鑑識科学,9(1),49 58(2004) 49 技術報告 法科学的試料からの DNA 抽出における QIAamp DNA mini kit の有用性 渡辺剛太郎 山形県警察本部刑事部科学捜査研究所 山形市松波 2 丁目 8 1 DNA Extraction from Forens

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全文

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―技術報告―

法科学的試料からの DNA 抽出における QIAamp DNA mini kit の有用性

渡辺剛太郎

山形県警察本部刑事部科学捜査研究所

〒9908577 山形市松波 2 丁目81

DNA Extraction from Forensic Samples by Use of QIAamp DNA mini kit.

Gotaro Watanabe

Forensic Science Laboratory, Yamagata Prefectural Police H. Q., 281,

Matsunami, Yamagata 9908577, Japan

(Received 25 February 2003; accepted 4 June 2003)

To evaluate the system of the QIAamp DNA mini kit, supplemented by

QIA-GEN for DNA extraction, we carried out a comparison of amounts of extracted

DNA from various forensic samples. Furthermore, bloodstains were made with 2

ml

blood on each of six substrata such as blue denim, wool, mixed spinning, rush

(tata-mi), wood (paulownia), wood (half-split chopsticks), and DNA was extracted

from all specimens one day after the specimen preparation. The amount of extracted

DNA was estimated by ampliˆed sample peak using of the AmpFL STR proˆler kit.

The pure DNA were extracted from blood, bloodstain and other forensic samples.

However, the amount of extracted DNA by the kit was generally less than that of

ex-tracted DNA by the PhenolChloroform extraction method, especially for a small

sample. In order to obtain enough template DNA with the kit, it is necessary to

app-ly the elution buŠer several times on the column. The extracted DNA with the

QIAamp DNA mini kit from all the substrata and old bone did not inhibit PCR

am-pliˆcation. We conclude that this DNA extraction system is convenient and valuable

for forensic practice.

Key words: QIAamp DNA mini kit, DNA extraction, Forensic sample,

PCR ampliˆcation.

現在,DNA 抽出法としてフェノール・クロロホ ルム法が広く用いられている.この方法は,DNA を効率良く抽出することができるが,いくつかの試 料付着担体や汚染物質の混入した試料および陳旧骨 等から抽出した DNA では PCR 阻害のために型判 定が困難な場合がある1).最近,人体に有害な有機 溶媒を用いずに DNA を抽出できるキットが多数市 販されるようになり,法科学的試料からの DNA 型 検査にも用いられるようになった.今回,最も頻繁

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に用いられている QIAamp DNA mini kit27)につい て,法科学的試料からの DNA 抽出および PCR 阻 害の検討を行ったので報告する.

材料および方法

 実験材料 法科学的試料として次のものを用いた.採取後 4°Cで保存した血液,ろ紙に付着乾燥し室温で 1 年 保存した唾液斑,エタノール洗浄後粉末化し室温で 2 年保存した爪,ガーゼに付着乾燥し室温で3年保 存した精液膣液混合斑,山中で発見された死後 1~ 2 年経過および死後 3~5 年経過していると考えら れる人骨.ガーゼに付着乾燥し室温で 1 週間保存し た血痕.ブルージーンズ,羊毛(黒色),混紡(茶 色),い草畳,桐板,割り箸の小片に血液 2 ml を付 着させ,室温で 1 晩乾燥させた血痕.  DNA の抽出と抽出量の比較

各種法科学的試料から QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, GmbH, Germany)を用いて DNA を抽

出した.基本的な抽出手順は添付のプロトコール8)

に従った.一部の試料について,対照としてフェ

ノール・クロロホルム法による抽出9)を行った.各

抽出条件で最低 3 回抽出実験を行った.血液,爪, 体液斑から抽出された DNA 溶液は紫外分光光度計 DU640 (Beckman Instruments)にて吸光度を測定 し,WarburgChristian の計算式を用いて DNA 濃 度を求めた.AE 緩衝液溶出液では AE 緩衝液を滅 菌水溶出液では滅菌水をブランクとして使用した. 血痕,骨から得られた DNA 溶液は,吸光度測定を

