ブラジル産プロポリスの品質評価に関する研究

ミツバ チ科 学

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3)

ブラジル産 プ ロポ リスの品質評価 に関す る研究

緑

川

淑,

A.

プロポ リス

(

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)

とは, ミツバチが巣 の保全の為に作 る濃緑色∼茶褐色の粘着性物質 であり, ミツパテが樹木 より採取 したガム質 ･ 樹液 ･植物色素系物質 ･香油等の集合体 に, 白 身 の分 泌 物 ･蜜 蛸 等 を 混 合 して 作 られ る

(

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,1

979)

.伝統薬物 としてのプロポ リスの使用 の歴史 は紀元前

300

年以上前 にさ かのぼ り,抗腫療活性,抗酸化活性,抗炎症活 性,抗菌活性など様々な生物活性が報告 されて いる

(

Bur

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,1

998;

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995)

.

プロポ リスの組成 は採取 された地域の植物相 に依存することか ら, ヨーロッパ,南北 アメ リ カ,アジア, アフ リカ産それぞれ風土的地理的 な違いにより成分構成が異なり, これまで

1

60

種以上の化合物が確認 されている

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995;

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999)

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手法 としては

GC-

MS

と

HPLC

分析がプロポ リス中の化合物 の 同 定 と,基 源 植 物 の 調 査 に使 用 さ れ た

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,1993)

.

興味あることに,それ らの化学成 分組成の相違にもかかわ らず,温帯か ら熱帯ま での全ての領域か らのプロポ リスは,同様の生 理 活 性 を 示 した こ と か ら

(

Bur

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,1

998;

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,1995)

, 適当な生物学的評価法の選 択 は,異なる基源か らのプロポ リスの評価法 と して有用であると考え られた.

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1

999)

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, 1

2

種の異 なるプロポ リスの抗 真菌活性,抗 ウイルス活性について調査 し,全 てのプロポ リスがグラム陽性菌に対 して活性を 持 っ こ とを報 告 して い る.

Mi

yat

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.

(

1

997)

はブラジルと中国産の

2

種のプロポ リ スに対 しヒアルロニダーゼ抑制活性試験を行抑

H.Bans

kot

a

,手塚

康 弘,

松繁

克道,門田

重利

制活性試験を行い, ヒアル ロニダーゼ抑制活性 はプロポ リスの評価のための優れた生理化学的 な方法であると結論 した.プロポ リスの生理活 性についての研究 は,抗酸化活性

(

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996)

,抗癌

または細胞毒性活性

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, 肝保護活性

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,Sugi

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999)

についての報告があり,活性成分 も い くつか単離 されている. 日本国内で繁用 されているブラジル産プロポ リスについては,その外観,香 り, またエタノ ールに溶解 させた時の嬉液の色,香 り等の経験 的要素がプロポ リス原料の等級付 けの大 きな判 断基準 とな って いた.現在 で は,吸光分析 や

HPLC

分析 も用い られているが,プロポ リスの 持っ生理活性や含有する個 々の成分 との関連を 論 じられるものでない. そこで我 々は, ブラジル産プロポ リスの等級 別原料

6

種を入手 し,等級を反映する生理活性 の検討,その活性に寄与する成分の解明, さら に

LC-

MS

を用 いたそれ らの成分 の分析 を行 い,プ ロポ リスの品質評価法を確立することを 試みた.

1

.

ブラジル産プ ロポ リスの活性

サ ン プ ル は

1999

年 に ブ ラ ジ ル

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州

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市で入手 した

6

種を 用 いた. これ らは,等 級 の高 い順 に,

Ul

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Green (以 下UG と 略),SuperGreen (SG), CPI(CPI),Blend (Bl),Parana Green (PG),

Brown(Br)と命名 されて いる. UG,SG及 び CPIは MinasGerais州産 で現地 の養蜂家 の間 では高品質 とされ るグ リー ンタイプの原料 であ る.BLはブ レン ドされた もの,PGは Parana 州産 の グ リー ンタイプ,Brは茶黒褐色 の原料 である. 通常 プ ロポ リスは水, エ タノール, グ リセ リ ン等 で抽 出 して用 い られて いる事 か ら, 6種 の プ ロポ リスそれぞれ につ いて,水及 びメタノー ルで抽 出 して エキスを作製 した.即 ち, プ ロポ リスを粉砕後熱水抽 出(80℃,3hr)し,癌液を 凍結乾燥 して水 エキスを得 た.次 いで,残虐 を メタノールで

3

時間還流抽 出後

,

浸液 を減圧乾 固 してメタノールエキスを作製 し,治療補助 目 的 で の使 用 と関連 す る,細 胞増 殖 阻害 活性試 験,DPPH ラジカル消去活性試験,肝保護活性 試験 を行 い, その等級間の強 さを比較 した.

