博 士 （ 農 学 ） 田 中 健 穂
学 位 論 文 題 名
微生物由来の慢性疾患治療薬の探索 学位論文内容の要旨
慢性 疾患 とし て炎 症と循環器疾患を取り上げ、これら疾患への治療薬となる可能性を 有する化合物の微生物培養液からの探索を行なった。
1．インターロイキン・1p変換酵素(ICE)阻害剤に関する研究
炎症 反応 に深 く関 与するインターロイキン・1(IL‑1）の作用を阻害する物質が、新し いタイプの抗炎症薬になりうると考えられた。IL‑1の作用を阻害するにあたっては、IL‑
1の産 生、受 容体 への 結合 の阻 害、 受容 体か ら下 流の シグ ナル 伝達の 阻害 の3点を想定 し 、阻 害剤 が得 られ る可能性の高さ、それぞれの作用点に関する情報量、経験の応用な ど を 比 較 し て 、 特 に 有 望 と 考 え ら れ た IL‑1の 産 生 抑 制 に 着 目 し た 。 ． 11‑1p産 生 の 経 路に は11‑1pの 不活 性な 前駆体 を活 性を 有す る成 熟型 に変 換す るICE が 関与 して いる 。こ の酵素は基質選択性の高いプロテアーゼであることから、この酵素 を 阻害 する こと によ って 、IL‑1ロ 産生を 特異 的に 抑制できると考え、ICEの阻害剤の探 索に着手した。
ICE阻 害 剤 を ス クリ ー ニン グす る系 を構 築す るに あた って 、そ の塩 基配列 に基 づき ICE遺 伝子を クロ ーニ ング し、 これ を大 腸菌 で発 現させてから再構成を行い、酵素活性 を 有す るICEを調 製し た。 このICEを用い た酵 素活 性の 測定 には 、ICEの基 質と してAc‑
Tyr‑Val‑Ala‑Asp‑AMCを用 い、 酵素 反応 によ り生 成さ れるAMCの 量を 螢光 強度 の変化に よ り検 出し た。 また 、酵 素阻 害の 選択性 を評 価す るため、カテプシンB活性測定系を構 築 し、 これ を対 照と して 用い た。 さらに 、ICE阻 害活性を有する物質の細胞系での活性 を 評 価 を す る た め に 、THP‑1細胞 からLPS刺激に より 分泌 され るIL‑ipを測定 する 系を 作 製し た。 これ らス クリーニング系を用いて放線菌および糸状菌株の培養液をスクリー ニ ング した 結果 、Streptomyces sp. E‑1507株、E‑1511株 、E‑1625株 の3株の 培養液中 にICE阻害活性を見いだした。
放線菌SLreptomyces sp. E‑1 507株の培養液17Lより、疎水吸着レジン、シリカゲル及 び 逆相 シリ カゲ ルを 用い て、ICE阻 害活 性物 質EI‑1507‑1とEI‑1507‑2を単 離し た。EI‑
1507‑1とEI‑15 07‑2はともにベンズ【a］アントラセン骨格を有し、分子1勺にエポキシドを 有 する 新規 化合 物で ある こと が明 らかと なっ た。EI‑1507‑1とEI‑1507‑2のICE阻害活性 は 濃度 依存 的で 、50％阻害濃度値(ICso値）はそれぞれ0.23、0.42 mMであった。また、
こ れ ら 化 合 物 はTHP‑1細 胞か らのLPS刺激 によるIL‑ip分 泌を 濃度 依存 的に抑 制し 、そ のICso値はそれぞれ1.1、1.4 mMであった。
放線 菌Streptomyces sp. E‑1511株培養液17Lより、疎水吸着レジン及び逆相シリカゲ
ル を用 いて 、ICE阻 害活 性を有 する 化合 物EI‑1511‑3、EI‑1511‑5が、E‑1625株培養液2 Lより 、同 じく 疎水 吸着 レジン 及び 逆相 シリ カゲ ルを 用い てEI‑1625‑2を単離した。こ れ らは 構造解析の結果から、ともにマニュマイシン系の骨格を有する新規化合物であっ た。
