結果と考察

(1)

熊本大学学位論文

エンドトキシンショック抑制剤としての

ジメチルアセチル-β-シクロデキストリンの有効利用

2006

本山敬一

(2)

エンドトキシンショック抑制剤としての

ジメチルアセチル-β-シクロデキストリンの有効利用

2006

本山敬一

Potential Use of 2,6-Di-O-methyl-3-O-acetyl-β-cyclodextrin as a New Therapeutic Agent for Endotoxin Shock Induced by LPS

Keiichi Motoyama

(3)

Potential Use of 2,6-Di-O-methyl-3-O-acetyl-β-cyclodextrin as a New Therapeutic Agent for Endotoxin Shock Induced by LPS

Keiichi Motoyama

Sepsis is a life-threatening disorder that occurs when an overwhelming infection and immune responses lead to low blood pressure and blood flow, resulting in tissue damage, multiple organ failure and death. Severe sepsis has a high death rate of 30-70%, depending on the type of organism causing the infection and the degree of organ failure. Unfortunately, a number of clinical trials using an antibody-induced blockade of lipopolysaccharide (LPS) during sepsis did not show enough substantial benefits. In this study, we evaluated the potential use of 2,6-di-O-methyl-3-O-acetyl-β-CyD with a degree of substitution of an acetyl group of 7 (DMA7-β-CyD) as a new therapeutic agent for endotoxin shock induced by LPS. First, we examined cytotoxicity of cyclodextrins (CyDs) for murine macrophages. Next, we investigated the effects of CyDs on nitric oxide (NO) and inflammatory cytokine production from murine macrophages stimulated with LPS. In addition, to reveal the inhibitory mechanism of 2,6-di-O-methyl-α-CyD (DM-α-CyD) and DMA7-β-CyD on inflammatory cytokines production from macrophages stimulated with LPS, we examined the effects of CyDs on biding of LPS to cell surface and the expression of LPS receptors as well as the interaction of LPS and CyDs in solution. Furthermore, the effects of CyDs on survival rate and organ failure in endotoxin shock mice induced by LPS and D-galactosamine were examined. The results obtained here are summarized as follows:

1) In the absence of LPS, almost all CyDs showed no cytotoxicity in murine macrophages up to 10 mM, although DM-β-CyD decreased cell viability to about 40% of the control value at 10 mM.

In the range of high concentrations, the cell viability was decreased by adding CyDs, however, DMA7-β-CyD had no cytotoxicity up to 100 mM. These results suggest that DMA7-β-CyD has potential as a novel excipient for injections.

2) Of 15 CyDs, DM-α-CyD and DMA7-β-CyD had greater inhibitory activities than did the other CyDs against NO production in RAW264.7 cells, a murine macrophage-like cell line, stimulated with LPS without showing any cytotoxicity. These inhibitory effects were concentration- dependent and were independent on the type of macrophages and LPS (serotype O111:B4 or O55:B5). Furthermore, DMA7-β-CyD lowered NO production in RAW264.7 cells stimulated with lipoteichoic acid (LTA), but not peptidoglycan (PGN), polyinosinic-polycytidylic acid (PolyI:C) or CpG-oligonucleotido (CpG-DNA). On the other hand, DM-α-CyD suppressed NO production upon stimulation with LTA, LPS and PolyI:C, but not PGN or CpG-DNA. Theses results indicate that the inhibitory effects of CyDs depend on the nature of TLR (toll-like receptor) ligand. In addition, DM-α-CyD and DMA7-β-CyD, but not natural CyDs or hydroxypropyl (HP)-CyDs, suppressed tumor necrosis factor-α (TNF-α) production in RAW264.7 cells stimulated with LPS.

