―72― 日本写真学会誌
解
説
コ ラー ゲ ンの構 造 と性 質
Structure
and Properties
of Collagen
渡
辺
和
男*
Kazuo WATANABE*
要 旨 コ ラー ゲ ンの構 造 と性 質 に つ いて,ゼ ラ チ ンの そ れ ら と対比 させ て記 した。コ ラー ゲ ン とゼ ラチ ンは 同 じア ミノ酸組 成 を示 す に もか か わ らず,コ ラ ーゲ ンの性 質(た と えば,粘 度,保 湿 性,タ ンパ ク質 分 解 酵素 抵 抗性)は,ゼ ラチ ンの それ とは ま った く違 う。これ は,コ ラー ゲ ン とゼ ラ チ ンの構 造 の違 い に よ るの だ ろ う。 コラ ーゲ ンは3重 ヘ リ ックス構 造 で あ るの に対 し,ゼ ラチ ン は ラ ンダ ム コイ ル構 造 で あ る。コラ ーゲ ンの特 異 な性 質 は,そ のユ ニ ー ク な分 子構 造 に起 因 す るの だ ろ う。Abstract The structure and properties of collagen are described comparing with those of gelatin. The properties of collagen such as viscosity, holding of moisture, and resistance to the degradation by proteases, are quite different from those of gelatin, though collagen shows the same amino acid composi-tion as gelatin. The reason for the difference in their properties would be due to the difference in their structures. Collagen has a triple-helical structure, while gelatin shows a random coil conformation . The characteristic properties of collagen would be caused by the unique structure .
キ ー ワ ー ド:コ ラ ー ゲ ン,ゼ ラ チ ン,高 次 構 造,フ ィ ブ リ ル,抽 出 Key words: collagen, gelatin, higher-order structure, fibril, extraction
1.は じ め に 人 類 は有 史 以 前 よ り コ ラー ゲ ンや ゼ ラ チ ン を利 用 して き た 。 狩 猟 民 族 が 利 用 した 獣 の 皮 の主 成 分 は コ ラー ゲ ン で あ る。 また,獣 や 魚 を 煮 る こ とに よ っ て 得 られ るゼ ラ チ ンは,に こ ご りや に か わ とい った 形 で食 品 や 接 着 剤 と し て使 わ れ て きた 。 1871年 にイ ギ リス 人Maddoxが ゼ ラ チ ン を写 真 乳 剤 に用 い て以 来,写 真 用 ゼ ラ チ ン につ い て い ろ い ろな 研 究 や 改 良 が重 ね られ て き た。 一 方,コ ラー ゲ ン が科 学 的 な 研 究 対 象 に な っ た の は,純 物 質 と して 単 離 さ れ る よ う に な った1960年 代 以 降 の こ とで あ る。コ ラー ゲ ン研 究 の 歴 史 は,ゼ ラ チ ンの そ れ と比 べ る とは るか に短 い。 しか し な が ら,純 粋 な コ ラー ゲ ンが 得 られ る よ う に な りそ の研 究 は飛 躍 的 に進 み,用 途 も食 品 ・医療 ・化 粧 品 の分 野 へ と広 が っ て きて い る。 有 史 以 前 か ら長 い 間皮 革 とし て の み 利 用 さ れ て きた コ ラ ー ゲ ンは,っ い最 近,新 し い素 材 と し て生 ま れ変 わ った の だ。 コ ラー ゲ ン研 究 の 短 い 歴 史 を辿 って み る と,初 期 の 頃 は構 造 に関 す る研 究 と物 性 測 定 が お もだ っ た。 これ は, コ ラー ゲ ンが ユ ニ ー クな 分 子 構 造 を もつ こ と と,生 体 に 対 して 生 理 的 に不 活 性 で あ る と考 え られ て い た こ と に よ る。 と こ ろが,1980年 代 に入 りバ イ オ サ イ エ ン ス が 発 達 して く る と,コ ラ ー ゲ ンが 細 胞 の増 殖 を調 節 す る な ど, 生 体 内 で 重 要 な 役 割 を果 た し て い る こ とが わ か っ て き た1)。現 在 は,生 体 内 に お け る コ ラ ー ゲ ンの 役 割 を細 胞 レ ベ ル ・組 織 レベ ル で 研 究 す るの が 主 流 に な って い る。 また,コ ラ ー ゲ ン の研 究 が 進 む に つ れ,い ろ い ろ な 型 の コ ラ ー ゲ ンが 見 つ か っ て きた 。今 の と こ ろ19種 類 の コ ラ ー ゲ ンが 知 られ て い る が2),今 後 こ の数 は増 え る と思 平 成10年1月25日 受 付,平 成10年3月10日 受 理 Received 25th, January 1998, Accepted 10th, March 1998