EI‑1511‑3、EI‑1511‑5、EI‑1625‑2のICE阻害 活性 は濃度 依存 的であり、大腸菌で発 現 させ て再 構成 したICEに対す るICso値はそれぞれ0.09、0.38、0.2 mMであった。これ ら はTHP‑1細 胞 か ら 抽 出 、 精製 し たICEに 対して も、 大腸 菌で 発現 させ て再 構成 した ICEと 同様 の強 さで 阻害 した。 また 、こ れら はTI‑IP‑1細胞 から のLPS刺激による11‑1p 分 泌 を 濃 度 依 存 的 に 抑 制 し 、 そ のICso値 は そ れぞ れ5.4、3.6、2.2 mMで あ っ た 。 EI・1511類の 絶対 配置 を決 定す るた めに 、C4位の 側鎖を 除去 した誘導体を調製した が 、こ れら はそ れぞ れの 元の 化合 物と同等のICE阻害活性を有していた。これらのこと か らEI‑15 07類、1511類 、1625類 は選 択的 なICE阻害 剤で ある とと もに 、IL‑1ロ 分泌 抑 制活 性を 有す るこ とが 判明 した 。ま た、EI‑1511類 はEI‑1625類を単離する際に、マ ニ ュマ イシ ン系 の既 知物 質で ある 、ア リサ マイ シン 、U‑56，407、マニュマイシンA、 B、 Gが 単 離 さ れ た が 、 こ れ ら 化 合 物 い ず れ も ICE阻 害 活 性 を 有 し て い た 。 2．工ンドセリンアンタゴニストに関する研究
エン ドセ リン は、 強カ かつ 持続 的な 血管 収縮 、昇 圧作用 を示 す生体内物質として発 見 され た。 その 発見 以来 、血 管収 縮、 昇圧 作用 以外 にも内 皮由 来弛緩因子(EDRF)の放 出 、細 胞増 殖作 用、 気管 収縮 など 多く の薬 理学 的、 生理学 的作 用を示すことが報告さ れ てい て、 他の 血管 作動 性物 質と とも に血 圧の 調節 、恒常 性の 維持に関与しているこ とが示唆されている。
そこ で、 新し いタ イプ の降 圧剤 およ び循 環器 疾患 治療薬 を得 る目的で、エンドセリ ン の 受 容 体 拮 抗 物 質 の 探 索 を 行 っ た 。 そ の結果 、微 生物 培養 液の スク リー ニン グか ら 、放 線菌Streptom yces sp. RE‑701株がエンドセリン拮抗物質を生産していること見 い ださ れた 。Streptomyces sp. RE‑701株の培養液100Lより、疎水吸着レジン、ゲルろ 過 、 逆 相 シ リ カゲ少 を用 いた 精製 によ り、RES‑701‑1を単 離す るこ とが でき た。 単離 したRES‑701‑1はGly‑Asn ‑Trp‑ His‑Gly‑Thr‑ Ala‑ Pro・Asp‑Trp‑ Phe‑Phe‑Asn‑Tyr‑Tyr‑Trp の 配 列 か ら な る16ア ミノ 酸残 基の 新規 ベプ チド であ ると とも に、Glylのaア ミノ 基と Asp9の ァカ ルボ キシ ル基 の間 でア ミド 結合 を有 する 環状ベ プチ ドであることが明らか となった。
RES‑701‑1の エ ン ド セ リ ン受 容 体 拮 抗 作 用はB型受 容体(ETB受容 体） に選 択的 であ り 、牛 小脳膜画分上の受容体への12 5I̲エンドセリン．1の結合をICso値：10 nMで阻害 し た が 、A型 受 容 体(ETA受 容体 ） に 対 し て は5mMで も 作 用を 示 さ か っ た 。RES‑701‑1 の エン ドセ リン 受容 体拮 抗作 用は 動物 種に より 強さ が異を り、 ヒト、ブ夕、ウシ、モ ル モッ トに 対し てはICso値：8〜25 nMと強 カに 作用 するが 、イ ヌ、ウサギに対しては ICso値 ：2.5 mM、 ラ ッ ト に 対 し て はICso値 ：5mM以 上 と 弱 く し か 作 用 し な い 。 ETA、ET13受容体を発現させたCOS糸l｜｜胞を用いてエンドセリンによる細胞内Ca2十濃 度 を測 定す る実 験で は、RES‑701‑1はETB受 容体 を発 現させ た細 胞のエンドセリンによ る 細 胞 内Ca2+濃 度 上 昇 を 抑 制 す る が 、ETA受 容 体 を 発 現 さ せ た 細 胞 に は作 用を 示さ な い こ と と 、 いずれ の細 胞で もRES‑701‑1はそれ 自身 のみ では 細胞 内Ca2+濃 度に 影響 を 与 え な い こ と か ら 、RES‑701‑1がETB受 容体選 択的 なァ ンタ ゴニ スト であ るこ とが
証明された。麻酔下ラットのエンドセリン．1による血圧変動に対するRES‑701‑1の作用 の検討からは、RES‑701‑1はエンドセリン．1投与直後の一過性の降圧を用量依存的に 抑制し、その後の昇圧を増強することから、生体内においてもアンタゴニストとして 作用することが明らかとなった。