3) The induction of inducible NO synthase (iNOS), TNF-α, IL-1α, IL-6 and IL-10 mRNA in RAW264.7 cells stimulated with LPS was inhibited by the addition of DM-α-CyD and DMA7-β-CyD. Also, theses inhibitory effects of DM-α-CyD and DMA7-β-CyD on iNOS and various cytokine mRNA expressions were in a concentration-dependent manner. Additionally, DM-α-CyD and DMA7-β-CyD suppressed the protein expression of iNOS and TNF-α after stimulation of RAW264.7 cells with LPS. Furthermore, DM-α-CyD and DMA7-β-CyD

(4)

inhibited LPS-induced NF-κB localization into nucleus of the cells. Taken together, it is evident that DM-α-CyD and DMA7-β-CyD suppresses LPS-activated NO and proinflammatory cytokine expression at the pre-transcriptional level.

4) DM-α-CyD and DMA7-β-CyD inhibited the biding of LPS to cell surface of RAW264.7 cells, suggesting that the inhibitory mechanism of CyDs on NO and TNF-α production from macrophages stimulated with LPS is contributed to the impairment of binding of LPS to its receptors such as CD14 and TLR4/MD2 complex on the cell surface.

5) DM-α-CyD released CD14 from lipid rafts by the secondary effect of efflux of phospholipids including sphingomyelin localized in lipid rafts, but not cholesterol, from the cell surface.

However, DM-α-CyD did not show the significant change of TLR4/MD2 expression. On the other hand, DMA7-β-CyD did not affect the expression of both CD14 and TLR4/MD2 because of little interaction with cell membrane components. These results suggest that DM-α-CyD inhibits the binding of LPS to cell surface through the extractions of CD14 from lipid rafts, while DMA7-β-CyD, not DM-α-CyD, interacted with LPS in a concentration-dependent manner.

These results suggest that DMA7-β-CyD inhibited binding of LPS to cell surface through the interaction with LPS. Hence, the inhibitory effects of DM-α-CyD and DMA7-β-CyD on NO and TNF-α production from macrophages stimulated with LPS are probably due to the suppression of binding of LPS to its receptors on the cell surface, but which were in a different way.

6) In the absence of CyDs, all of the mice died within 12 h after administration of the aqueous solution containing 100 ng of LPS and 25 mg of D-galactosamine. When 100 mM DMA7-β-CyD was concomitantly administered with both LPS and D-galactosamine intraperitoneally in mice, the survival rate was significantly improved in a concentration- dependent manner. Interestingly, DMA7-β-CyD increased the survival rate of endotoxin shock mice even when DMA7-β-CyD was administered intravenously and LPS and D-galactosamine were intrapritoneally administered, suggesting the interaction of LPS and DMA7-β-CyD not only in the intraperitoneal cavity but also in blood and/or tissues of mice. On the other hand, DM-α-CyD did not improve the survival rate of the endotoxin shock mice.

7) Upon stimulation with LPS and D-galactosamine, the serum levels of TNF-α, AST (aspartate transaminase) and ALT (alanine transaminase) markedly augmented, but DMA7-β-CyD strikingly inhibited the increase in these levels. Besides, endotoxin shock mice treated with DMA7-β-CyD ameliorated severe liver inflammation such as hemorrhage, infiltration of neutrophils and apoptosis of hepatocytes. These results suggest that LPS/DMA7-β-CyD complexes suppressed the production of inflammatory cytokines in endotoxin shock mice through the impairment of the recognition of LPS by Kupffer cells.

In conclusion, the present study demonstrates that DMA7-β-CyD lowered NO and various proinflammatory cytokines’ production in murine macrophages stimulated with LPS, probably due to the suppression of binding of LPS to its LPS receptors on the cells, although these suppression mechanisms are likely to be different. In addition, DMA7-β-CyD possesses less cytototxicity and appropriate physicochemical and biopharmaceutical properties for injections. Therefore, a new strategy is proposed involving the intravenous injection of DMA7-β-CyD for treatment of endotoxin shock induced by LPS.