行 わ ず , AmpFL STR Proˆler kit ( Applide

Biosystems, Foster City, USA)による型検査を行っ た.3 回の実験の平均値から,各抽出条件における DNA 量をピークの相対強度(RFU)を基に比較し た10).さらに,死後 3~5 年経過骨から得た DNA を用いてミトコンドリア SNPs のマルチ検査法11) よる型検査を行い,バンド強度より抽出 DNA 量を 推定した.  血液,爪,体液斑からの DNA 抽出 血液200 ml から DNA を抽出した.爪 5 mg に 2M DTT 溶 液 20 ml を 加 え て 56 °C 30 分 間 加 熱 後12) ATL 緩衝液を加えて抽出を行った.約 2 cm2の精 液膣液混合斑は,二段階細胞融解法13)を用いて膣細 胞画分と精子画分に分離後抽出を行った.DNA の 溶出は AE 緩衝液200 ml を用いて行った.約 2 cm2 の唾液斑は,滅菌水600 ml を用いて溶出,あるいは 滅菌水200 ml で 2 回ないし 3 回繰り返し溶出を行っ た.試料なしの滅菌水を用いて同様の抽出を行っ た . 溶 出 液 へ の 混 入 が 考 え ら れ る エ タ ノ ー ル , EDTA 水溶液,AE 緩衝液について滅菌水をブラン クとして吸光度を測定した.  血痕からの DNA 抽出 血液 1 ml で作製した血痕から DNA を抽出した. AE 緩衝液およ び滅菌水200ml(50 ml× 4 回)で溶 出,あるいは50 ml で 2 回ないし 4 回繰り返し溶出 を行った.得られた溶出液は遠心乾燥機を用いて1 時間乾燥したのち15 ml の滅菌水に再溶解した.血 液0.1 ml で作製した血痕からの DNA 抽出では,AE 緩衝液および滅菌水を50 ml, 150 ml, 450 ml, 900 ml 用 いて溶出を行った.また,タンパク質分解までを 1  SDS 添加 TNE 溶液中でプロテネース K を用い て行ったものについて同様に DNA を抽出した.フ ェノール・クロロホルム法による抽出も行った.得 られた溶出液は液量が450 ml になるように調整し, エタノール沈殿したのち15 ml の滅菌水に再溶解し た.  骨からの DNA 抽出 死後 1~2 年と推定されるヒト大腿骨を流水で良 く洗浄した後,室温で乾燥したものの表面を軽く削 り取り,粉砕した緻密質0.5 g を用いて DNA を抽 出した.0.5 M EDTA (pH 8.0) 10 ml を加えて 4°C 1 晩脱灰処理後,10 ml の滅菌水で 4 回洗浄したも のと洗浄を行わなかったものについて,プロテネー ス K 20 mg を含む 1 SDS 添加 TNE 溶液100 ml を 加 え て 56 °C 3 時 間 加 熱 し た . 得 ら れ た 液 を 等 分 し,等量の AL 緩衝液とエタノールを加えて混合 し,それぞれ 2 回に分けてカラムに吸着させた.プ ロトコールに従って洗浄を行った後,滅菌水50 ml で 4 回溶出を繰り返した後,さらに滅菌水500 ml を 用いて溶出を行った.フェノール・クロロホルム法 による抽出も行った.得られた溶出液は遠心乾燥機 を用いて乾燥するか,エタノール沈殿した後40 ml の滅菌水に再溶解した.また,フェノール・クロロ

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Table 1 The amount of DNA recovery from each forensic samples by using QIAamp DNA mini kit. Sample Quantity Elution method 260 nmads. 280 nmads. 320 nmads. 260/280 (ng/ml)DNA Yield( mg)

Blood 200ml buffer AE 200ml 1.097 0.619 0.046 1.84 45.48 9.10

nail 5 mg buffer AE 200ml 0.322 0.175 0.037 2.06 12.95 2.59

Vaginal fraction buffer AE 200ml 1.786 0.998 0.015 1.80 76.00 15.20

Sperm fraciton buffer AE 200ml 0.239 0.139 0.011 1.78 9.37 1.87

Saliva stain 2 mm2 H 2O 200ml 0.315 0.178 0.019 1.86 12.87 2.57 +H2O 200mla) 0.102 0.073 0.038 1.78 2.73 0.55 +H2O 200mlb) 0.014 0.010 0.005 1.80 0.41 0.08 Saliva stain 2 mm2 H 2O 200ml×2c) 0.361 0.221 0.056 1.85 13.35 2.67 +H2O 200mla) 0.033 0.022 0.009 1.87 1.04 0.21 Saliva stain 2 mm2 H 2O 200ml×3d) 0.399 0.254 0.061 1.75 14.32 2.86 H2O 200ml H2O 200ml 0.020 0.016 0.011 1.99 0.40 0.08 +H2O 200mla) 0.071 0.061 0.046 1.69 1.07 0.21 +H2O 200mlb) 0.055 0.047 0.035 1.69 0.82 0.16 H2O 200ml H2O 200ml×2c) 0.034 0.028 0.020 1.87 0.60 0.12 +H2O 200mla) 0.043 0.037 0.027 1.70 0.67 0.13 H2O 200ml H2O 200ml×3d) 0.037 0.029 0.021 1.94 0.70 0.14 ― 3 Ethanol+H2O -0.002 -0.003 -0.003 2.62 0.05 0.01 ― 10 mM EDTA+H2O 0.145 0.002 0.001 137.96 9.03 1.81 ― buŠer AE 0.023 0.008 0.001 3.09 1.10 0.22

a) A second elution with a further 200ml water. b) A third elution with a further 200ml water. c) A 200ml water was twice applied to the column. d) A 200ml water was thrice applied to the column. ホルム法による抽出液20 ml に滅菌水を加えて400 ml にしたものを Microcon 50 (MILIPORE, Bedford,