*(株)ニ ッ ピ,バ イ オ マ トリ ッ クス 研 究 所 〒120-8601東 京 都 足 立 区千 住 緑 町1-1-1
わ れ る。 コ ラ ー ゲ ン は見 つ か っ た順 にI型,II型,III型 … とい う よ うに,ロ ー マ 数 字 を つ けて 分 類 さ れ て い る。 ち な み に,工 業 用 ゼ ラチ ン の原 料 とな る牛 骨 の 中 に は, 1型 コ ラ ー ゲ ン以 外 の コ ラ ー ゲ ン は ほ とん ど含 まれ て い な い3-5)。一 方,も う1つ の工 業 用 ゼ ラチ ン の原 料 で あ る 動 物 の 皮 の 中 に は,1型 コ ラ ー ゲ ンの ほ か に10∼20%程 度 のIII型コ ラ ー ゲ ンが 含 ま れ て い る4-6)。 コ ラー ゲ ンに つ い て 解 説 す るに あた り,本 稿 は写 真 学 会 誌 に掲 載 さ れ る と い う こ と もあ り,最 近 の バ イ オ サ イ エ ン ス的 手 法 に よ っ て得 られ た コ ラ ー ゲ ン研 究 の 成 果 に つ い て は割 愛 し,お もに コ ラ ー ゲ ン の構 造 と物 性 に つ い て,ゼ ラ チ ン との 比 較 を通 して 紹 介 す る よ う に し た。 2.コ ラ ー ゲ ン と ゼ ラ チ ン の 関 係 ゼ ラ チ ン の 母 体 物 質 は周 知 の と お りコ ラ ー ゲ ンで あ る。 コラ ー ゲ ン1分 子 が 熱 変 性 す る と3分 子 の ゼ ラ チ ン が 生 じ る(Fig.1)。 これ は,分 子 量 分 布 に幅 が あ る工 業 用 ゼ ラ チ ン と違 っ て,分 子 量 が 約10万 の 単 分 散 型 ゼ ラ チ ン で あ る。 本 稿 で は これ を工 業 用 ゼ ラ チ ン と区別 す るた め に,α 鎖 と表 す こ と にす る。また,工 業 用 ゼ ラ チ ン にっ い て は そ の 都 度 こ とわ る こ と と し,単 にゼ ラ チ ン とい え ば, 両 者 を含 め た もの とす る。 α1 α1 α2
Heat-denatured Collagen (Gelatin)
Collagen Molecule
Fibril
Fig. 1 Schematic illustration of the heat-denaturation and self-assembly of the intact Type I collagen.
Fig.1か らわ か る よ う に,ゼ ラ チ ン は コ ラ ー ゲ ン の熱 変 性 物 で あ る の で,両 者 の ア ミノ酸 組 成 は一 致 す る。α鎖 の ア ミ ノ酸 配 列 を み て み る と,テ ロペ プ チ ドを除 い た ヘ リ ッ ク ス 部 分 で は,3残 基 ご と に グ リ シ ンが 現 わ れ る Gly-X-Y(X,Yは 任 意 の ア ミノ酸)と い う特 徴 的 な配 列 を と って い る7)。最 近 は,タ ンパ ク 質 の 全 部 あ る い は 一 部 の ア ミノ酸 配 列 に,Gly-X-Yと い う繰 り返 し が あ る もの を,広 義 の コ ラ ー ゲ ン とし て分 類 して い る。 また,3残 基 ご と に グ リシ ンが 現 わ れ る こ とが,コ ラ ー ゲ ンが3重 ヘ リッ ク ス を 巻 くた め の必 要 条件 だ と考 え られ て い る。 1型 コ ラ ー ゲ ンが 熱 変 性 す る と2種 類 の ア ミノ 酸 配 列 を も っ た α鎖 が2:1の 割 合 で 生 じる(Fig.1)。 量 が 多 い ほ う を α1鎖(1型 コ ラ ー ゲ ン由 来 な の で α1(1)と 表 記 す る)と い い,少 な い ほ う を α2鎖(1型 コ ラー ゲ ン の もの は α2(1)と 表 記 す る)と い う。 した が って,写 真 用 ゼ ラ チ ン と し て多 用 され る骨 ゼ ラ チ ン は,2種 類 の ア ミ ノ酸 配 列 を持 っ た ゼ ラ チ ン の 混 合 物 と い う こ と に な る。これ が 皮 ゼ ラ チ ン にな る と,III型コ ラ ー ゲ ン(α1(III) の み か ら成 る)が 入 っ て くる の で,組 成 は も う少 し複 雑 に な る。 皮 ゼ ラ チ ンの 中 にIII型コラ ー ゲ ン 由来 の ゼ ラ チ ン が10%含 ま れ て い る と 仮 定 す る と,α1(1): α2(1):α1(III)=6:3:1と い う こ とに な る。 Fig.1に 示 す よ う に,コ ラ ー ゲ ン は3本 の α鎖 が 相 互 作 用 して3重 ヘ リ ッ クス を形 成 し て い る8)。も う少 し詳 し く説 明 す る と,各 α鎖 は左 巻 きの ヘ リ ック ス を形 成 し
