あ る 飢 餓 や 高 温 (34℃～35℃)など のス トレス 刺激 では 、少な くと も 30 分以 上の 処 理 時 間 を 要 し 、 さ ら に 、 一 度 核 内 に 移 行 し た DAF-16::GFP はその 後 しばら く核 内に 安定 に 留 ま る こ と か ら 、 今 回 見 出 し た 静 水 圧 負 荷 に 伴 う DAF-16::GFP の活性化 は非 常に 速 く 、 か つ 可 逆 的 な 生 物 応 答 反 応 で あ る こ と が 示 さ れ 、 さ ら に 静 水 圧 負 荷 に 伴 う 量 的 、 時 間 的 な DAF-16 の活性 化 機構の 存在 が明 らかに した。 L1 幼 虫 に 対 し て 、 一 度 、 5MPa， 10MPa の そ れ ぞ れ の 生 理 的 静 水 圧 で 5 分 間 加 圧 し 、 そ の 後 加 圧 を 止 め て 圧 力 を 10 分間 程常 圧に 戻し 圧力を 開放 して から、 再び同 じ静 水圧 の大 き さ で 5 分 間加 圧をし たとこ ろ、 速や かに核 移行を 認め るこ とがで きた。

ま た 、 線 虫 yap-1（tm1416）の L1～ L2 幼虫 に対し て SEED で 70MPa に加圧 し観察 する と 、 DAF-16 は 速や か に核移 行が 認め られた のに対 して 、加 圧時間 が 15 分経 過し ても YAP-1 は 核 移 行 が 見 ら れ な か っ た 。

16

3.2. RNAi に よ る DAF-16 核 局 在 の メ カ ニ ズ ム の 探 索 と IMB-2 の 関 わ り

3.1.の 実 験 で は 、 速 や か な DAF-16 の 核 移 行 が 生 理 的 に 耐 え ら れ る 1～ 70MPa の 静 水 圧 加 圧 に よ り 起 こ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 し か し 、 DAF-16 転写 因 子が核 内に 移行 するた め に は 、 様 々 な 経 路 が 知 ら れ て い る 。 1.5.で 述べた よう に線 虫は重 力の力 を生 物学 的シグ ナ ル 伝 達 に 変 換 し て 感 知 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 Kim ら(2007)は重力応 答 で 100G を 3 時 間 加 重 し た 条 件 で は 、 重 力 加 重 負 荷 に よ る 特 異 な メ カ ノ シ グ ナ ル ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン の 経 路 が 存 在 す る こ と を 示 し た 。 そ の シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に つ い て は MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC チ ャ ネ ル を 経 由 し て 、 DAF-16 を 活 性 化 さ せ る こ と 、 ま た 外 因 性 セ ロ ト ニ ン や 、 抗 う つ 薬 で あ り 選 択 的 セ ロ ト ニ ン 再 取 り 込 み 阻 害 薬 で あ る フ ル オ キ セ チ ン の 投 与 が 、 重 力 加 重 に よ っ て 誘 発 さ れ た DAF-16 の核 移 行を抑 制で きる ことを 示して いる 。 Kim らが 示 し た 経 路 で 関 わ る mec-4、mec-10、あ るい は 神経伝 達物 質の セロト ニンの 投与 によ って も 、 RNAi 法に より逆 遺伝学 的に 静水 圧負荷 におけ る DAF-16::GFP のシグ ナル 伝達 とは 異 な る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 同 様 に 酸 化 還 元 反 応 を 伴 う ROS シグナル によっ て DAF-16 の 核 移行が 促進 され る こ と が 示 さ れ 、 そ の 核 移 行 に は imb-2 が関 わ ること が報 告さ れてい る(Putker et al., 2013) が 、 我 々 の 実 験 か ら は imb-2 の RNAi によ って 核移行 を示 さな かった 。

す な わ ち 、 酸 化 ス ト レ ス に よ る DAF-16 の 核 移行に 必須 のヒ ト transportin-1 の オル ソロ グ で あ る imb-2 は、 静 水圧負 荷に よる 核移行 におい ても 必須 である ことを 逆遺 伝学 的解析 に よ り 示 し た 。

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3.3. 静 水 圧 負 荷 後 の マ イ ク ロ ア レ イ に よ る 網 羅 的 な 遺 伝 子 発 現 解 析