USA)で処理して濃縮液20ml を得た.死後 3~5 年 と推定されるヒト上腕骨を前記手順で脱灰処理した のち滅菌水で 3 回洗浄し,プロテネース K 20 mg を 含む 1 SDS 添加 TNE 溶液100 ml を加えて56°C一 晩加熱した.溶解液200 ml および 1 ml から滅菌水 400ml を用い て DNA を溶 出した .溶解 液 1 ml を 用いてフェノール・クロロホルム法による抽出を行 った.抽出液はエタノール沈殿した後40 ml の滅菌 水に再溶解した.この DNA 溶液20 ml に滅菌水を 加 え て 400 ml に し た も の を Microcon YM 10

(MILIPORE, Bedford, USA)で処理して濃縮液20 ml を得た.  各種血痕付着担体からの DNA 抽出 い草畳を除いた血痕付着担体からの DNA 抽出 は,プロトコール8)どおりに 1 時間酵素処理を行っ た後,溶解液と担体を分離して行った.カラムから 滅 菌 水 50 ml で 3 回 溶 出 を 繰 り 返 し た 後 , さ ら に AE 緩衝液400ml を用いて溶出を行った.得られた 溶出液は遠心乾燥機を用いて乾燥,あるいはエタ ノール沈殿した後15 ml の滅菌水に再溶解した.フ ェノール・クロロホルム法による抽出も行った.こ の DNA 溶液 5 ml に滅菌水を加えて500 ml にしたも のを Microcon 50で処理して濃縮液 5 ml を得た.さ らに,フェノール・クロロホルム法による抽出液を 滅菌水で30倍に希釈して吸光度を測定し,見かけ上 の DNA 濃度を求めた.

 血液,爪,体液斑からの DNA 抽出 キットを用いて,血液,爪,精液膣液混合斑痕, 唾液斑痕から数 mg~十数 mg の精製 DNA を得るこ とができた.得られた DNA の A260/A280は1.75~

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Table 2 The amount of DNA recovery from bloodstain by using QIAamp DNA mini kit.

Sample Quantity Elution method

Relative Fluorescence Units Amount of template DNA

1ml 3ml 9ml

Blood stain 1ml buŠer AE 50ml 8502100 2350<a) NDb)

+buffer AE 50 ml 12002050 1850< 01000

+buŠer AE 50 ml 10502100 13504100 NDb)

+buŠer AE50 ml 400800 10002150 NDb)

Blood stain 1ml buffer AE 50ml×2 3000< 2450< 05500

+buŠer AE 50 ml×2 16502850 1750< NDb)

Blood stain 1ml buŠer AE 50ml×4 2850< 2450< 06000

Blood stain 1ml H2O 50ml 10002350 2650< 3350< +H2O 50ml 16503350 3050< 3550< +H2O 50ml 17503350 16505200 3150< +H2O 50ml 6001350 16502950 2850< Blood stain 1ml H2O 50ml×2 19504000 2950< 3150< +H2O 50ml×2 16503250 3350< 2450< Blood stain 1ml H2O 50ml×4 2650< 3450< 3050<

The extracted DNA solution was concentrated to 15ml by evaporation. These were average values from 3 samples.

