Cyclic stretch force induces periodontal ligament cells to secrete exosomes that suppress IL-1β production through the inhibition of the NF-κB signaling pathway in macrophages

Cyclic stretch force induces periodontal

ligament cells to secrete exosomes that

suppress IL-1β production through the

inhibition of the NF-κB signaling pathway in

macrophages

著者

王 祝愉

号

51

学位授与機関

Tohoku University

学位授与番号

歯博第870号

URL

http://hdl.handle.net/10097/00129591

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論 文 内 容 要 旨

Background: In the oral mechanical environment, periodontal ligament cells (PDL cells) contribute to maintaining periodontal tissue homeostasis. Recent studies showed that exosomes, small vesicles secreted by a number of cell types, play a pivotal role in cell-to-cell communication in biological processes.

Method: The supernatants from human PDL cells (PDL-sup) stimulated with cyclic stretch were prepared first. The secretion of exosomes from PDL cells stimulated with cyclic stretch was then examined by the western blot, transmission electron microscopy analysis and immunofluorescence microscopy analysis. After that, the role of exosomes in the inflammatory response of macrophages using the human macrophage cell line THP-1 was detected by real-time PCR, ELISA, immunocytochemistry assay.

Results: The treatment of macrophages with PDL-sup, but not PDL-sup from unstimulated PDL cells, inhibited the production of IL-1β in LPS/nigericin-stimulated macrophages. The pretreatment of PDL cells with GW4869, an inhibitor of exosome secretion, or siRNA for Rab27B, which controls exosome secretion, abrogated the inhibitory effects of PDL-sup. A transmission electron microscopy analysis demonstrated the existence of exosomes with diameters ranging between 30 and 100 nm in PDL-sup, suggesting that exosomes in PDL-sup contribute to this inhibition. An immunofluorescence microscopy analysis revealed that exosomes labeled with PKH67, a fluorescent dye, were incorporated by macrophages as early as 2 h after the addition of exosomes. Purified exosomes

氏　名（本籍）　  ： 王　祝愉（中国）

学 位 の 種 類　 ： 博　士　　（　歯　学　） 学 位 記 番 号　 ： 歯　博　第　8 7 0 号 学位授与年月日　 ： 2019 年 9 月 25 日 学位授与の要件　 ： 学位規則第４条第１項該当 研 究 科 ・ 専 攻　 ： 東北大学大学院歯学研究科（博士課程）歯科学専攻

学 位 論 文 題 目　 ： Cyclic stretch force induces periodontal ligament cells to secrete exosomes that suppress IL-1β production through the inhibition of the NF-κB signaling pathway in macrophages　（ヒト歯根膜細胞伸展 刺激による抗炎症性エクソソーム分泌誘導：マクロファージNF-κBシグ ナル制御を介したIL-1β発現抑制）

論 文 審 査 委 員　 ：　（主査）教授　齋藤　正寛

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inhibited IL-1β production in LPS/nigericin-stimulated macrophages and the nuclear translocation of NF-κB as well as NF-κB p65 DNA-binding activity in LPS-stimulated macrophages, suggesting that exosomes suppress IL-1β production by inhibiting the NF-κB signaling pathway.

Conclusion: These results indicate that PDL cells in mechanical environments contribute to the maintenance of periodontal immune/inflammatory homeostasis by releasing exosomes.

審 査 結 果 要 旨

歯根膜線維芽細胞（ＰＤＬ細胞）は歯周組織の恒常性の維持に重要な役割を果たしている。同細胞 は咀嚼によって生じる伸展力、圧縮力、流体せん断力、さらには流体静力等によってメカニカルスト レスを受容するが、それら刺激による細胞の影響についての詳細は未だ解明されていない。エクソソー ムは、開口分泌により分泌されるナノサイズの脂質二重膜小胞であり、タンパク質、核酸などを含み、 炎症・免疫反応などに大きな役割を果たしていることが知られている。しかし、歯周組織の生体内イ ベントにおけるエクソソームの関与についてほとんど明らかにされていない。本研究は、ヒトＰＤＬ 細胞に周期的伸展力を加えることにより、同細胞からエクソソームが分泌されることを初めて証明し たものであり、さらに同エクソソームは、炎症反応の中心とされるマクロファージIL-1β産生に対し て阻害活性を有することを明らかにした研究である。 周期的伸展力で刺激したヒトPDL細胞からの上清（PDL-sup）を実験サンプルとして調製した。ヒ トマクロファージ細胞株THP-1およびヒト初代単球/マクロファージを用いて、同実験サンプルのマク ロファージIL-1β産生に及ぼす影響を解析した。マクロファージは、大腸菌LPS/nigericin刺激するこ とによりIL-1βを産生するが、PDL-supでマクロファージを前処理することによりIL-1β産生が阻害さ れた。エキソソーム分泌の阻害剤であるGW4869をPDL細胞に前処理することにより、あるいはエキソ ソーム分泌を制御するRab27Bに対するsiRNAを用いてPDL細胞の同分子をノックダウンすることによ り、PDL-supのIL-1β産生阻害効果は有意に抑制された。透過型電子顕微鏡により解析により、PDL-sup中に30 ～ 100ｎｍの直径を有するエキソソームの存在を実証し、PDL-sup中のエキソソームがこの 阻害活性に寄与していることが示唆された。また、免疫蛍光顕微鏡解析においても、蛍光色素PKH67 で標識されたエキソソームが、エキソソームの添加後2時間という早い時期にマクロファージによって 取り込まれることを明らかにした。PDL-supから精製されたエキソソームは、LPS/nigericin刺激マク ロファージからのIL-1β産生、NF-κBの核内移行ならびにNF-κB p65 DNA結合活性を阻害したこと から、エキソソームはNF-κBシグナル伝達経路を阻害することによってIL-1β産生を抑制することが 示唆された。 これらの結果から、メカニカル環境においてＰＤＬ細胞から分泌されるエキソソームは、歯周組織 の免疫／炎症の恒常性維持に寄与していることが示された。本結果は、基礎歯学だけではなく歯周病 学にも大きく貢献すると考えられることから、本論文が博士（歯学）の学位に相応しいものと判定する。