(5)

緒言

敗血症性ショックとは、感染による過度の全身性炎症反応が引き起こすショック症状であり、その診断と治療の進歩にもかかわらず、罹患者数は過去数十年にわたり増加し続けている。この増加傾向は、易感染性患者の増加や侵襲的処置 (血管留置カテーテルなど) の汎用を反映して、大病院ほど顕著にみられる。 National nosocomial infection surveillance (NNIS) system による病院内部門別にみた敗血症の頻度は、腫瘍部門、熱傷･外傷部門、集中治療部門でもっとも高く、¹⁾一度ショック状態に陥ると、その致死率は 30 ~ 50％に達するといわれる。米国での調査によると、敗血症性ショックに伴う死亡者数は 1970 年には約 35,000 人であったのが、1980 年には約 94,000 人、2000 年には約 210,000 人に達しており、^{2, 3)} 治療薬の開発が急務となっている。

この敗血症性ショックはグラム陰性菌、グラム陽性菌の両方において増加しているが、主としてグラム陰性菌に起因する場合が多く、主な原因物質としてエンドトキシンすなわちリポポリサッカライド (LPS) が知られている (Fig. 1)。 LPS の分子量は二量体として 10,000 ~ 20,000 であり、水溶液中ではミセルを形成して見かけ上 30万 ~ 100万の大きな分子量の集合体として存在する。⁴⁾ このLPS はグラム陰性菌外膜構成成分の一つであり、疎水性のリピドA (lipid A) を活性中心とし、それと共有結合したオリゴ糖および親水性のO抗原で構成される。リピドA の化学構造は芝、

楠本らの全合成によって明らかにされ、C-1 位およびC-4’ 位にリン酸基が結合した β-(1,6)-D-グルコサミンジサッカライドを基本骨格とし、C-2、C-2’ 位またはC-3、C-3’

位にアシル基が結合している。⁵⁾ また、大腸菌由来のリピドA は分子中にアシル基が 6 本あり、その疎水相互作用により分子全体が安定した構造を保持している。現在では様々なリピドA類縁体が合成され、分子内のアシル基の数や構造は、その生物活性に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。⁶⁾ 例えば、分子内アシル基が 6 本の大腸菌型ヘキサアシルリピドA は、ヒトとマウスのいずれにおいても強い内毒素活性を示すのに対し、アシル基が 4 本の生合成前駆体型テトラアシルリピドA はヒトにおいてはアンタゴニスト作用を示すがマウスではエンドトキシン作用を有する。

7) 一方、アシル基が 2 本の N,N-ジアシル体は中央のグリコシド結合が回転できるほど立体構造が不安定であり、エンドトキシン活性を持たない。このことから、LPS レセプターによるリピドA の認識は疎水性相互作用のほかにも、リピドA 分子の特定の構造がきわめて重要であると考えられる。

(10)

O

NH

O O O

O

NH

HO O O O HO O

P O O O

O

P O O

O

O O

HO

Carbohydrate core O - antigen

Lipid A

O

NH

O O O

O

NH

HO O O O HO O

P O O O

O

P O O

O

O O

O HO

NH

O O O

O

NH

HO O O O HO O

P O O O

O

P O O

O

O O

HO

Carbohydrate core O - antigen O - antigen

Lipid A

Fig. 1. Structure of LPS from Escherichia coli

細菌感染時における LPS 認識は、白血球、単球、マクロファージ上の CD14 や toll-like receptor 4 (TLR4)/MD2 複合体などのレセプターを介して行われ、生体は病原体の処理に努める。 Fig. 2 にマクロファージによる LPS 認識機構を示す。

LPS は血中において LPS binding protein (LBP) と結合した後、膜上に存在する CD14 と結合し、その後、細胞内情報伝達を司る TLR4/MD2 複合体に結合して細胞内情報伝達の活性化を誘導する。^8-15) LPS による細胞の活性化経路には、アダプター分子であるMyD88 (myeloid differentiation factor 88) を介した経路と TRIF (toll/interleukin-1 receptor domain-containing adaptor inducing interferon-β) を介した MyD88 非依存的経路が知られている。前者は、TRAF6 (TNF receptor associated factor 6) を介して転写因子である NF-κB (nuclear factor κB) を活性化して炎症性サイトカインを産生する。一方、後者はTRAF3 を介してIRF-3 (interferon regulatory factor 3) を活性化し INF-β (interferon-β) を誘導する。^{16, 17)}