これらのことから
RES‑701‑1
は、選択性の高い、優れたエンドセリンB型受容体ア ンタゴニストであることが明らかとなった。学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
微生物由来の慢性疾患治療薬の探索
本 論 文 は 和 文 120頁 、 図38、 表24、 引 用 文 献102、 緒 論 、 第1部 （4章 ） 、 第2部
（4章 ） 、 総 括 、 英 文 要 旨 か ら な り 、 ほ か に 参 考 文 献16編 が 付 さ れ て い る 。 慢 性 疾 患 と し て 炎 症 と 循 環 器 疾 患 を 取 り 上 げ 、 こ れ ら 疾 患 へ の 治 療 薬 と な る 可 能 性 を 有 す る 化 合 物 の 微 生 物 培 養 液 か ら の 探 索 を 行 な っ た 。
1． イ ン タ ー ロ イ キ ン ．1p変 換 酵 素(ICE)阻 害 剤 に 関 す る 研 究
炎 症 反 応 にイ ンタ ーロ イキ ン．1 (11‑1） は炎 症反 応に 深く 関 与し てお り、 その 作用 を阻 害 す る 物 質 は 新 し い タ イ プ の 抗 炎 症 薬 に な り う る と 考 え ら れ た 。IL‑1の 作 用 を 阻 害 す る に あ た っ て は 、 阻 害 剤 が 得 ら れ る 可 能 性 の 高 さ な ど を 比 較 し 、 特 に 有 望 と 考 え ら れ た IL‑1の 産 生 抑 制 に 着 目 し た 。IL‑1p産 生 の 経 路 に は11‑10の 不 活 性 な 前 駆 体 を 活 性 を 有 す る 成 熟 型 に 変 換 す るICEが 関 与 し て い る 。ICEは 基 質 選 択 性 の 高 い プ 口 テ ア ー ゼ で あ る こ と か ら 、ICEを 阻 害 す る こ と に よ っ て 、IL‑1ロ 産 生 を 特 異 的 に 抑 制 で き る と 考 え 、 ICEの 阻 害 剤 の 探 索 に 着 手 し た 。
ICE阻 害 剤 の ス ク リ ー ニ ン グ 系 は 、 ク ロ ー ニ ン グ し たICE遺 伝 子 を 大 腸 菌 で 発 現 さ せ て か ら 再 構 成 を 行 い 取 得 し た 、 酵 素 活 性 を 有 す るICEと 、Ac‑Tyr‑Val‑Ala‑Asp‑AMCを 基 質 と し て 用 い 、 酵 素 反 応 に よ り 生 成 さ れ るAMCの 量 を 螢 光 強 度 の 変 化 に よ り 検 出 す る 系 を 構 築 し た 。 さ ら に 、 阻 害 剤 の 細 胞 系 で の 作 用 を 評 価 を す る た め に 、THP‑l細 胞 か ら LPS刺 激 に よ り 分 泌 さ れ るIL‑1pを 測 定 す る 系 を 作 製 し た 。 こ れ ら ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 用 い て 放 線 菌 お よ び 糸 状 菌 株 の 培 養 液 を ス ク リ ー ニ ン グ し た 結 果Streptom yccs sp.E， 1507株 、 E‑1511株 、 E‑1625株 の 3株 中 に ICE阻 害 活 性 を 見 い だ し た 。 放 線 菌Streptom yces sp. E‑1507株 の培 養液 より 、ICE阻害 活性 を有 する 新規 化合 物EI‑
1507‑1とEI‑1507‑2を 単 離 し た 。EI‑1507‑1とEI‑1507‑2は と も に べ ンズ 【aJアン トラ セン 骨 格 を 有 し 、 分 子 内 に エ ポ キ シ ド を 有 し て し て い た 。EI‑1507‑1とEI‑15 07セ のICE阻 害 活 性 は 濃 度 依 存 的 で あ り 、50％ 阻 害 濃 度 値(ICso値 ） は そ れ ぞ れ0.23、0.42 mMで あ っ た 。 ま た 、 こ れ ら 化 合 物 はTHP‑1細 胞 か ら のLPS刺 激 に よ るIL‑1ロ 分 泌 を 濃 度 依 存 的 に 抑 制 し 、 そ のICso値 は そ れ ぞ れ1.1、1.4 mMで あ っ た 。