高肝転移性 のhumanHT-1080fibrosarcoma 細 胞 (Rasheed et a1.,1974)及 び murine colon26-L5carcinoma細胞 (Ohnishieta1.,

1997)に対 す る各 プ ロポ リスエキ スの細胞増

殖 阻 害 活 性 をMTTア ッセ イ法 (Rubinstein eta1.,1990;Banskotaetalり1998)によ り検 討 した. その結果, メタノールエキスが対応す る水 エキスよ り強 い阻害活性 を示 して いたが, いず れ の プ ロポ リスエキ ス も等級 間 のIC50値 に殆 ど差が見 られず, これ らの癌腫 を用 いた細 胞増殖阻害活性試験 はプ ロポ リス等級比較 には 有用 で無 い事が解 った. DPPH ラ ジカ ル 消 去 活 性 試 験 (Hatano et a1.,1989)において は,水 エキスが対応す るメ タノールエキスよ り強 い活性 を示 したが,細胞 増殖阻害活性同様 に等級間 に殆 ど差 は見 られな か った . 肝保護活性 は,D-GalN/TNF-αで誘発す る初 代 培 養 肝 細 胞 死 モ デ ル を 使 用 し(Seglen, 1976),200/Jg/ml及 び 100〟g/mlの濃度 で 測定 した. それぞれのプ ロポ リスの メタノール エキスと水 エキスの活性 を比較す ると,初代培 養肝細胞 に対す る毒性 を示 したBrを除 いて, q m =

細

胞小

杉 革 (% ) .=. 川 畑

山

刀 り 細 胞 1 存 串 ( % ) UG SG CPl BL PG Bl 7T:常 肺 対照聯 UG SG CPI BL PG Bl ll='.i;.I,群 対照群 図1 D-GalN/TNF-αで誘発する初代培養肝細胞死 モデルにおけるプロポリスメタノールエキス(a) 及び 水エキス(b)の肝細胞死阻害活性. 結果は平均±標準偏差で示す (∩-4,正常群と対照群はn-8),対照群に対する 有意差 :*♯p<0.01,*p<005 メタノールエキスは対応す る水 エキスよ り強 い 肝細胞死抑制 活性 を示 した.Br以外 の メ タノ ールエキスは100/Jg/ml及 び 200〟g/mlで活 性 を示 し,UG,SG,CPIの水 エキスは 200JJg/ mlで有意 な肝保護活性 を示 した.侍 に,水 エキ スが細胞毒性 を示 さなか った事 は興味深 い.各 エキス100pg/ml及 び 200〟g/mlの濃度 での 細胞生存率 と等級 を比較す ると,最 も等級 の低 いBrか ら最 も等級 の高 い UGまで等級 が高 く なるにつれ生存率 も高 くな ってお り,両者 の間 に相関が見 られた (図 1). したが って本活性試 験 は,前述 の2種 の活性試験 とは異 な り, ブラ ジル産 プ ロポ リスの等級 を比較す る目的で使用 可能 な方法 と考 え られ る.

2.