LPS はナノグラムレベルという極めて微量でマクロファージを活性化し、炎症性サイトカイン (tumor necrosis factor-α (TNF-α)、interleukin-1 (IL-1)、interleukin-6 (IL-6) など)、一酸化窒素 (nitric oxide：NO)、プロスタグランジン、血小板活性化因子 (platelet-activating factor：PAF) などを産生するとともに、^18-21) その過程で、

補体系、凝固系、キニン系、副腎皮質刺激ホルモン/エンドルフィン系も活性化するため、多量のグラム陰性菌が全身循環系に移行すると、全身性炎症反応症候群 (systemic inflammatory response syndrome：SIRS) や敗血症を経て、重篤な場合は多臓器不全 (multiple organ failure：MOF) を誘発し、死に至る。

(11)

P P

LBP LPS

CD14

MD2 TLR4

TIRAP MyD88

IRAK-4 IRAK-1

TRAF6

IKKαIKKβ

IKKi/IKKε TBK1

IRF3 NF-κB

IκB

NF-κB IRF3

Inflammatory cytokines INF-β

MyD88 dependent pathway MyD88 independent pathway TRIF/TICAM-2

Stat1 TRIF/TICAM-1

Fig. 2. Proposed LPS Recognizing Mechanism and LPS/TLR4 Signals

炎症性サイトカインである TNF-α は、敗血症性ショックにおける重要な因子である。 TNF-α は本来 76 個のアミノ酸から成る疎水性ペプチドを N末端側に有する

Ⅱ型細胞膜貫通タンパク質であるが、LPS などの刺激によりプロセシングされて 57 個のアミノ酸から成る分子量 17,000 の可溶性タンパク質として細胞外に放出される。これが腫瘍壊死因子受容体 (TNF-R) に結合すると、TRAF2 を介して MAP3K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase) が活性化されて転写因子 NF-κB の核内移行が誘導される (Fig. 3)。この経路は LPS や IL-1 などの MyD88 dependent pathway と一部共有しており、産生されるサイトカインの autocrine あるいは paracrine 的な作用により炎症反応はさらに増強される。その結果、細胞傷害活性のほか、繊維芽細胞の増殖促進、造血細胞の分化誘導、

intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) や endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1) などの接着分子、IL-1、IL-6、granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) などの発現が誘導され、いわゆる敗血症カスケードが惹起される。

(12)

CD14/TLR4 LPS/LBP

IL-1R IL-18R TNF-R MD2

Plasma membrane

TRADD TRAF -2RIP

MyD88 TRAF-6 ECSIT

IRAK

TAK1 TAB1 NIK

MEKK1 MAP3K

layer

IKK complex α β γ γ

Nuclear translocation Gene regulation

Iκ-Bα

NF-κB P

Ubiquitin-conjugation Proteasome

NF-κB

Iκ-Bα Receptor-

inducing complexes

Nuclear

Fig. 3. Simplified, Hypothetical Overview of Signal Networks Emanating from Different Receptors and Directed towards NF-κB