放 線 菌Streptomyces sp. E‑1511株 お よ びEI‑1625株 の 培 養 液 よ り 、ICE阻 害 活 性 を 有
男 民
則
房 耿
隆
田 原
西
冨 市
葛
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
する新規化 合物EI‑1511‑3、EI‑1511‑5、EI‑1625‑2を単離し た。これらはともにマニュ マイシン系 の骨格を 持っこと を特徴と していた 。
EI‑1511‑3、EI‑1511‑5、EI‑1625‑2のICE阻害 活性は濃 度依存的 であり、50%阻害濃 度値(ICso値）は それぞれ0.09、0.38、0.2 mMであった。また、これら化合物THP‑1細胞 から のLPS刺激に よるIL‑1ロ分 泌を濃度 依存的に 抑制し、 そのICso値はそ れぞれ5.4、 3.6、2.2 mMで あった。 これらの 結果からEI・1507類、1511類 、1625類は選 択的なICE 阻 害 剤 で あ る と と も に 、 IL‑1p分 泌 抑 制 活 性 を 有 す る こ と が 判 明 し た 。
2．エンドセリンアンタゴニストに関する研究
工 ンドセ リンは、 強カかつ 持続的な 血管収縮、 昇圧作用 を示す生 体内物質 として発 見 された。 ．その発 見以来、 血管収縮、昇圧作用以外にも内皮由来弛緩因子(EDRF)の放 出 、 細胞 増殖作用 、気管収 縮など多 くの薬理学 的、生理 学的作用 を示すこ とが報告 さ れ て いて 、他の血 管作動性 物質とと もに血圧の 調節、恒 常性の維 持に関与 している こ とが示唆されている。
そ こで、 新しいタ イプの降 圧剤およ び循環器疾 患治療薬 を得る目 的で、工 ンドセリ ン の 受 容体 拮 抗 物質 の 探索 を 行 った 。 その 結 果 、微 生 物培 養 液 のスクリ ーニング か ら 、放線菌Streptomyces sp. RE‑701株がエン ドセリン 拮抗物質を生産していること見 い だ さ れた 。 引 き続 き 、こ の 株 の培 養 、精 製 お よび 単 離の 検 討 を行った 結果、RES‑
7 01‑1を単離することができた。
構造解析の結果、単離したRES‑701‑1はGly‑Asn‑Trp‑ His‑ Gly‑Thr‑ Ala‑Pro‑Asp‑Trp‑
Phe‑Phe‑Asn‑Tyr‑Tyr‑Trpの 配列から なる16アミ ノ酸残基 の新規ベプチドであるととも に 、Glylのdア ミノ 基 とAsp9の ァ カ ルボキシ ル基の間で アミド結 合を有す る環状ベ プ チドであることが明らかとなった。
RES‑701‑1の エ ンド セ リン 受 容 体拮 抗 作用 はB型 受 容体(ETB受 容体）に 選択的で あ り、牛小脳膜画分上の受容体への12 5I̲エンドセリン・1の結合を50%阻害濃度(ICso値）：
10 nMで 阻 害 し た が、A型 受 容 体(ETA受 容 体） に 対 して はICso値：5mM以 上と 作 用を 示 さ な かっ た 。RES‑701‑1のエ ン ド セリン受 容体拮抗作 用は動物 種により 異なり、 ヒ ト 、 ブ 夕、 ウ シ 、モ ル モッ ト に 対し て はIC50値 ：8〜25 nMと 強カ に作用す るが、イ ヌ 、 ウ サギ に 対 して はICso値：2.5 mM、ラッ トに対して はICso値：5mM以 上と弱く し か作用しないことが明らかとなった。
ETA、ETB受 容 体を 発 現さ せ た 細胞 を 用い て エ ンド セ リ ンに よ る細胞内Ca2+濃度を 測 定 する 実験から は、RES‑701‑1がETB受 容体選択 的なアンタ ゴニスト であるこ とが証 明 された。 麻酔下ラ ットのエ ンドセリン・1による血圧変動に対するRES‑701‑1の作用の 検 討からは 、RES‑701‑1はエン ドセリン・1投与直後の一過性の降圧を用量依存的に抑制 し 、 その 後の昇圧 を増強す ることか ら、生体内 において もアンタ ゴニスト として作 用 することが明らかとなった。
こ れら の 結 果か ら 、RES‑701‑1は、 選 択性 の 高 い、 優 れ たエ ンド セリンB型 受容体 アンタゴニストであることが明らかとなった。