ブラジル産プロポ リス中の活性成分

上 記 の3種 の活性試 験 にお いて ブ ラ ジル産 プ ロポ リスのエキスが活性 を示す ことが明 らか にな ったので,次 にそれ らの活性 に寄与 す る成 分 の解明を試 みた. プ ロポ リスメ タノールエキスよ りカ ラムクロ マ トグラフ ィー及 びpTLCによ り,クロマ ン誘 導体4種,桂皮酸誘導体4種, ラブダ ンクイブ

の ジテルペ ン6種,フラボノイ ド4種,ベ ンゾ フラン誘導体 7種, その他 2種 の計 27種 の化 合物 を単離 し,細胞増殖 阻害活性

,DPPH

ラジ

カル消去活性,肝保護活性 を測定 した. 27種 の 中 で murinecolon 26-L5carci nO-maに対 して増殖 阻害活性 を示 した化合物 は, betletol(19;IC50,4.95/上g/ml)であ り human

HT-1080fibrosarcomaに対 して増殖阻害活性 を 示 した 化 合 物 は,coniferylaldehyde(9;

IC50,4.05.〝g/ml),kaempferide(20;IC50,2.91 〟g/ml),ermanin(21;IC50,2.30〟g/ml)の 3

化

合物 であ った.

化合物濃度 100pg/mlで

DPPH

(60pM)に 対 す る捕捉率50%以上 を示 した化合物 は,ar -tepillinC(5;96.6%),coniferylaldehyde(9;

4

1

0 5

91.9%),betuletol(19;94.1%),kaempferide(20; 94.7%),dimericconiferylacetate(23;58.2%) であ った.

ブラジル産 プ ロポ リス中の肝保護活性成分 に つ いては以前 に caffeoylquinicacidsが報告 さ れて いるが (Basneteta1.,1996),本研究 にお いてメ タノールエキスは対応す る水 エキスよ り 強 い肝細胞死阻害活性 を示 した事か ら,肝細胞 死阻害活性 に寄与す る他 の化合物 の存在が示唆 された. ポ ジテ ィブコ ン トロール と して使用 し た silibinin (IC50,39.6/∠M) よ り強 い肝細胞死 阻 害 活 性 を 示 し た 化 合 物 は,4-dihydro cinnamoyloxy-3-prenylcinnamic acid (6;

IC50,26.9pM),4-hydroxy-3lPrenylcinnamic acid(7;IC50,34.4/JM),vanillin(8;IC50,22.1JJ

15 20 25 30 35 40 45

時間 (分)

50 55

図2 標準品 (i-41)の トータルイオンクロマ トグラム(TIC).

化 合物名:1,3-Hydroxy-2,2-dimethy1-8-prenylchromane-6-propenoicacid; 2,2,2-dlmethy1-8-pre -nylchromene-6-propenoic acid; 3,2,2-dimethylchromene-6-propenoic acid; 4,2,2-dimethyl chromene-6-carboxylicacid; 5,artepillinC; 6,4-dlhydrocinnamoyloxy-3-prenylcinnamicacid; 7,4 -hydroxy-3-prenylcinnamicacid; 8,vanillin; 9,coniferylaldehyde; 10,isocupressicacid; ll,15 -acetoxyisocupressicacid; 12,agathicacld; 13,agathicacld 15-methylester; 14,agathallCacid; 15,cupressICacid; 16,tremetone; 17,viscidone; 18,121aCetOXyViscidone; 19,betuletol; 20, kaempferide; 21,ermanin; 22,3.5,7-trihydroxy-4'-methoxyRavanol; 23,dimericconiferylacetate, 24,(E)-31 41hydroxy131[(E)-4-(2,3-dlhydroIClnnamOyloxy)-3-methy1-2-butenyl]-5-prenylphenyl)-

2-propenoic acid; 25,(E)-3･[2,3-dihydr0-2-(1-methylethenyl)-7-prenyl-5-benzofuranyl]-2-Propenoic acid;

26,propolis-benzofuran A; 27,propolis-benzofuran B ; 28,3,4-di一〇一ca汗eoylqulnic acid; 29, methy13,4-d1-0-caffeoylquinate; 30,methy14,5-di-0-caffeoylquinate; 31,3,51di-0-caffeoylquinicacid;

32.chlorogemcacid; 33,chrysin; 34,quercetin: 35,kaempferol; 36,quercitrin; 37,cinnamic acid; 38,a-coumaricacid; 39,caffeicacid; 40,ferulicacid; 41,gaユ11CaCld.