現在、敗血症の治療法として、ステロイド療法、抗エンドトキシン療法、抗サイトカイン療法 (抗TNF-α 抗体、抗IL-1抗体)、²²⁾ ポリミキシンB吸着カラムを用いた各種血液浄化法などが行われている。^23-25)また、米国では重症敗血症治療薬として遺伝子組換え型ヒト活性化プロテインC (drotrecogin alpha, 製品名：Xigris^TM (ザイグリス)) が認可されており、死亡率の改善が報告されている。^26-28) さらに近年、敗血症の治療を期待させる研究も数多く報告されている。例えば、敗血症の際に産生される補体成分 C5a やサイトカインの一種であるマクロファージ遊走阻止因子 (macrophage migration inhibitory factor：MIF) を阻害することにより、エンドトキシンショックモデル動物の致死率が著しく改善されたという報告がある。^{29, 30)} その他、suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS-1)³¹⁾ が、LPS 刺激後の NF-κΒ や STAT の活性化を抑制すること、また、single immunoglobulin IL-1R-related molecule (SIGIRR)³²⁾ が、IRAK や TRAF6 と相互作用して LPS や IL-1 シグナルを阻害することが明らかとなり、これら LPS シグナルのネガティブレギュレーターのノックアウトマウスはエンドトキシンショックに対し耐性を示すことが報告された。また、LPS アンタゴニストとして機能する E5564 などのリピドA 類縁体

(13)

を用いて、敗血症治療薬の開発を企図した臨床試験が行われている。^33-35) 現在、臨床ではポリミキシンB吸着カラムを用いた血中 LPS の除去が行われており、この方

法は MOF などの重篤な症状に対しても高い救命率を示すが、操作が繁雑であるた

め、簡便で効果的な治療法の開発が望まれている。このように敗血症治療に対する多くの研究がなされているが、実験動物とヒトではエンドトキシン感受性に種差があることや候補薬物の免疫原性が問題となり、臨床試験では十分な効果が得られていないのが現状である。

シクロデキストリン (cyclodextrin：CyD, Fig.4) は、デンプンに CyD 生成酵素を作用させて得られる環状マルトオリゴ糖であり、種々の薬物をその疎水空洞内に取り込んで包接複合体を形成する単分子的ホスト分子に分類される。^{36, 37)} CyD の超分子的な包接特性は、食品、化粧品、臨床検査薬、繊維、樹脂など多方面で利用されており、薬剤学・製剤学領域では、医薬品の安定化、溶解性や放出性の制御、バイオアベイラビリティの向上、油状あるいは低融点物質の紛体化、揮散性の防止、苦味･悪臭および局所刺激性の軽減などに利用されている。^38-40) しかしながら、天然 CyDs を薬物送達システム (drug delivery system：DDS) に応用するには限界があるため、

機能性や生体適合性を高めた種々の CyDs 誘導体が開発され、DDS の応用に関する基礎的研究が活発に行われている。^41-48) 最近では、CyDsの包接対象が低分子から生理活性ペプチドやタンパク質性薬物などの高分子へ拡がり、その応用範囲も経口投与製剤から注射剤や経皮、経粘膜適用剤などの非経口投与製剤へ拡大している。^49-54)

R₃O

OR₂ OR₁

O

R₂O R1O

O

CH₂OR₃ R3OCH2

R₃OCH₂ CH2OR3

CH₂OR₃

CH2OR3

O

O O R3OCH2

O O

OR1

O OR2

OR1 O

O R1O

O R₂O O OR2

O ORO₁

R2OR1O

OR2

Hydrophilic exterior

Hydrophobic cavity

OR2

R₁O

R₃O

OR₂ OR₁

O

R₂O R1O

O

CH₂OR₃ R3OCH2

R₃OCH₂ CH2OR3

CH₂OR₃

CH2OR3

O

O O R3OCH2

O O

OR1

O OR2

OR1 O

O R1O

O R₂O O OR2

O ORO₁

R2OR1O

OR2

Hydrophilic exterior

Hydrophobic cavity

OR2

R₁O

Fig. 4. Structure of β-CyDs

(14)

一方、CyDs はその空洞径に応じて赤血球膜などの生体膜から主な構成成分であるリン脂質やコレステロールなどの脂質類を熱力学的平衡に基づいて可溶化し、溶血や生体膜の形態変化を惹起すること、またその際、CyDs は赤血球や生体膜からタンパク質を二次的に遊離させることが報告されている。^55-58) さらに近年、赤血球膜を含む生体膜にはリピッドラフトと呼ばれるコレステロールやスフィンゴ脂質 (スフィンゴミエリンなど) が豊富な脂質マイクロドメインが存在し、methyl-β-CyD (M-β-CyD) や hydroxypropyl-β-CyD (HP-β-CyD) は細胞膜表面上のリピッドラフトからコレステロールを引き抜き、そのドメイン構造を破壊することが報告されてい