a) The smallest peak was 2350 RFU and the biggest peak was over 6000 RFU. b) Not detected. 2.06で,膣細胞画分から最大15.2mg の DNA が得 られた(Table 1).唾液斑においてカラムから滅菌 水200 ml で溶出した後,更に滅菌水200 ml を加えて 溶出すると約20 DNA 収量が増加した.試料なし の 滅 菌 水 か ら 抽 出 し た 液 の 吸 光 度 を 測 定 す る と A260/A280 1.69~1.99の DNA が80~210 ng 得られ た よ う に 算 出 さ れ た ( Table 1 ). エ タ ノ ー ル , EDTA 水溶液,AE 緩衝液は,いずれも260 nm 以 下の短波長側に紫外吸収があり,A260/A280の値 が2.0を大きく上まわった.  血痕からの DNA 抽出 血 液 1 ml で 作 製 し た 血 痕 か ら キ ッ ト を 用 い て DNA を抽出すると,AE 緩衝液でも滅菌水でも合 計150 ml 溶出するまで DNA 量は直線的に増加した が,更に50 ml の溶出で得られた DNA 量は,それ までの半分以下に減少した(Table 2).50 ml の滅 菌水で複数回溶出する方法では,2 回繰り返し溶出 した後も相当量の DNA がカラム中に残存してお り,特に滅菌水では 4 回繰り返し溶出することで最 大量の DNA を回収することができた(Table 2). 滅菌水で溶出した DNA 溶液は,遠心乾燥して15 ml に濃縮したうち10 ml を用いても PCR 阻害は認めら れなかったが,AE 緩衝液で溶出した方には明らか な PCR 阻害が認められ,あたかも鋳型 DNA の分 解が生じたかの様に高分子領域のピーク高が減少し た.血液0.1 ml で作製した血痕からの DNA 抽出で は , 1  SDS 添 加 TNE 溶 液 で 溶 解 後 に フ ェ ノ ー ル・クロロホルム法を用いて得られた DNA 収量が 最大であり,キットの約1.5倍であった.キットで は,溶出液が AE 緩衝液でも滅菌水でも,合計溶出 量450 ml で DNA 収量が最大になり,更に450 ml で 溶出すると10~30 DNA 収量が増加した(Table 3).AE 緩衝液で溶出した液をエタノール沈殿して 15ml に濃縮したうち10 ml を用いても PCR 阻害は 認められなかった.ATL 緩衝液を用いて溶解後フ ェノール・クロロホルム法を用いて DNA 抽出を行 うと,エタノール沈殿時に大量の白色沈殿物が生 じ,滅菌水で再溶解した溶液を用いても PCR 増幅 産物は全く得られなかった.

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Table 3 The amount of DNA recovery from bloodstain by using QIAamp DNA mini kit.

Sample Quantity Solvent buŠer Extraction method

Relative Fluorescence Units Amount of template DNA

3ml 10ml

Blood stain 0.1ml buŠer AL+PK buŠer AE 50ml ND 30160

Blood stain 0.1ml buŠer AL+PK buŠer AE 150ml ND 60260

Blood stain 0.1ml buŠer AL+PK buŠer AE 450ml 80320 190600

+buŠer AE 450 ml ND 50160

Blood stain 0.1ml buŠer AL+PK H2O 50ml ND 190420

Blood stain 0.1ml buŠer AL+PK H2O 150ml 60160 320700

Blood stain 0.1ml buŠer AL+PK H2O 450ml 140360 6401400

+H2O 450ml ND 50160

Blood stain 0.1ml buŠer AL+PK PhenolChloroform ND ND

Blood stain 0.1ml TNE+SDS+PK buŠer AE 50ml ND 30160

Blood stain 0.1ml TNE+SDS+PK buŠer AE 150ml ND 40200

Blood stain 0.1ml TNE+SDS+PK buŠer AE 450ml 80160 160320

+buŠer AE 450 ml ND 50160

Blood stain 0.1ml TNE+SDS+PK H2O 50ml ND 90200

Blood stain 0.1ml TNE+SDS+PK H2O 150ml 60160 120300

Blood stain 0.1ml TNE+SDS+PK H2O 450ml 120400 320700

+H2O 450ml ND ND

Blood stain 0.1ml TNE+SDS+PK PhenolChloroform 160640 7001900

The extracted DNA solution was concentrated to 15ml by ethanol precipitation. These were average values from 3 samples

 骨からの DNA 抽出 EDTA で脱灰した骨に,洗浄なしでプロテネー ス K を作用すると骨の溶解が遅く 3 時間以上かか ったが,滅菌水で洗浄したものは10分で完全に溶解 した.緻密質0.5 g から約 1 ml の溶解液が得られ, 等量の AL 緩衝液とエタノールを加えて約 3 ml に なった.この溶液を 2 本のカラムに,それぞれ 2 回 吸着させた(1 回で750 ml 処理した).カラムに50 ml の滅菌水を 4 回繰り返し通して溶出した後,更 に500 ml の AE 緩衝液で溶出すると約15~20相当 の DNA が得られた.脱灰後に滅菌水で洗浄した試 料から PCR 増幅産物が得られたが,洗浄しなかっ た 試 料 か ら は 得 ら れ な か っ た ( Table 4 ). 更 に Microcon で処理しても PCR 増幅産物は得られな かった.3~5 年経過した骨からは,いずれの抽出 方法でも TH01 の10-1に相当するピークのみが得ら れ,その他のローカスでは150RFU 以上のピークは 認められなかった(Table 4).この DNA 抽出液を 用いてミトコンドリア SNPs のマルチ検査を行った ところ,0.5 ml ではフェノール・クロロホルム法で 抽出後に Microcon YM10で処理したものから最も 強いバンドが得られたが,1.5 ml ではキットによる 抽出液からのみバンドが得られた(Fig. 1).  各種血痕付着担体からの DNA 抽出 血痕付着担体のうち,い草畳は ATL 緩衝液180 ml を加えて70°C10分間加熱中に液がい草内に取り 込まれて消失したため,ATL 緩衝液360 ml ,プロ テネース K 40 ml を用いて酵素反応を行った.酵素 処理後担体を除去すると約200 ml の溶解液が得られ た . 得 ら れ た DNA 溶 液 15 ml 中 0.2 ml を 用 い た と き,フェノール・クロロホルム法によるピーク強度 が 最 も 大 き く , キ ッ ト の 約 1.5 ~ 2.5 倍 で あ っ た (Table 5).キットでは,滅菌水50 ml で 3 回繰り返 し溶出した後も相当量の DNA がカラム中に残存し ており,更に400 ml の AE 緩衝液で溶出すると約15 ~40相当の DNA が得られた.キットで抽出した