Fig. 2 CD spectra of collagen and gelatin. [Į] means molecular ellipticity (degree cm2 decimole-1). Detailed experimental conditions were described in our previous report9)
―74― 渡 辺 和 男 日本写真学会誌 て い る。 そ して それ らが 寄 り集 ま って,全 体 と して 右 巻 き の3重 ヘ リ ッ クス 構 造 を とっ て い る。各 α鎖 が左 巻 き ヘ リ ック ス を形 成 して い る こ とは,CDス ペ ク トル を と る と正 の ピー ク を示 す こ とか ら推 測 され る(Fig.2)。 そ れ に対 し,コ ラ ー ゲ ンの 熱 変 性 物 で あ る ゼ ラ チ ン はFig.2 よ り,ラ ンダ ム コ イ ル構 造 を と って い る と推 測 され る9)。 系 の 温 度 を上 げ な が ら行 ったCD測 定 よ り,コ ラー ゲ ンか ら α 鎖 へ の転 移 は 温 度 の上 昇 に 伴 い 急 激 に起 こ る こ とが わ か る(Fig.3)。 ゼ ラチ ン は冷 却 す る こ と に よ り, 徐 々 に コ ラー ゲ ン3重 ヘ リ ッ ク ス の一 部 を再 生 す る。 溶 液 中 で はゼ ラチ ン分 子 鎖 が ラ ンダ ム に寄 り集 ま って と こ ろ ど こ ろ に コ ラー ゲ ンヘ リ ッ クス を形 成 す る た め に,系 全 体 が ネ ッ トワー ク化 す る。 これ が ゼ ラ チ ン の ゲ ル 化 で あ る10)。
Fig. 3 Helix-to-coil transition curve of collagen in 20 mM acetic acid. 0 means observed ellipticity (mil-lidegree) at 221 nm. The used sample was the collagen isolated from steer hide with an alkaline solution (SCL) .15) The denaturation temperature (Tm) of SCL is about three degrees lower than the Tm of intact collagen in the acidic solution.
3.コ ラ ー ゲ ン と ゼ ラ チ ン の 物 性 比 較 コ ラ ー ゲ ンが 熱 変 性 して α 鎖 に な る と,物 性 が 大 き く 変 化 す る。 も っ と も顕 著 に現 わ れ る物 性 の 変 化 は粘 度 の 減 少 で あ ろ う。コ ラ ー ゲ ン0.1M酢 酸 溶 液 の20。Cに お け る固 有 粘 度 が約15d1/gで あ る の に対 し て ゼ ラ チ ンの そ れ は, [η]=1.66×10-5[Mn]0.885([Mn]は 数 平 均 分 子 量)10-12) とい う実 験 式 を使 う と約0.5d1/gと な る。 そ の他 お も な 物 性(保 湿 性,タ ンパ ク 質 分 解 酵 素 抵 抗 性)の 比 較 を Table1に 示 した 。 4.生 体 内 で の コ ラ-ゲ ン 生 体 内 で は コ ラ ー ゲ ン分 子 がFig.1の よ うに規 則 正 し く並 ん で会 合 体 を形 成 し て い る。Fig.1の 会 合 状 態 を フ ィ ブ リル とい う。 フ ィ ブ リル は さ ら に寄 り集 ま って フ ァ イ バ ー ・ フ ァイ バ ー バ ン ドル へ と生 長 し て い く(Fig .4)。 そ れ に と も な い コ ラ ー ゲ ン の 会 合 体 は 太 く な っ て い く13)。生 体 中 で コ ラー ゲ ン会 合 体 は,ほ と ん どが フ ァイ バ ーバ ン ドル の状 態 で存 在 し て い る 。 そ して 多 数 の フ ァイ バ ーバ ン ドル が ネ ッ トワー ク を形 成 す る こ とに よ り,生 体 組 織 に 柔 軟 性 と耐 久 性 を与 え て い る 。Fig.5は,コ ラ ー ゲ ン フ ィブ リル の 電 子 顕 微 鏡 写 真 で あ る 。 写 真 に は,コ
Fig. 4 Hierarchic structure of assembled collagens .