る。^{59, 60)} このリピッドラフト画分には、シグナル伝達に関与する種々のタンパク質

(H-ras, epidermal growth factor receptor (EGF-R), glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein, G proteins など) が局在しており、β-CyD 誘導体を用いてリピッドラフト構造を破壊すると、局在したタンパク質を介するシグナル伝達が阻害

される。^61-65) また、β-CyD より空洞径の小さな α-CyD や 2,6-di-O-methyl-α-CyD

(DM-α-CyD) は、細胞膜からコレステロールよりもむしろリン脂質を選択的に可溶化

することから、M-β-CyD や HP-β-CyD とは異なる機構でリピッドラフトに影響する可能性が考えられる。また近年、GPI アンカータンパク質の一つであり、LPS レセプターとしても知られる CD14 もリピッドラフトに局在することから、LPS シグナルの足場としてリピッドラフトは機能していることが報告された。^{66, 67)} このことから我々は、CyD誘導体が脂質マイクロドメインと相互作用することにより、LPS レセプターの活性やそのシグナル伝達を抑制するという作業仮説 (Fig. 5A) をたてるに至った。

一方、CyDs はその包接特性から、LPS の疎水性部位であるリピドAと相互作用することが予想される。そこで我々は、別の作業仮説として CyDs が LPS と複合体を形成することにより LPSの細胞表面への結合を抑制すると推察した (Fig. 5B)。最近、当研究室において新規に合成した 2,6-di-O-methyl-3-O-acetyl-β-CyD

(DMA-β-CyD) は、分子内アシル基数の増大にともない、生体膜との相互作用が著し

く低下する一方、長鎖アシル基を有する安息香酸エステル類とは強く相互作用することを報告した。⁶⁸⁾ このことから、DMA-β-CyD は LPS リピドAの長鎖アシル基と相互作用して LPS レセプターによる認識を抑制する可能性が考えられる。

このような背景の下、本論文の第1章では、各種 TLR リガンド刺激によるマクロファージからの NO および TNF-α 産生に及ぼす各種 CyDs の影響について検討

(15)

した。第2章では、DM-α-CyD および DMA7-β-CyD によるマクロファージからの NO および TNF-α 産生抑制機構について検討し、第 3 章では、エンドトキシンショックモデルマウスを作成し、in vivo ^における CyDs の抑制効果について検討した。以下に本研究で得られた知見を詳述する。なお、Table 1 に本研究で使用した CyDs を示す。

(B)

CD14

MD2 TLR4

Cell membrane

LPS/CyD

P P P

P

LPS

P P

CyD

P P

Signaling ：Cholesterol β-CyDs α-CyDs

：Phospholipids

CD14 MD2

TLR4

Lipid Rafts

perturbation (A)

Signaling ：Cholesterol β-CyDs -CyDs

α

：Phospholipids

CD14 MD2

TLR4

Lipid Rafts

perturbation (A)

Fig. 5. Hypothesis of Inhibitory Effects of (A) LPS Signaling by Interaction of CyD with Phospholipids or Cholesterol in Plasma Membrane of Cells and (B) LPS Binding to Receptors by Interaction between CyD and LPS

Table 1. Chemical Structures and Physicochemical Properties of CyDs Used in This Study

Compound n R₁ R₂ R₃ D.S. ^a)

n O

R2O

OR1 O OR3

1 4 5

3 2 6

n O

R2O

OR1 O OR3

1 4 5

3 2 6

a) Average degree of substitution, b) Molecular w eight, c) In w ater at 25°C, d) The concentration of CyDs to induce 50%

hemolysis of rabbit erythrocytes, e) 2-Hydroxypropyl-CyDs, f) 2,6-Di-O-methyl-CyDs, g) Methyl-β-CyD,

h) 2,6-Di-O-methyl-3-O-acetyl-β-CyDs, i) Maltosyl-CyDs, j) Sulfobutyl ether-β-CyD, k) 6Â-amino-6Â-deoxy-amino-CyDs, l) 6Â-(ω-aminoethylamino)-6Â-deoxy-amino-β-CyD, m) 6Â-(ω-aminobutylamino)-6Â-deoxy-amino-β-CyD, n) Acetyl groups.