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Table 4 The amount of DNA recovery from bone by using QIAamp DNA mini kit.

Sample Washing SolutionVolume Extracitonmethod Concentration VolumeFinal RFU

c) 10ml Bone (12 years ago)H2O 10 ml×4 a) 1 ml H 2O 50ml×4 Evaporation 40ml 150780 +H2O 500ml Ethanol precipitation 40ml ND Bone (12) H2O 10 ml×4a) 1 ml Phenol

Chloroform Ethanolprecipitation 40ml 80510

Bone (12) ― 1 ml H2O 50ml×4 Evaporation 40ml ND

+H2O 500ml Ethanol

precipitation 40ml ND

Bone (12) ― 1 ml Phenol

Chloroform Ethanolprecipitation 40ml ND

+Microcon 50 20 ml ND Bone (35) H2O 10 ml×3b) 0.2 ml H2O 400ml Ethanol precipitatio 40ml TH0110-1only 180 Bone (35) H2O 10 ml×3b) 1 ml H2O 400ml Ethanol precipitation 40ml TH0110-1only 420 Bone (35) H2O 10 ml×3b) 1 ml Phenol

Chloroform Ethanolprecipitation 40ml TH0110-1only 520 +Microcon

YM10 20ml TH0110-1only 360

These were average values from 3 samples.

a) The decalciˆed bone was washed for four times with water. b) The decalciˆed bone was washed for three times with water. c) Relative Fluorescence Units.

Fig. 1 PCR ampliˆcations on mitochondrial SNPs with extracted DNA from bone. Lans 14; template DNA 1.5 ml, lans 58; template DNA 0.5 ml.

Lanes 1, 5; extracted DNA from 200ml bone solution with QIAamp DNA mini kit. Lanes 2, 6; extracted DNA from 1 ml bone solution with QIAamp DNA mini kit. Lanes 3, 7; PhenolChloroform extraction.

Lanes 4, 8; PhenolChloroform extraction and Microcon YM10 treatment. Lane M1; size marker (BioMarker Low, BioVentures).

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Table 5 EŠect of substrata on DNA typing by PCR ampliˆcation from bloodstains.

Substratuma) Extraction method Concentration

Relative Fluorescence Units Amount of template DNA

0.2ml 1ml 5ml

Blue denim H2O 50ml×3 Evaporation 1501600 8006000 1900<

+buŠer AE 400 ml Ethanol precipitation 70290 3501650 1650<

Wool H2O 50ml×3 Evaporation 4002400 1850< 3150<

+buŠer AE 400 ml Ethanol precipitation 1701020 9503550 2700<

Mixed spinning H2O 50ml×3 Evaporation 3002400 1850< 2850<

+buŠer AE 400 ml Ethanol precipitation 170650 6002500 2700<

Tatami (rush) H2O 50ml×3 Evaporation 250900 12506000 2850<

+buŠer AE 400 ml Ethanol precipitation 70340 2701350 19005450

Wood (paulownia) H2O 50ml×3 Evaporation 6503050 2550< 3150<

+buŠer AE 400 ml Ethanol precipitation 170780 9003600 2700<

Wood (chopstick) H2O 50ml×3 Evaporation 5503050 2350< 3000<

+buŠer AE 400 ml Ethanol precipitation 70490 5502200 2700<

Blue denim PhenolChloroform Ethanol precipitation 7003700 ND ND

+Microcon 50 ― ― ND

Wool PhenolChloroform Ethanol precipitation 16506000 3550< 150<

+Microcon 50 ― ― 1950<

Mixed spinning PhenolChloroform Ethanol precipitation 9004200 2950< 3200<

+Microcon 50 ― ― 3800<

Tatami (rush) PhenolChloroform Ethanol precipitation 2004200 ND ND

+Microcon 50 ― ― ND

Wood (paulownia) PhenolChloroform Ethanol precipitation 8004000 14506000 ND

+Microcon 50 ― ― 0<

Wood (chopstick) PhenolChloroform Ethanol precipitation 8004800 2550< 2600<

+Microcon 50 ― ― 2050<

These were average values from 3 samples.