Table 1 Comparison of the properties between collagen and gelatin
Degree of positive results: + + + > + + > + Negative result:
Fig. 5 Electron micrograph of collagen fibrils. ラ ー ゲ ン フ ィ ブ リル に特 徴 的 な67nm周 期 の 縞 模 様 が 写 っ て い る。 生 体 内 で は酵 素 の 作 用 に よ り,コ ラー ゲ ン分 子 間 に架 橋 が 導 入 さ れ る 。 架橋 は分 子 の 両 端 に あ る テ ロ ペ プチ ド を起 点 に形 成 さ れ る。架 橋 の量 は 加 齢 に と もな い 増 加 し, しだ い に強 固 な コ ラー ゲ ン分 子 集 合 体 を形 成 して い く。 牛 の 胎 児 や 新 生 児 の 皮 か らは,そ の 中 に含 まれ て い る コ ラー ゲ ンの うち の約50%が 酸 に よ っ て抽 出 され る。そ れ に対 し成 牛 皮 で は コ ラ ー ゲ ン分 子 間 に架 橋 が か か っ て い る た め に,コ ラー ゲ ンは ほ と ん ど抽 出 され な い。 5.コ ラ ー ゲ ン お よ び ゼ ラ チ ン の 抽 出 コ ラ ー ゲ ン を工 業 的 に生 産 す る こ と を考 え た場 合,大 量 入 手 が 可 能 な成 牛 皮 を原 料 に す る必 要 が あ る。 成 牛 皮 か ら コラ ー ゲ ン を抽 出 す る に は越 えな けれ ば な らな い ハ ー ドル が い くつ もあ っ た 。 し か しな が ら,今 日で は 成 牛 皮 か ら コ ラ ー ゲ ンを抽 出 す る技 術 が 確 立 し,コ ラ ー ゲ ン を使 った ソ ー セ ー ジ ・ケ ー シ ング(ソ ー セ ー ジ の 皮)の 製 造 や 化 粧 品 の製 造 が 行 わ れ て い る14)。 コ ラー ゲ ン抽 出 の カ ギ は,コ ラ ー ゲ ン分 子 間 にか か っ て い る架 橋 を取 り除 い てや る こ とで あ る。前 述 の よ う に, コ ラー ゲ ン の分 子 間 架 橋 の一 方 はテ ロペ プ チ ドの 部 分 に 結 合 し て い る。 した が っ て,タ ンパ ク質 分 解 酵 素 を用 い て テ ロペ プ チ ド部 分 を切 断 す る こ とに よ り コ ラ ー ゲ ン分 子 同 士 を切 り離 し,コ ラ ー ゲ ン を抽 出 しや す く しよ う と い う わ け で あ る14)。一 般 の タ ンパ ク質 分 解 酵 素 は,コ ラ ー ゲ ン ヘ リ ッ クス の形 成 に関 与 し て い な い テ ロペ プ チ ドの 部 分 を切 断 す る こ とは で き るが,ヘ リ ッ クス 部 分 は 分 解
Fig. 6 Flow diagram of the extraction processes of col-lagen and gelatin. All operations of the extrac-tion procedure of collagen are performed at 4-10•Ž. で き な い こ と を利 用 して い る。 テ ロ ペ プ チ ドの み を選 択 的 に切 断 して コ ラー ゲ ン を抽 出 す る方 法 とし て,強 ア ル カ リを用 い る方 法 が そ の後 考 案 さ れ た15)。工 業 用 ゼ ラ チ ンの 製 造 時 に 骨 や 皮 を 石 灰 漬 け す るの は,テ ロペ プ チ ドを ア ル カ リ に よ り切 断 して ぜ ラ チ ン を抽 出 しや す くす るた め で,コ ラー ゲ ン の抽 出 と 原理 的 に は 同 じ で あ る。 た だ し,コ ラ ー ゲ ン の抽 出 法 が 工 業 用 ゼ ラ チ ン の そ れ と違 う点 は,コ ラー ゲ ン は温 度 が 上 が る とす ぐに変 性 して し ま うの で,抽 出 は低 温 で行 う こ とで あ る。 そ れ に対 し,工 業 用 ゼ ラチ ン は収 率 を上 げ るた め に熱 水 で 抽 出 す る。Fig.6に コ ラー ゲ ン と工 業 用 ゼ ラチ ン の製 造 工 程 の ス キ ー ム を示 した 。 6.お わ り に コ ラ ー ゲ ンの 研 究 が 分 子 レベ ル で 行 わ れ る よ う に な っ てか ら約40年 にな る。 そ の うち の 最 初 の20年 くらい の 間 に得 られ た 知 見 に つ い て 一 部 を紹 介 した 。 最 近 は コ ラ ー ゲ ン の い ろ い ろ な 生 理 機 能 が 明 か に な っ て き て い る1)。しか し,コ ラ ー ゲ ンの 生 体 内 で の も っ とも重 要 な役