M),betuletol(19;IC50,12.7〟M),kaempferide

(20;IC50,17.6〟M),ermanin(21;IC50,15.0.〟M),

3,5,7 trihydroxyl4'-methoxyflavanol (22; IC50,22.OpM),(E)-3-(4-hydroxy-3-[(E)-4-(2,

3-dihydrocinnamoyloxyト3-methyト2-butenyl]

-5-prenyl)-2-propenoicacid (24;IC50,15.2.

〟M),propolis-benzofuran

B

(27;IC50,15.0

〟M)の 9化合物 であ った.

3.

ブラジル産プ ロポ リスの

LC-MS

分析

前章 で ブラジル産 プ ロポ リスメタノールエキ

スよ り単離 した27化合物 (ト27),以前 にブラ

ジル産 プ ロポ リス水 エキスか ら単離 されて いた 4種 の dicaffeoylquinicacid類 (28-31),プ ロ

ポ リスか らの単 離報 告 の あ る10化 合物 ( 32-41) の計 41化 合物 を標 品 と して LC-MS分析 を行 った. 最初 に,個 々の標品 につ いてパ ルスイ ンジェ クシ ョン法 にてLC-MS測定 を行 ない, それぞ れの標品の保持時間 (tr)と擬分子 イオ ン [ M-H]-を示す事 を確認 した.次 いで,41化合物 を 混合 しLC-MS分析 を行 な い, 各化合物 が トー タルイオ ンクロマ トグラム (TIC) で良好 な分 離 を示す事 を確認 した (図 2).なお,TICにお いて分離 で きなか った一 部 の化合物 につ いて ち,擬分子 イオ ン [M-H]A の質量数 でのマス クロマ トグラムで は明瞭に分離 していた.結果 と してHPLC条件 は, 島津製 CLC-ODS (150 ×6.0mm) カラム,移動相 は 0.5% 酢酸 とメ タ ノ ー ル を ブ ラ ジェ ン ト条 件 (0.5% Ac OH-MeOH (70:30,

Ⅴ/v)

to 0.5% AcOH-MeOH (20:80,

Ⅴ/v)

for30min,30min以後保持 ) で 流 量1.0 ml/minで 使 用 (カ ラ ム 温 度 40℃), サ ンプル注入量 は10pl, LC-MS条件 は イ オ ン化 モ ー ド,negative APCI;TIC range

,m/

z

l43 to 900;vaporization te m-perature,400oC;orifice temperature

,

60oC; needlevoltage,2.80kV;ioninjectiontime,

0.1Sを用 いる事 に した.この条件 で は,測定 は 60分 で充分 で あ り,水 エキスか ら単離 した化 合物 は20分以 内 に溶 出 し, メ タノール エキス か ら得 た化合物 は50分以 内に溶 出 した. 比 較 イ オ ン 畑 峻 CPl ･水仙 IL1 ｡ メ }/ ノ ー ル 対日l'. ,t,T l J I lll JJll n n lt,‥ ご 39 8溺 403lqこち∋2 3571 7 133 6rJlm (Br) . J m _nl n n ド rr日 日 H i i i I : r . = ● 1 -.一一 _5 rr r 11 日 = ∩ = 甜 = ∩ /i , : . . I 化 合 物 図3 等級毎ブラジル産プロポリス (UG,SG,CPI,BL,PG,Br)水およびメタノール エキス中の化合物のイオン強度 ブラジル産 プ ロポ リス6種 につ いて LC-MS 分析 を行 った結果,水 エキ スに共通 して検 出 さ れ た化 合 物 は,3,4-di一〇一caffeoylquinicacid

(28),3,5-di一〇一caffeoylquinic acid (31

)

,♪-coumaricacid(38)であ った.また,メタノー ル エ キ ス に はditerpene,chroman誘 導 体, 貝avonoids, caffeoylquinic acid誘導体, cinnamicacld誘導体, その他 の フェノール性 化合物 を含 む多 くの ピー クが認 め られ,12種 類 の化合物 (1,4,5,6,7,12,14,19-22,35) が共通 に検 出 された. 6種 のプ ロポ リスの トー タルイオ ンクロマ ト グラム(TIC)を比べ ると,それぞれのイオ ン強 度 は異 なるものの,水 エキス同士, メタノール エキス同士 で は類似 していた. しか し, エキス 問で化合物 ごとの イオ ン同士 を比較 す ると等級 の高 い もの同士 (UG,SG,CPI) は類似 のパ タ ー ンを示 し,等級 の低 い もの同士 (PG,Br)ち 類イ以のパ ター ンを示 した.ブ レン ドタイプ (BL) は等級 の高 い もの (UG,SG,CPI) と等級 の低 い もの (PG,Br)の中間的 なパ ター ンを示 した (図3).この結果か ら,今 回の LC-MS条件で ブ