野 生 型 N2 と daf-16 欠 損変異 体 CF1038 株に 対して 、10MPa 前後の 静水圧(5MPa， 10MPa， 20MPa)を 5 分 間 負 荷 し 、 そ の 後 、 30 分 、 2 時 間 培 養 後 の 遺 伝 子 発 現 の 変 動 (3 反 復 )を DNA マイ クロア レイ法 によ り調 べた。 その結 果、 野生 型 N2 におい て、5 分加 圧処 理 、 30 分 後に 2 倍以 上 発現変 動し た遺 伝子 は 10 遺伝子(上昇)と 506 遺伝子(低下)であ っ た 。 一 方 、 同 条 件 下 の daf-16 変 異体で は、2 遺伝子(上昇)と 10 遺 伝 子(低下 )でほ とん ど変 化 が 見 ら れ な い こ と 、 2 時間後 にお いて 上下 変化す る遺 伝子 はそれ ぞれ増 えた が、 共通す る も の は 2 遺伝 子(上 昇 )と 138 遺伝 子(低 下)で 、静水 圧加 圧に よる初 期応答 とし ては 、そ の 多 く が DAF-16 の 制 御によ る転 写抑 制であ ること が明 らか になっ た。

今 回 、 変 動 が み ら れ た 遺 伝 子 に は 、 Activated in Blocked Unfolded protein response abu 遺 伝 子 や そ の orthologs な らび に 24 のコ ラー ゲ ン col 遺 伝子 、14 の C-type レ クチ ン clec 遺 伝 子 な ど が 含 ま れ て い た 。

ま た 、 40MPa 5 分間処 理を行 い 24 時 間後 のマ イクロ アレ イ解 析では 加圧直 後に 低下 し た 211 遺伝子 (abu、col な ら び に clec 遺 伝 子 を 含 む )で 発 現 の 誘 導 が み ら れ た こ と か ら 、 一 過 的 な 静 水 圧 の 負 荷 は DAF-16 の 速や かな 核 移行に より 、そ の制御 遺伝子 の発 現抑 制、そ の 後 、 し ば ら く し て 転 写 の 活 性 化 に 転 じ る こ と が 示 さ れ た 。 遺 伝 子 発 現 の 全 体 像 は 、 N2 の野生型 と daf-16 欠損型 とで は、 遺伝 子発現 が二 極化 して い る こ と が 読 み 取 れ た 。 す な わ ち 静 水 圧 負 荷 に よ っ て DAF-16 依 存 性の遺 伝子 が数 多く変 動 し て い る 。 ま た 40MPa の静 水圧 を 5 分 間負 荷す ると、 およ そ 10MPa の静水圧 を負荷 した 場合 と同 様 に 遺 伝 子 発 現 が 二 極 化 す る こ と が 判 明 し た 。 ま た 、 コ ラ ー ゲ ン 関 係 の 遺 伝 子 は 、 2 時間 経 過 後 ま で 一 度 ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー ト し た も の が 、 7 時 間後 には アッ プレギ ュレ ート に転 じ 、 24 時 間後に はア ッ プレギ ュレ ーシ ョンの 変動が 大き くな ること が明ら かに なっ た。 こ の 傾 向 は 、 関 係 の 遺 伝 子 (cul)や 、C 型レ ク チンで あ る clec、ま た 細胞外 マト リッ クスの 分 解 を は じ め と し 、 細 胞 表 面 に 発 現 す る タ ン パ ク 質 の 分 解 や 生 理 活 性 物 質 の プ ロ セ シ ン グ な ど に 関 わ る nas 遺 伝 子など で、 一度 ダウン レギュ レー トが かかっ たのち に、 アッ プレギ ュ レ ー シ ョ ン が か か る 様 子 が 見 ら れ た 。 ま た 、 静 水 圧 負 荷 に よ る ヒ ト 症 候 群 オ ル ソ ロ グ 関 連 の 遺 伝 子 発 現 を 以 下 に 示 す 。 コ ラ ー ゲ ン 遺 伝 子 と 同 様 に 、 繊 毛 関 連 遺 伝 子 は 、 生 理 的 静 水 圧 に よ っ て 初 期 段 階 で 抑 制 さ れ 増