The ˆnal volume of extracted DNA solution is 15ml. a) Every substratum was stained with 2ml of blood.

DNA 溶液 5ml を用いても PCR 阻害は認められな か っ た が , フ ェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム 抽 出 し た DNA 溶液 1ml 用いても PCR 阻害を示すものがあ り,5 ml 用いると混紡,割り箸以外のすべての担体 で PCR 阻害が認められた(Table 5).この DNA 溶液を Microcon で処理すると,羊毛で PCR 阻害 が若干回復したが,ブルージーンズ,い草畳,桐板 では PCR 阻害が改善されなかった.フェノール・ クロロホルム法による抽出液の吸光度を測定した結 果 , A260/ A280 1.27 ~ 1.82 の DNA が 0.51 ~ 12.4mg 得られたように算出された(Table 6).

ハンドブック14)によれば,QIAamp DNA mini kit

は各種体液,体液斑,培養細胞,軟組織から効率よ く純度の高い DNA を抽出できるとある.また,こ のキットは毛髪からの DNA 抽出にも用いられてお り,ミトコンドリア DNA 型検査における DNA 抽 出法として利用されている.今回このキットを検討 したところ,血液,血痕,唾液斑,精液膣液混合 斑 , 爪 か ら 数 mg の 精 製 DNA を 得 る こ と が で き た.得られた DNA の性状は未検討であるが,ハン ドブック14)によれば主として20~30 kb の DNA が 得られるとされる.本キットはブランクテストで得 られた溶出液にも紫外吸収が認められ,数百 ng の

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Table 6 The amount of DNA recovery with PhenolChloroform extraction method from various substrate.

Substratuma) abs. 260 nm abs. 280 nm abs. 320 nm 260/280 DNA (ng/ml) Yield ( mg)

Blue denim 0.366 0.299 0.173 1.53 7.59 3.41 Wool 0.097 0.071 0.027 1.61 2.83 1.27 Mixed spinning 0.032 0.021 0.006 1.78 1.13 0.51 Tatami (rush) 2.349 2.182 1.551 1.27 27.51 12.38 Wood (paulownia) 0.212 0.193 0.131 1.31 2.89 1.30 Wood (chopstick) 0.043 0.027 0.008 1.82 1.52 0.68

The volume of extracted DNA solution is 15ml. a) Every substratum was stained with 2ml of blood.

DNA が得られたような測定結果を示した.吸光度 測定の結果,これはエタノール,EDTA, AE 緩衝 液の混在が原因とは考えられず,グアニジン塩酸塩 もしくは他の物質の混入によるものと推測される. また,溶出液の吸光度は,エタノール沈殿や遠心乾 燥を行っても変化しなかったことから,この紫外吸 収物質を除去することは困難であると考えられる. 本キットは比較的多量の DNA をカラムに保持する ことができるが,保持された DNA を完全に溶出す ることは困難であると推測された.ハンドブック14) には滅菌水か AE 緩衝液200 ml を用いて溶出後,更 に AE 緩衝液200 ml で再度溶出することで DNA 収 量が15増加するとなっており,各種臓器からの抽 出例では,AE 緩衝液400 ml で溶出後に,AE 緩衝 液200 ml で溶出すると数 mg ~数十 mg の DNA が得 られると記載されている.また,DNA が 1 mg 以下 の場合,AE 緩衝液50 ml で溶出すると DNA 収量は 若 干 減 る が 高 濃 度 の DNA 溶 液 が 得 ら れ る と あ る14).本実験では50 ml の溶出で得られる DNA 量 は200 ml で得られる量の約20~30にすぎなかっ た.また,微量血痕からの抽出では,大量の液で溶 出した方が DNA の回収率が良く,50 ml の溶出で は最大収量の僅か10~20しか DNA を回収できな かった.更に,溶出液900 ml で得られた DNA 量は フェノール・クロロホルム法による収量の約60~70 程度であり15),DNA の回収率はフェノール・ク ロロホルム法や DNA エキストラクター FM キット (和光純薬,大阪)より低いものと考えられた16).し かし,骨からの DNA 抽出では,キットの方がフェ ノール・クロロホルム法よりも多くの PCR 産物を 与えた.通常,骨などの硬組織から DNA を抽出す るとき EDTA による脱灰処理を行う1719)が,フェ ノール・クロロホルム法では EDTA を除去できな いため,DNA 抽出液中に混在する EDTA が PCR 反応を阻害する17).キットに添付してある ATL 緩 衝液は EDTA を含有しているが,滅菌水でカラム から溶出した DNA を濃縮して用いても PCR 反応 は阻害されなかった.従って,キットによる抽出で は EDTA が混入しないものと考えられる.また, フェノール・クロロホルム法による抽出 DNA を Microcon 50で処理すると EDTA は除去されるはず だが,PCR 阻害は改善しなかった.これらの結果 から,骨から抽出した DNA には EDTA 以外の妨 害物質が混在している可能性が示唆される18,19).一 方,キットで抽出した DNA には PCR 阻害が認め られなかった.キット抽出では混入する阻害物質の 量を低く抑えられるものと考えられる.3~5 年経 過骨から得られた DNA では AmpFL STR Proˆler kit による型判定はできなかった.しかし,ミトコ ンドリア SNPs のマルチ検査法11)では,いずれの抽 出法でもバンドが得られた.この検査法の検出限界 は約10 pg なので,数百 pg~数 ng 程度の DNA が 得られたことになる.また,この検査法で得られる バンドは,いずれも100 bp 以下なので,分解 DNA が抽出された可能性も考えられる.この検査法で最 も強いバンドが得られたのは,フェノール・クロロ ホルム法による抽出 DNA を Microcon YM10で処 理したものであったが,使用する DNA 量を 3 倍に すると PCR 阻害が起こってバンド強度が低下し