―76― 渡 辺 和 男 日本写真学会誌 割 は,や は り動 物 の 形 態 の維 持 で あ ろ う。 した が っ て, コ ラー ゲ ン の構 造 に関 す る研 究 は ,も っ と も基 本 的 か つ 重 要 な も ので あ る 。 生 体 内 の 全 タ ンパ ク 質 の 約3分 の1を 占 め る コ ラ ー ゲ ン は,工 業 用 原 料 と して も継 続 的 に安 定 し て供 給 しつ づ け られ るだ ろ う。 な ぜ な ら ば,コ ラ ー ゲ ン は,食 肉 の 生 産 に よ っ て 生 ず る骨 や 皮 とい った い わ ゆ る廃 物 か ら生 産 で き る か らだ 。 生 物 資 源 の有 効 利 用 の観 点 か ら も,コ ラ ー ゲ ン の生 産 と利 用 は もっ と推 進 され て よい と思 う 。 さ ら に,コ ラ ー ゲ ン は天 然 物 な の で,人 体 に も環 境 に も優 しい 素 材 とい え る。 した が っ て,コ ラ ー ゲ ン利 用 の 推 進 は,最 近 台 頭 して きた 環 境 重 視 の考 え方 に も合 致 して お り,今 後 ます ま す コ ラ ー ゲ ン の新 しい 用 途 開 発 が望 まれ る。 謝 辞 本 稿 を執 筆 す る に あ た り貴 重 な 助 言 を賜 り ま し た, (株)ニ ッ ピ,バ イ オ マ ト リ ック ス 研 究 所 服 部 俊 治 博 士 な らび にニ ッピ ゼ ラ チ ン工 業(株)伊 藤 政 人 博 士 に感 謝 い た し ます 。 参 考 文 献 1) 林 利 彦," 細 胞 外 マ トリ ッ ク ス のバ イ オ サ イ エ ン ス とバ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー", 藤 本 大 三 郎 編, アイ ピ ー シ ー, 東 京, 1990, P.40
2) K. A. Piez, Matrix Biol., 16, 85 (1997)
3) P. M. Royce and B. Steinmann, "Connective Tissues and Its Disorders", John Wiley & Sons, Inc ., New York, 1993, p.249
4) 桑 葉 くみ 子, 藤 井 忠彦, 日本 写 真 学 会 誌, 58, 38 (1995) 5) K. Kuwaba and T. Fujii, J. Photographic Sci ., 44, 62 (1996) 6) T. Hayashi and Y. Nagai, J. Biochem., 86, 453 (1979) 7) 藤 井 忠 彦," に か わ とゼ ラ チ ン, 改 訂 版", 我 孫 子 義 弘 編 集 代
表, 丸 善, 大 阪, 1997, p.165
8) K. Kiihn, "Structure and Function of Collagen Types", R. Mayne and R. E. Burgeson, Eds., Academic Press, Orland, FL, 1987, p.1
9) K. Watanabe, J. Nakagawa , T. Ebihara, and Y. Okamoto, Polymer, 37, 1285 (1996)
10) 岡 本 康, "に か わ とゼ ラ チ ン, 改 訂 版", 我 孫 子 義 弘 編 集 代 表, 丸 善, 大 阪, 1997, p.135
11) H. A. Kramers, J. Chem. Phys ., 14, 415 (1946) 12) P. Debye, J. Chem. Phys., 14, 636 (1946)
13) E. Heidemann, J. Soc. Leather Technologists & Chemists , 66, 21 (1982)
14) 特 公 昭37-14426, 同 昭37-13871, 同 昭44-11037 , 同 昭44-1175, 同 昭43-25829, 同 昭43-27513, 同 昭46-15033