18 加 す る 。 例 え ば 、 繊 毛 機 能 不 全 で 常 染 色 体 劣 性 遺 伝 で あ る バ ル デ ・ ビ ー ド ル 症 候 群 bbs 遺 伝 子 や 、 繊 毛 関 連 症 候 群 の 一 つ で あ る メ ッ ケ ル ・ グ ル ー バ ー 症 候 群 に 関 連 す る mks 遺伝 子 で は 、 コ ラ ー ゲ ン 遺 伝 子 と 同 様 に 生 理 的 静 水 圧 に よ り 初 期 段 階 で は 遺 伝 子 発 現 が ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー ト さ れ る が 、 7 時間 以上 経過 する と増加 に転 じア ップレ ギュレ ート され る。 3.4. 静 水 圧 加 圧 処 理 に よ る 線 虫 の 固 定 化 静 水 圧 応 答 と 線 虫 の 挙 動 を 観 察 し て い る と 、 70MPa の静 水圧 を負 荷する と、M9 緩衝液 中 の 線 虫 が 、 C-shape 運動が でき なく なり、 硬直し 動け なく なり、 固定化 され るこ とを見 出 し た 。 さ ら に 70MPa という 静水 圧か ら解放 すると 、線 虫は 動き出 すこと がで き。 本学 お よ び 東 京 大 学 ま た 、 岡 山 大 学 に お い て の ラ イ ブ 観 察 で は 、 こ の 方 法 で 線 虫 を 固 定 化 し た 像 を 得 る こ と が で き た 。 ま た 、 70MPa 以外の 静水圧 でも 岡山 大学 の Nishiyama ら(2015)の 方 法 や 、 SEED を使用 したラ イブ 観察 をする ことが でき た。 3.5. 静 水 圧 加 圧 処 理 に よ る 生 存 率 ① 静水圧 加圧 処理 による Ｎ2 と daf-16 欠 損型 線 虫の生 存率 計測 方 法 2.5 に より 、30mL の注射 器を 用い 、シリ ンジ に 20mL の 水を 入 れたの ち、10mL の 窒 素 ガ ス を 満 た し た 。 ピ ス ト ン を 押 し 込 み 気 体 の 体 積 を 1mL に して ボイル ・シ ャル ルの 法 則 に 基 づ い た 1MPa の環境 を作 った 。その 中に、 野生 型で ある N2 と daf-16 欠損 型の 線 虫 に 対 し て 、 そ れ ぞ れ L1 幼虫 期か ら継 続し て 、毎日 、1 回 1MPa、5 分間の 静水 圧加 圧処 理 を 行 っ た 。 尚 、 N2 および daf-16(-)の 生存 率 が 50%を切る とこ ろま でを計 測し た。 コン ト ロ ー ル 区 と 比 較 し て 、 野 生 型 N2 にお いて は 6 日 目か ら有 意な寿 命の延 長効 果を 確認 し 、 9 日 目ま で有 意差 を認め るこ とが でき、 静水圧 加圧 によ り寿命 が延び る傾 向を 認め た 。 ま た 、 daf-16 欠 損 型にお いて は、N2 が有 意差を 示し た 6 日目以 降も生 存率 に有 意差 を 認 め る こ と が で き ず 、 寿 命 延 長 の 効 果 を 認 め る こ と が で き な か っ た 。 ② 一度だ けの 静水 圧加圧 による 生存 率測 定 方 法 2.4 に より 、N2 の L1 幼虫 を使 用し 、一 度 だけの 静水 圧加 圧処理 (20MPa，30MPa， 70MPa)が 及 ぼ す 影 響 を 調 査 し た 。 70MPa で は 、 致 死 的 に 働 き 飼 育 後 5 日 で 全 滅 し た 。 一

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方 、 20MPa や 30MPa の加圧処 理で は、 コント ロール に比 べて 、飼育 後 6 日 以降 に致 死率 の 低 下 が 見 ら れ た 。

20 4. 考 察 4.1. 線 虫 C. elegans の DAF-16 は 生 理 的 静 水 圧 負 荷 に 応 答 し て 即 座 に 核 に 移 行 す る DAF-16 の 核 移 行 に 関 し て は 、 線 虫 の 餌 で あ る 大 腸 菌 を 与 え な い こ と に よ る 飢 餓 (30min-1hr)、 通 常 20℃ 温 度 条 件 で 飼 育 さ れ て い る 環 境 を 10℃ 以 上 、 上 回 っ た 環 境 に 置 く ヒ ー ト シ ョ ッ ク (34-35℃ ：30min-4hr)、 活性 酸素種 (ROS)を発生 しや すい環 境に線 虫を 置く 酸化ス ト レ ス (30min-1hr : juglon200μM)、X 線の照 射(20min : 100Gy)ある いは遠 心機 によ る加重 力 負 荷 (3hr : 100G)など のスト レス 刺激 などの 研究成 果が 報告 されて おり、 核移 行に 要す る 時 間 は 、 数 十 分 か ら 数 時 間 の 処 理 時 間 を 要 す る 。