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BSA を用いないため,PCR 阻害に敏感であると考 えられる.従って,フェノール・クロロホルム法に よる抽出 DNA は,キットを用いたものより阻害物 質を多く含んでいるものと推察される.この結果 は,各種血痕付着担体からの DNA 抽出において, より明確になった.今回検討した担体は,坂井らの 報告1)で影響が認められたものであり,実際にフェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム 法 で 抽 出 し た DNA で は PCR 阻害が多くみられ,Microcon 50で処理しても 殆どの場合阻害が回復することはなかった.しか し,キットで抽出した DNA を用いると全く PCR 阻害がみられなかった.但し,AE 緩衝液でカラム から溶出した DNA 溶液を10 ml 以上使用すると, 鋳型 DNA の分解が生じた時のように高分子ピーク が減少したフェログラムが得られるので注意が必要 である.

以上の結果より,QIAamp DNA mini kit はフェ ノール・クロロホルム法と比べて,得られる DNA 収量は若干少ないが,より純度の高い DNA を得る ことができると考えられる.従って,数 mg の抽出 DNA が得られる場合,プロトコールに従って抽出 を行い分光光度計による吸光度より DNA 量を推定 して型判定を行うことが可能であることが示唆され た.ただし,得られた抽出 DNA が少ない場合,カ ラムから DNA を溶出する際には,滅菌水50 ml で 3, 4 回溶出操作を繰り返した液を遠心乾燥するか, AE 緩衝液500ml で溶出した液をエタノール沈殿し て濃縮することが必要であり,また,抽出液には紫 外吸収物質が混在しているため,分光光度計による 測定は意味をなさない可能性がある.実際,PCR 阻害を生じる担体からフェノール・クロロホルム抽 出したものの多くは,260 nm に強い吸収を持つこ とから,吸光度より DNA 量を推定することは困難 であると考えられる.また,骨 1 g 以上から抽出を 行 う 場 合 , 液 量 が 多 く な る の で QIAamp DNA

Blood midi kit (QIAGEN)を用いた方が良い結果 を得られるかもしれない.

本研究で,これまでフェノール・クロロホルム抽 出では型判定困難であった,い草畳や木に付着した 血痕および陳旧骨から,高純度の DNA を抽出する ことができた.しかし,今回の検討は,主として

AmpFL STR Proˆler kit を用いた評価であった.こ

の kit は高感度で,比較的 PCR 阻害に強く20),増

幅産物のサイズが350 bp 以下と低分子 DNA をター ゲットとしている.従って,DNA 検査法を変更し た場合,必ずしも今回と同じ結果が得られるとは限 らない.しかし,一般的な DNA 型検査における DNA 抽出法として QIAamp DNA mini kit は非常 に有用であると考えられる.

まとめ

QIAamp DNA mini kit とフェノール・クロロホ ルム法による法科学的試料からの DNA 抽出を比較 したところ, 1 キットで抽出した DNA には紫外吸収物質が含 まれており,得られた DNA 量が少ない場合,分光 光度計による濃度測定は困難であった. 2 微少な試料から DNA を抽出する場合,キット の プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て 抽 出 を 行 っ て も 少 量 の DNA しか得られず,溶離液をカラムに 3, 4 回繰り 返して通すことで,高濃度の DNA 溶液を得ること ができた. 3 PCR 阻害のため,これまでフェノール・クロロ ホルム抽出では型判定困難であった,い草畳や木に 付着した血痕および陳旧骨から,キットを用いて抽 出した DNA は PCR 阻害を示さなかった.