M.W. ^b) Solubility (g/dL) ^c) Hemolytic activity (mM) ^d)

α-CyD 6 -H -H -H - 972 14.5 14

β-CyD 7 -H -H -H - 1135 1.85 5.7

HP-α-CyD ^e) 6 -H or -CH₂CH( CH₃)OH 4.1 1210 > 50 > 50 HP-α-CyD ^e) 6 -H or -CH₂CH( CH₃)OH 4.1 1210 > 50 > 50

DM-α-CyD ^f) 6 -CH₃ -H -CH₃ 12 1141 > 50 6.0

DM-β-CyD^f) 7 -CH₃ -H -CH₃ 14 1331 57 1.3

DMA2-β-CyD ^h) 7 -CH₃ -COCH₃ or -H -CH₃ 1.5 ⁿ⁾ 1394 > 60 5.5 M-β-CyD^g) 7 -H or -CH₃ 12.6 1311 > 50 2.8 DMA4-β-CyD ^h) 7 -CH₃ -COCH₃ or -H -CH₃ 3.8 ⁿ⁾ 1492 > 60 12.5 DMA6-β-CyD ^h) 7 -CH₃ -COCH₃ or -H -CH₃ 6.3 ⁿ⁾ 1594 > 60 60

DMA7-β-CyD ^h) 7 -CH₃ -COCH₃ -CH₃ 7 ⁿ⁾ 1624 > 60 > 100

γ-CyD 8 -H -H -H - 1297 23.2 > 50

SBE7-β-CyD ^j) 7 -H or -(CH₂)₄SO₃Na 6.2 2122 > 50 -

G₂-α-CyD ⁱ⁾ 6 -H -H -H or -maltose 1 1297 > 50 25

G₂-β-CyD ⁱ⁾ 7 -H -H -H or -maltose 1 1459 > 50 8.4

HP-β-CyD^e) 7 -H or -CH₂CH( CH₃)OH 4.8 1413 > 50 14.5

HP-γ-CyD^e) 8 -H or -CH₂CH( CH₃)OH 4.2 1541 > 50 -

MA-α-CyD ^k) 6 -H -H -H or -NH₂ 1 973 - -

MA-β-CyD^k) 7 -H -H -H or -NH₂ 1 1134 - -

MA-γ-CyD^k) 8 -H -H -H or -NH₂ 1 1296 - -

ED-β-CyD^l) 7 -H -H-H or -NH(CH₂)₂NH₂ 1 1177 - -

EB-β-CyD^m) 7 -H -H-H or -NH(CH₂)₄NH₂ 1 1205 - -

(16)

結果と考察

第 1 章各種 TLR リガンド刺激によるマクロファージからの NO および TNF-α 産生に及ぼす各種シクロデキストリンの影響

第 1 節序

敗血症時の生体反応のメディエータとしては、サイトカイン、補体系因子、接着分子、エイコサノイド、フリーラジカル、好中球プロテアーゼ、NO、PAF、侵襲ホルモン (カテコールアミン、コルチゾール、グルカゴン) などが挙げられる。中でもサイトカインは、感染防御や免疫、エネルギー産生やタンパク質合成、創傷治癒、血管内皮細胞活性化など一連の反応において中心的役割を演じている。⁶⁹⁾ サイトカインは感染などの主に外的な刺激に反応して産生され、ホルモンと同様に産生部位から離れた組織に作用する endocrine の他に、産生細胞自体ないしその近傍の細胞に作用する autocrine や paracrine 的な作用を有する。特に、敗血症時に産生される