フ ォ ー ク ヘ ッ ド ボ ッ ク ス の O(FoxO)転写因子 は、代 謝や 発生 、そし て長寿 に関 係し 、す な わ ち 老 化 を 制 御 す る 転 写 因 子 と し て 知 ら れ て い る 。 こ れ は 酵 母 や ハ エ か ら ヒ ト に ま で 保 存 さ れ て お り 、線 虫 で は DAF-16 と して同 定 されて いる 。ま た FoxO/DAF-16 は、酸化 スト レ ス 、 熱 、 DNA 損傷、 栄養素 欠乏(Succinate, 1996; Kimura et al., 1997; Ogg et al., 1997; Tatar et al., 2003; Kenyon, 2010; Martins et al., 2015))な ど の 様 々 な ス ト レ ス 刺 激 に 応 答 し 、 細 胞 生 存 の た め の 重 要 な 調 節 因 子 で あ る 。 こ れ ら は 、 刺 激 に 応 答 し て 細 胞 質 か ら の 核 移 行 に よ っ て 活 性 化 さ れ る 。さ ら に 、FoxO3a は 、血 管平 滑筋細 胞に おけ るマト リック スメ タロ プロテ ア ー ゼ (MMP)13 を活 性 化し (Yu et al., 2018)、低酸素 スト レス 時にグ ルカゴ ンに より 発現が 誘 導 さ れ る 転 写 共 役 因 子 CITED2 の発 現を 制 御する こと が報 告され ている(Bakker, 2007)。 さ ら に 最 近 の 報 告 で は 、 FoxO1 および FoxO3 転写因 子が 、 KO マウ ス分析 を用 いて 軟骨恒 常 性 お よ び 骨 関 節 炎 を 調 節 す る の に 重 要 で あ る こ と が 示 さ れ て い る (Matsuzaki et al., 2018)。 FoxO/DAF-16 は 様 々 な ス ト レ ス 経 路 か ら の シ グ ナ ル を 受 け る こ と で 脱 リ ン 酸 化 さ れ 細 胞 質 か ら 核 へ 移 行 す る 。 そ し て 下 流 の 遺 伝 子 を 制 御 す る こ と で 様 々 な ス ト レ ス に 対 し て 耐 性 機 構 を 担 う こ と に な る 。シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 主 な も の と し て 、IIS pathway はイ ンス リン・ IGF(イ ン ス リ ン ・ グ ロ ー ス フ ァ ク タ ー )経 路 が あ り ， Insulin/IGF receptor (DAF-2) か ら の シ グ ナ ル で PI3 キ ナーゼ 、AKT キナ ーゼが 活性 化する こと で DAF-16 のリン 酸化 が起 こり 、 核 移 行 を 抑 制 し て い る (Ogg et al., 1997; Toker and Cantley, 1997; Kenyon, 2010; Martins et al., 2015)。

従 来 知 ら れ て い る 、 DAF-16 の核 移行に 関し て は、 IIS pathway の他 に 様々な 経路 の存 在 が 知 ら れ て い る 。 数 十 分 か ら 数 時 間 か か る 報 告 が 主 だ っ た DAF-16 の核移 行で ある が、静

21 水 圧 を 負 荷 さ せ た 条 件 に お い て は 、1MPa の静 水圧条 件で さえ 、5 分 で約 5 割の 線虫 に核移 行 が み ら れ 、20MPa 以上にな ると 、5 分 以内 で核移 行が 見ら れるも のが 90％ を超え て見 ら れ る よ う に な っ た 。 生 体 に 対 し て 重 篤 な 被 害 を 及 ぼ さ な い 程 度 の 生 理 的 静 水 圧 を 負 荷 し た こ の 研 究 で は 、細 胞 質 に リ ン 酸 化 さ れ て 存 在 す る DAF-16 転写 因子 が、数分 以内 に核 に迅 速 に 移 行 す る こ と で 、 非 常 に 速 い 生 物 応 答 反 応 を 示 す こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 細 胞 増 殖 に 関 与 す る 遺 伝 子 の 転 写 を 活 性 化 す る YAP-1 は上 皮細胞 で 35℃等 の高 温 で 核 移 行 す る こ と が 知 ら れ て い る が 、静 水 圧 加 圧 処 理 で は YAP-1 は核移 行を 起こ さない こ と を 示 し た 。 従 っ て 、 こ の 研 究 に よ り 現 在 ま で 知 ら れ て い る 既 存 の 経 路 と は 全 て 異 な り 、 す な わ ち 、 DAF-16 核 移 行 の シ グ ナ ル 伝 達 は 、 今 ま で 知 ら れ て い な い 経 路 を 辿 っ て い る こ と を 示 す こ と が で き た 。