19 洲 卿 洲 淵 脚 対 比 椴 イ オ ン 強 度 a ニ■ L -わ 掘 . .川払 C 1 O v F r'J U .叶.I 的 L E 併 2 0 ,3:.し 軒

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,

5

-d1-0-CaffeoylqtllnlCaCl d 図4 a)ブラジル産プロポ リスメタ/ -ルエキス中の化合物 7,20,19のイオン強度 b)ブラジル産プロポリス水およびメタノールエキス中の化合物 28,31のイオン強度 ラジル産 プ ロポ リスを分 析 しその イオ ン強度パ ター ンを比較 す る事 で, その等級 の高低 を判別 す る事 が可能 で あ ると考 え られ た.次 に肝細胞 死阻害活性 との相 関が認 め られた化合物 につ い て,等 級 とイ オ ン強度 の 関係 を比 較 して み る と,silibininよ りも強 い肝細胞死阻害活性 を示 した 8avonoids 19,20及 び dicaffeoylquinic acid28,31は等級 の高 い サ ンプ ルで高 いイオ ン強度 を示 して いた (歯 4). したが って, これ らの化 合物 19,20,28,31の イオ ン強度 も, ブ ラ ジル産 プ ロポ リスの品質評価 に有効 な指標 で ある と考 え られ る. 上記 の よ うに,LC-MS分 析 が ブ ラ ジル産 プ ロポ リスの品質評価 に有 効 であ ったので, 同条 件 で他 の産地 (ペルー産,オ ランダ産,中国産) の プ ロポ リス原料 の分析 を試 み た. これ らの産 地 のプ ロポ リス原料 の ク ロマ トグ ラムは ブラ ジ ル産 の もの とは異 な って お り,含有成分 が異 な って いる事 を示 して いる. これ は,始 めに述 べ たよ うに, プ ロポ リスは ミツパ テが周辺 の樹木 か ら集 めて くる ものであ るので,産地 が異 な る と基源植物 が異 な る為 で あ る. 品質 を評価 す る 上 にお いて産地 を明 らか にす る必要 が あ るが, 今回 の結 果 はLC-MS分析 で産地 の特 定 を行 い うる可能性 も示唆 して い る もの と考 え られ る. 以上 のよ うに,含有成分 (特 に,肝細胞死 阻 害活性成分) に注 目 したLC-MS分析 法 は,従 釆科学 的方法 が十分 で無 か った ブラジル産 プ ロ ポ リスの品質評価 にお いて有用 な手法 にな る事 が明 らか にな った. なお, 類似 のLC-MS法 は ブ ラジル産 プ ロポ リスに限 らず,他 の地域 のプ ロポ リスの品質評価 にお いて も有用 な手法 とな ると思 われ る.

(Banskota,手塚,門田:〒930-0194 富山県富山市 杉 谷2630 富山医科薬科大学和漢薬研究所化学応用 部 門 緑川, 松繁 .〒325-0025 栃木 県黒磯市下 厚崎 5-452 日本プロポリス㈱)

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Kuroiso,Tochigi,325-0025Japan.

Quality evaluation ofthepropolisisImpor -tant,beforetobeusedinfoodandbeverage.In ordertosettleoftheadequatemethodforthis propose,WecarriedoutthreedifferentblOlogl -calactivities,i.e.,hepatoprotective,1,i-dipheny1 -2-picrylhydrazyl(DPPH)radlCalscavenging,and antiproliferatlVeaCtlVitleS,OnSix differer】tpr

o-polisfrom Brazil.Thehepatoprotectiveactivity wasinaccordancewiththegradesettedupby beekeepersin】〕razll.Thus.thehepatoprotectlVe constitucntswereidentirled,andbyusingthem as standered compounds,LC-MS method was settledasthemostconvenientmethod