TNF-α や IL-1 などの炎症性サイトカインは、主にグラム陰性菌の外膜構成成分で

ある LPS によりマクロファージから産生され、過剰な炎症反応は敗血症性ショック

(エンドトキシンショック) を惹起する。また、近年、グラム陽性菌由来のリポタイ

コ酸 (lipoteichoic acid：LTA) による敗血症もしばしばエンドトキシンショックを併発することが知られている。^70-72)

エンドトキシンショックを誘発する他の物質として敗血症時にマクロファージから産生される NO が挙げられる。 NO は一酸化窒素合成酵素 (nitric oxide

synthase：NOS) によりアルギニンから産生される。 NOSには恒常的に細胞内に

発現している構成型の cNOS (constitutive NOS) とサイトカイン等の刺激により発現される誘導型の iNOS (inducible NOS) に大別され、cNOS は血管内皮細胞に存在する eNOS (endothelial NOS) と神経細胞に存在する nNOS (neuronal NOS) に分類される。 cNOS の活性化には細胞内カルシウム濃度の増加を必要とするが、

iNOS は細胞内カルシウム濃度に依存せず、マクロファージ、平滑筋細胞、肝細胞、

軟骨細胞、心筋細胞などの様々な細胞で誘導される。敗血症時には、LPS や LTA により誘導された過度の iNOS により産生された NO が原因となって、敗血症性ショックに特徴的なハイパーダイナミックス (心拍出量増大、体血管抵抗低下、低血圧、

頻脈) を呈する。特に NO の過剰産生が持続すると、難治性の低血圧、内皮細胞

(17)

傷害、心筋収縮抑制などが惹起され、多臓器不全におちいり、死に至る場合も少なくない。^{73, 74)}

このように、TNF-α や NO は敗血症において重要な役割を担っていることから、

マクロファージからのサイトカインや NO 産生抑制法について検討することは敗血症性ショックの改善を企図する上で有用であると考えられる。そこで本章では、各種 TLR リガンド刺激による各種マウスマクロファージからの NO および TNF-α 産生に及ぼすCyDs の影響を検討した。はじめに本章第2節で、WST-1 法によりマクロファージに対する各種 CyDs の細胞傷害性について検討した。第 3 節第 1 項では TLR4 のリガンドである LPS 刺激によるマクロファージからの NO 産生に及ぼす各種 CyDs の影響を検討し、第2項では、LPS 以外の各種 TLR リガンド刺激による NO 産生に及ぼす各種 CyDs の影響を検討した。また、第 4 節では LPS 刺激後の TNF-α 産生に及ぼす各種 CyDs の影響について検討した。

第2節マクロファージに対する各種シクロデキストリンの細胞傷害性

高濃度のCyD は細胞膜上の脂質成分であるコレステロールやリン脂質と相互作用して、細胞膜成分を漏出させることにより、赤血球の溶血や局所刺激性を惹起することが知られている。^{39, 40)} したがって、CyDs を細胞系に適用する場合、その細胞毒性を予め検討しておく必要がある。

膜損傷を受けた細胞のダメージを評価する方法として、細胞外の色素を細胞内に摂取させて酵素により発色させる方法 (MTT assay) ⁷⁵⁾ と、細胞に存在する種々のタンパク質のうち、lactate dehydrogenase の細胞外流出量を測定する方法 (LDH法) ⁷⁶⁾ がよく知られている。本研究では、MTT assay の改良法である還元型発色試薬を用いた WST-1 法により各種マウスマクロファージに対する各種 CyDs の細胞傷害性を検討した。なお本研究では包接能および溶解度を考慮して親水性 CyDs 誘導体を用いた。また、LPS は生理的 pH において負に荷電するため、正電荷を有するアミノ化CyDs (MA-CyDs、ED-β-CyD、BD-β-CyD) ならびに負電荷を有する SBE7-β-CyD についても検討した (Table 1)。