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4.2. 生 理 的 静 水 圧 負 荷 に 応 答 す る ヒ ト Transpotin-1/IMB-2 依 存 性 DAF-16 核 局 在 化

C. elegans FoxO/ DAF-16 転 写 因 子 の 核 お よ び 細 胞 質 シ ャ ト ル リ ン グ は 、 そ の タ ン パ ク 質 の リ ン 酸 化 お よ び 特 異 的 キ ナ ー ゼ お よ び ホ ス フ ァ タ ー ゼ に よ る 脱 リ ン 酸 化 に よ っ て 制 御 さ れ る (Brunet et al., 2001)。 他 方 、 最 近 の 酸 化 還 元 状 況 の た め に 、 別 の DAF-16 転 写因子 の核 移 行経路 が発 見さ れ た 。 酸 化 的 損 傷 は FoxO タンパク 質の シス テ イン残 基に 直接 影響を 及ぼし 、そ の変 化はト ラ ン ス フ ェ リ ン タ ン パ ク 質 の 核 移 行 に つ な が る 。 シ グ ナ ル 伝 達 と し て は ”other”と未知 の経 路 が 存 在 す る 可 能 性 を 記 さ れ る こ と が 多 い が 、 例 え ば ROS によるレ ドック ス反 応に より imb-2 を 介 し た FOXO/DAF-16 の 核 移 行 (Putker et al., 2013)等 が 知 ら れ て い る 。 Putker ら (2013)に よ る と 、 imb-2 は ヒ ト ・ ト ラ ン ス ポ ー チ ン の オ ル ソ ロ グ で 、 活 性 酸 素 が 多 い 条 件 で 、 酸 化 還 元 反 応 を 伴 い な が ら 核 内 に FoxO4 を運ぶ とさ れて いる。 しかし 、本 実験 で は 、 活 性 酸 素 は 発 生 し て い る と は 考 え に く く 、 ま た 酸 化 還 元 条 件 下 の 実 験 で は な い 。 し か し imb-2 が生理 的静 水 圧加圧 によ る DAF-16 の核移 行に 必要 である ことが 逆遺 伝学 的に証 明 し た 。 こ れ は シ グ ナ ル 伝 達 経 路 と し て は 、 今 ま で 知 ら れ て い な い 経 路 で あ る 。 ま た 、 静 水 圧 加 圧 は 遠 心 機 を 用 い た 加 重 力 を 発 生 さ せ た 現 象 と 同 一 視 さ れ る こ と が 多 い と 考 え ら れ る が 、 Kim ら(2007)が行っ た線 虫の重 力応 答実 験にお いて、100G を 3 時 間 加 重 し た 条 件 で は 、 線 虫 は 重 力 の 力 を 生 物 学 的 シ グ ナ ル 伝 達 に 変 換 し て 感 知 す る こ と が 明 ら か に さ れ た 。 こ の と き 、 MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC チャネ ルを 経 由して 、DAF-16 を 活 性 化 さ せ る こ と 、 ま た 外 因 性 セ ロ ト ニ ン や 、 抗 う つ 薬 で あ り 選 択 的 セ ロ ト ニ ン 再 取 り 込 み 阻 害 薬 で あ る フ ル オ キ セ チ ン の 投 与 が 、 重 力 加 重 に よ っ て 誘 発 さ れ た DAF-16 の 核移行 が 抑 制 で き る こ と を 報 告 し て い る 。 し か し 今 回 の 実 験 に よ り 、 生 理 的 静 水 圧 加 圧 に よ っ て DAF-16 の 核 移 行 が 、 MEC-4/MEC-10 の RNAi、 あ る い は 5mM セ ロ ト ニ ン の 投 与 に よ っ て も DAF-16 の 核移行 が 進むこ とが 示さ れ、遠 心機を 用い て発 生させ た加重 力と 静水 圧加圧 に お け る 生 物 応 答 が 異 な る こ と を 示 す こ と が で き た 。 ま た 同 時 に 、 こ れ ま で に 報 告 さ れ て い る シ グ ナ ル 伝 達 活 性 化 と は 異 な る シ グ ナ ル 伝 達 経 路 で あ る こ と を 示 唆 し た 。