1) 坂井活子,笠井賢太郎,吉田日南子,水野な つ子,関口和正,佐藤元,瀬田季茂血痕付着 担体および汚染物質の MCT118 座位 DNA 型検 出に及ぼす影響に関する実験的研究.科警研報 告,46, 129134 (1993).

2) Scherczinger, C. A., Bourke, M. T., Ladd, C. and Lee, H. C.: DNA extraction from liquid blood using QIAamp. J. Forensic Sci., 42, 893 896 (1997).

3) Flahaut, M., Sanglard, D., Monod, M., Bille, J. and Rossier, M.: Rapid detection of Candida albicans in clinical samples by DNA ampliˆcation of common regions from C. albicans-secreted aspartic proteinase genes. Clin. Microbiol., 36,

(10)

395401 (1998).

4) Rabodonirina, M., Cotte, L., Boibieux, A., Kaiser, K., Mayencon, M., RaŠenot, D., Trepo, C., Peyramond, D. and Picot, S.: Detection of Pneumocystis carinii DNA in blood specimens from human immunodeˆciency virus-infected patients by nested PCR.J. Clin. Microbiol., 37, 127131 (1999).

5) Dodel, R. C., Bales, K. R., Farlow, M. R., Gasser, T., Paul, S. M. and Du, Y.: Rapid detec-tion of a pentanucleotide deledetec-tion polymorphism in the human alpha2macroglobulin gene. Clin. Chem., 45, 307 (1999).

6) Wickham, C. L., Boyce, M., Joyner, M. V., Sarsˆeld, P., Wilkins, B. S., Jones, D. B. and El-lard, S.: Ampliˆcation of PCR products in excess of 600 base pairs using DNA extracted from

decal-ciˆed, para‹n-wax-embedded bone marrow

trephine biopsies.J. Clin. Pathol. Mol. Pathol., 53, 1923 (2000).

7) Sozzi, G., Conte, D., Mariani, L., Lo Vullo, S., Roz, L., Lombardo, C., Pierotti, M. A. and Tavecchio, L.: Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. Cancer Res., 61, 4675 4678 (2001).

8) QIAamp DNA Mini Kit と QIAamp DNA

Blood Mini Kit プロトコールとトラブルシュー ティング,QIAGEN Inc. (2001).

9) 坂井活子,吉田日南子,笠井賢太郎,向山明

孝血痕からの DNA 精製法とシングルローカ ス VNTR を用いた DNA 型検出方法について. 科警研報告,44, 3649 (1991).

10) Applied Biosystems.: AmpFlSTR ProˆlerTM

PCR Ampliˆcation Kit User's manual. P/N 402945 (1997). 11) 渡辺剛太郎,梅津和夫,大澤資樹,田中雅 嗣APLP 法を用いたミトコンドリア DNA に おける SNPs のハプロタイプ型判定.鑑識科学 (別冊),6, 75 (2001). 12) 兼 正晃,山本好男,牛山郁子,西村明儒, 西 克治溶解した爪からの DNA 抽出とその 増 幅 効 率 に つ い て . DNA 多 型 , 8, 260 263 (2000).

13) Yoshida, K., Sekiguchi, K., Mizuno, N., Kasai, K., Sakai, I., Sato, H. and Seta, S.: The modiˆed method of two-step diŠerential extraction of sperm and vaginal epithelial cell DNA from vagi-nal ‰uid mixed with sermen.Forensic Sci. Int., 72, 2533 (1995).

14) QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA

Blood Mini Kit Handbook, QIAGEN Inc. (2001). 15) 関口和正,笠井賢太郎,佐藤 元血痕から の DNA 抽出における各種 DNA 精製キットの 評価.科警研報告,51, 113119 (1998). 16) 瀬尾泰久DNA エキストラクター FM キッ トの評価.和光純薬時報,71, 811 (2003). 17) Hochmeister, M. N., Budowle, B., Borer, U.

V., Eggmann, U., Comey, C. T. and Dirnhofer, R.: Typing of deoxyribonucleic acid (DNA) ex-tracted from compact bone from human remains. J. Forensic Sci., 36, 16491661 (1991).

18) Evison, M. P., Smillie, D. M. and Chamber-lain, A. T.: Extraction of single-copy nuclear DNA from forensic specimens with a variety of postmortem histories.J. Forensic Sci., 42, 1032 1038 (1997). 19) 今泉和彦,松田秀明,窪田聡,宮坂祥夫,吉 野峰生骨試料の DNA タイピングにおける脱 灰処理およびグラスビーズ処理の効果.科警研 報告,51, 6170 (1998). 20) 渡辺剛太郎,梅津和夫,湯浅勲,鵜殿俊史,

大 澤 資 樹  AmpFlSTR Proˆler Kit に よ る 法 医 学的試料からの DNA 型判定の検討.法医学の 実際と研究,43, 5360 (2000).

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参照

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