23 4.3. DAF-16 転 写 因 子 の 核 移 行 の メ カ ニ ズ ム

Maeshima ら (2014)は 、 従 来 知 ら れ て い る 30nm ク ロ マ チ ン 繊 維 モ デ ル は 、 低 陽 イ オ ン 状 態 に し た 試 験 管 内 で 観 察 さ れ る が 、 そ れ 以 外 で は 観 察 さ れ な い こ と に 着 目 し 、 古 典 的 な 30nm ク ロ マ チ ン 繊 維 モ デ ル か ら の 脱 却 が 提 唱 さ れ て い る (Barbieri et al., 2012; Maeshima et al., 2014; Nozaki et al., 2017)。 す な わ ち 核 内 で は ク ロ マ チ ン が 核 膜 付 近 よ り 核 内 で 大 き な 動 き を 示 す こ と が 明 ら か に さ れ た 。 こ の 研 究 で 明 ら か に し た 今 ま で 知 ら れ て い な い DAF-16 の 速い核 移 行反応 は、 おそ らく 4.1.で 論 じ た 今 ま で 知 ら れ て い な い DAF-16 の 生 物 応 答 で あ る こ と を 考 え る と 、 作 業 仮 設 と し て DAF-16 の核 移 行は細 胞質 にあ る時の リン酸 化さ れた 状態の まま、 核内 に移 行した と 考 え た 。 圧 力 が 加 わ る こ と に よ っ て タ ン パ ク 質 内 の 水 素 結 合 に 変 化 が 生 じ タ ン パ ク 質 の 構 造 変 化 、 す な わ ち 変 性 す る こ と が 指 摘 さ れ て い る 。 imb-2 によっ て核内 に誘導 され た DAF-16 は 生 理 的 静 水 圧 加 圧 に よ り 、 少 な か ら ず タ ン パ ク 変 性 を 伴 っ て い る こ と が 考 え ら れ る 。 現 に 圧 力 変 性 を 利 用 し て 我 々 は 生 活 の 役 に 立 て て い る 。 例 え ば 、 明 治 製 菓 で は 400MPa～ 500MPa の 圧 力 を 10～ 30 分 ほ ど 常 温 で 加 え た 加 圧 処 理 で ジ ャ ム の 製 造 を 行 っ て お り (Kimura et al., 1994; Kimura, 2000)、 越 後 製 菓 株 式 会 社 で は 200MPa～ 800MPa の 加 圧 に よ っ て 風 味 や 色 合 い の 変 化 を 防 ぎ な が ら 加 圧 殺 菌 を 行 っ て い る ま た 、 序 論 で の べ た 加 圧 処 理 に よ る 殺 菌 効 果 (タン パ ク質の 変性 によ る細菌 の不活 性化)によ る牛 乳 の保存 は 100 年 前よ り 知 ら れ て い る 。 Nishiyama ら は 、 80MPa の 静 水 圧 で 大 腸 菌 が 遊 泳 で き な く な る こ と を 見 出 し て 、 単 一 べ ん 毛 モ ー タ ー の 回 転 と 遊 泳 細 胞 の 割 合 と 速 度 は 圧 力 の 増 加 と 共 に 減 少 し 、 大 腸 菌 の 運 動 性 の 圧 力 依 存 性 を 明 ら か に し た が (Nishiyama et al., 2012)、可逆 的な現 象 ではあ るが これ も一 過 性 の タ ン パ ク 変 性 に よ る も の と 考 え ら れ る 。 ま た Abe ら は 1998 年に、40～60MPa の静水 圧は、 一時 的に 酵母の 液胞 の pH を 0.33 だ け 低 下 さ せ る (酸 性に 傾 ける)こ とを 示し た(Abe et al., 2004)。一 方、100MPa の加 圧で トリ ス な ど の 緩 衝 液 は pH 指示薬(ブロ モチ モー ル ブルー また は p－ ニト ロフェ ノー ル)を 含む 運 動 性 媒 体 の 吸 収 ス ペ ク ト ル か ら 測 定 す る こ と で pH が 0.1 上 昇す る こと を Nishiyama ら (2013)は 示 し た 。

24 す な わ ち 、 咀 嚼 時 な ど 日 常 負 荷 が か か る 静 水 圧 の 大 き さ に よ っ て 、 pH の変化と いっ た 物 理 化 学 的 変 化 が 起 こ る 。 以 上 の こ と か ら タ ン パ ク 質 は 生 理 的 静 水 圧 加 圧 に よ っ て 、 少 な か ら ず 構 造 変 化 を 受 け る こ と が 考 え ら れ る 。 転 写 因 子 で あ る DAF-16 は、恐 らく 静水 圧加 圧 の 影 響 で リ ン 酸 化 さ れ た ま ま 速 や か に IMB-2 の助け を受 けて 核内 に移行 し、 流動 的な ク ロ マ チ ン ド メ イ ン の 転 写 因 子 と し て 核 内 に ダ イ ナ ミ ッ ク に 遺 伝 子 上 の コ ン セ ン サ ス 配 列 に 速 や か に 結 合 す る こ と が 考 え ら れ る 。 一 方 、 加 圧 か ら 解 放 さ れ る と 本 来 の 構 造 に 戻 っ た リ ン 酸 化 さ れ た DAF-16 は速や かに 核外 に移 行する 。静 水圧 加圧と 圧力開 放を 繰り 返して も DAF-16 は 核移行 を 速やか に再 現す ること が示さ れた が、 これは このリ ン酸 化さ れたま ま で 核 内 外 に 移 動 す る DAF-16 の 挙動 につ い てサポ ート して いると 考える 。 一 方 、 構 造 が 乱 さ れ た ク ロ マ チ ン ド メ イ ン は 、 そ の 乱 れ を 正 常 に 戻 す の に タ イ ム ラ グ が 生 じ 、 そ の 結 果 、 多 く の 遺 伝 子 が 一 度 ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー ト に 陥 り 、 ヒ ー ト シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン な ど の 活 躍 で 構 造 の 乱 れ が 元 に 戻 る こ と に よ り 、 転 写 活 性 正 常 化 す る と と も に 強 く 遺 伝 子 発 現 が ア ッ プ レ ギ ュ レ ー ト に 傾 く と 考 え る こ と が で き る 。 特 に 、 分 子 シ ャ ペ ロ ン と し て 働 く abu シリー ズの各 遺伝 子や コラー ゲンシ リー ズの 遺 伝 子 の 多 く が 一 度 ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー ト さ れ 、 の ち に 著 し く ア ッ プ レ ギ ュ レ ー ト さ れ る の は 、 こ の た め だ と 考 え る こ と が で き る 。 ま た こ れ ら の 遺 伝 子 は 、 daf-16 変異体 にお いて有 意 に 変 化 し て い な い た め 、 DAF-16 依 存的 変 化であ った と判 断でき 、生理 的静 水圧 加圧に お い て DAF-16 はそ の 中心を なす もの と思わ れる。 ヒ ー ト マ ッ プ 分 析 で は 、 静 水 圧 負 荷 に よ る 遺 伝 子 発 現 の 変 化 が 野 生 型 で あ る N2 およ び daf-16 変 異 体 に よ っ て 明 ら か に 2 つ の ク ラ ス タ ー に 分 け ら れ た こ と を 示 し た 。 さ ら に 、 こ れ ら の 遺 伝 子 の ほ と ん ど は 、 ワ ー ム ベ ー ス に 記 載 さ れ て い る dauer、 daf-2、お よ び daf-16 調 節 遺 伝 子 な ど の 遺 伝 子 と し て も ア ノ テ ー ト さ れ て い た 。 そ れ は 、 静 水 圧 加 圧 と い う 刺 激 に よ っ て 、 機 械 的 刺 激 依 存 性 DAF-16 の核 局 在化が 、DAF-16 結 合 配列を 有す る多 くの遺 伝 子 に 取 り 付 き 、 構 造 変 化 を し た ク ロ マ チ ン ド メ イ ン の た め に 遺 伝 子 発 現 が 速 や か に 抑 制 さ れ 、 そ し て 減 圧 後 に ク ロ マ チ ン の 構 造 の 乱 れ の 修 復 に 伴 っ て 、 こ れ ら の 遺 伝 子 が 徐 々 に ア ッ プ レ ギ ュ レ ー ト さ れ る こ と を 示 唆 し て い る 。 繊 毛 関 連 遺 伝 子 は 、 ク チ ク ラ コ ラ ー ゲ ン 遺 伝 子 と 同 様 の 発 現 変 化 を 示 し 、 一 度 ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー シ ョ ン が か か っ て か ら 時 間 の 経 過 と と も に 、 ア ッ プ レ ギ ュ レ ー シ ョ ン に 転 じ て い る 。 こ の こ と か ら 、 繊 毛 は 機 械 応 答 の 変 化 を 捉 え る 感 覚 系 の 器 官 と し て 機 能 す る こ と が 知 ら れ て い る の で (Kunimoto et al., 2012)、最終 的に静 水圧 によ る機械 的負荷 は、 生物 応答

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と し て 物 理 的 な 力 に 対 抗 す る た め の DAF-16 の核移 行に 始ま るメカ ノセン サー が働 き、シ ャ ペ ロ ン と し て 働 く abu 遺伝子 群の 活性 化や キュー ティ クル 、さら にコラ ーゲ ン関 係の遺 伝 子 発 現 を 強 化 し 、 細 胞 マ ト リ ッ ク ス を 強 固 に し 、 生 命 維 持 装 置 を 活 性 化 し た と 考 え る こ と が で き る 。

26 4.4. 静 水 圧 加 圧 処 理 に よ る 正 の 生 物 応 答 に つ い て

daf-16 遺 伝 子 は 長 寿 遺 伝 子 と し て 知 ら れ て い る が (Tatar et al., 2003)、 静 水 圧 加 圧 に よ っ て DAF-16 が 核移行 す ること で、 実際 に線虫 の生存 率が 上が り、延 命効果 が示 され ること と な っ た 。 こ れ は 静 水 圧 加 圧 に よ っ て も DAF-16 転 写因 子の 活性化 が起こ るこ とを 示した 最 初 の 例 と な る 。 す な わ ち 、 一 過 性 の 静 水 圧 加 圧 で あ る 咀 嚼 や 運 動 に よ る 関 節 軟 骨 へ の 静 水 圧 の 加 圧 負 荷 が 長 寿 を 導 く こ と を 示 し て い る 。 可 逆 的 な 範 囲 で 構 造 変 化 が 起 こ る が 、 タ ン パ ク 変 性 を 来 た さ な い 程 度 の 生 理 的 静 水 圧 加 圧 に よ り 、 DAF-16 の転写 因子 が核 移行す る こ と に よ っ て 、 様 々 な 遺 伝 子 を 発 現 さ せ て 生 物 応 答 を 活 性 化 さ せ 、 エ ク サ サ イ ズ 効 果 を 発 揮 し 、 生 物 応 答 と し て 正 の 方 向 に 導 く も の と 考 え ら れ る 。 尚 、 本 研 究 で は daf-16(-)欠損 型の方 の寿 命が 、半分 程度 の生 存率に なって から 野生 型よ り 延 び る 結 果 と な っ た 。 今 回 の 研 究 で は 不 妊 を 誘 導 す る 試 薬 で あ る

5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)を 添 加 し な い こ と に 原 因 が あ る と 考 え る 。 Aitlhadj ら (2010)は 、 FUdR を 添 加 す る こ と で 、 成 体 線 虫 の 発 育 へ の 影 響 を 最 小 限 に 抑 え 、 子 孫 の 成 長 を 防 ぎ な が ら 寿 命 の 計 測 を 行 っ て い る (Aitlhadg et al., 2010)。 また、Piechulek ら(2018)は、 FUdR は有糸 分 裂 細 胞 の 死 お よ び タ ン パ ク 質 合 成 の 阻 害 を も た ら す た め 、 性 成 熟 前 の FUdR 処理は 生体 発 達 へ の 影 響 を 最 小 限 に 抑 え ら れ る と 述 べ て い る (Piechulek et al., 2018)。その こと によ って FUdR が 頻 繁 に 使 用 さ れ る 一 因 と な っ て い る が 、 生 殖 器 系 か ら の シ グ ナ ル 伝 達 が 線 虫 の 寿 命 を 変 え る 可 能 性 が あ る こ と を 認 識 す べ き で あ る と 同 時 に 述 べ て い る 。 本 研 究 で は 野 生 型 で あ る N2 の延命 効果 が示さ れた が、daf-16 欠損型 には 、延 命効果 をはか るた めの システ ム が 別 な 経 路 が 存 在 す る か 、 FUdR を添 加し ないこ とで 野生 型であ る N2 より長 寿と なっ た 。 し か し 、 コ ン ト ロ ー ル 区 と 加 圧 処 理 を 行 っ た も の と を 比 較 し て 有 意 性 の あ る 延 命 効 果 は も た ら せ ら れ な か っ た 。 ま た 、 N2 の L1 幼 虫に 対する 一度 だけ の静水 圧加圧 処理 によ っても 生存率 の向 上が 認 め ら れ た 。 こ の 結 果 は 、 大 き す ぎ る 刺 激 で あ れ ば ダ メ ー ジ の 大 き い ス ト レ ス と な り 個 体 が 死 に 至 る 一 方 、 大 き 過 ぎ ず 適 度 な 静 水 圧 刺 激 で あ れ ば 、 大 人 に な る 前 の 刺 激 （ 静 水 圧 加 圧 ） と し て た っ た 一 度 だ け で も 、 あ た か も 免 疫 獲 得 の よ う な 効 果 を も た ら し 、 体 調 を 整 え る エ ク サ サ イ ズ 効 果 に つ な が り 、 長 寿 命 に 至 る 結 果 を 示 す こ と が で き た 。