Title
PLD activation in Chinese hamster ovary (CHO) cells transfected
with PGF2α receptor cDNA( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
, 波
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第334号
Issue Date
1997-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14800
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏名 (本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 別
波(中華人民共和国)
博
士(医学)
甲第 334号
平成 9 年 3 月 25 日学位規則第4条第1項該当
PLD8Ctivationin Chinese hamster ov8ry(CHO)ce‖s tran$fected with PGF2c(reCePtOr CDNA
(主査)教授
野
澤義
則 (副査)教授 森 秀 樹 教授 植 松 俊彦
輸 文 内 容 の 要 旨 細胞情報伝達システムにおいて,GTP結合蛋白質共役型およびチロシンキナーゼ連係型受容体の活性化に伴っ て,諸種のセカンドメッセンジャーが産生され,それらの標的分子を介して下流シグナルのmitogen-aCtivated protein kinase(MAPK)の活性化をもたらす｡これらのシグナル発生において,生体膜脂質は情報変換素子 として重要な役割を果たし,さまざまな変換ホスホリパーゼが最近明らかにされている｡その中で,ホスホリパー ゼD(PLD)は,かつて植物酵素として扱われていたが,最初の発見から40数年を経た今E]では種々ゐ動物細胞 の刺激応答におけるPLDの活性化が確認されており,本酵素は情報伝達酵素の重要な一員として位置づけられ ている｡PLD活性化により生体膜の主要成分のホスファチジルコリン(PC)が分解され,ホスファチジン酸 (PA)が生じ,またPAホスホヒドロラーゼによってジアシルグリセロール(DAG)が生成され.両者ともにセ カンドメッセンジャーとして作用する｡ PLDは不安定酵素であるために精製が困難であり.活性調節機構および細胞機能の解明の大きな支障となっ ていた｡最近FrohmanらによってヒトPLD遺伝子(hPLDl)がクローニングされ,われわれの研究室でスプラ イス変異のhPLDlbが見つけられ,分子遺伝学的手法からの解析が急速に進展している｡ところで,PLD活性化 の主要因子としては,低分子皇GTP結合蛋白質(Arf,Rho,Racl,Cdc42,Ral),プロテインキナーゼC(PKC), プロテインチロシンキナーゼ(PTK),不飽和脂肪酸,Ca2+などがある｡活性化機構から,Arf型PLDと不飽和 脂肪酸型PLDとに区別されているが,前者には少なくとも3つのアイソザイムが存在する｡ そこで,申請者はG蛋白質共役型受容体の活性化におけるPLD活性調節機構を調べるために.細胞膜7回貫通型のプロスタグランディンF2α(PGF2α)受容休の遺伝子導入により,受容体を過剰発現させキCHO
(Chinese hamsterovarycells)細胞,CHO･PGF2a･R細胞を用いて解析した｡ 実験方法 1)PLD活性の測定:PLD活性化の指標としてブタノール存在下でのPLDのtransphosphatidylationによって 生成する特異的リン脂質,ホスフTチジルブタノール(PBut)を測定した｡すなわち,[3H]パルミチン酸標識 CHO-PGF2a-R細胞を0.3%ブタノール存在下でPGF2a刺激し,抽出脂質を薄層クロマトグラフィー(TLC) によって分画し.[8H]PButの放射活性を測定した｡ 2)PI･PLCの測定:[きH]イノシトール標識細胞のPGF2a刺激による[8H]イノシトールリン酸(inositol phosphates)の産生を指標としてPI-PLCの活性化を測定した｡ 3)プロテインキナーゼC(PKC)アイソザイムのウェスタンプロット分析:CHO･PGF2a･R細胞を1%Trito nX･100で可溶化し,SDS-ポリアクリルアミド電気泳動によって蛋白質を分画し,各種抗PKC抗体を用いてイム ノブロットで検出した｡ 結果および考察 1)PGF2a刺激の細胞では初期の急速な[3H]PBut産生の上昇がみられた｡CHO-PGF2a･R細胞をADPリ ボシル化により3量体GTP結合蛋白質のGi.Goを阻害する百日咳毒素(PTX)で前処理しておいても,PGF2a 刺激によるPLDの活性化は抑制されず,本細胞についてすでに報告されているように,PI-PLCに共役するGqが一25-関与していることが示唆された｡ 2)CHO-PGF2a-R細胞をCa2十-free buffer中でインキエペp卜したり,あるいはEGTAで細胞外Ca2十をキレー トすると,PGF2a刺激による[3H]PButの産生は約50%抑制され,PGF2aによるPLDの活性化には細胞外 Ca2十を必要とすることが示唆された｡しかし,4β-phorbol12-myristate13-aCetate(PMA)によるPButの 産生は,細胞外Ca2+の有無で影響されなかった｡ 3)PKCの活性化剤であるPMAの短時間処理(100nM,10min)によりPLD活性は上昇したが.PKC阻害剤 (Ro3l-8425,CalphostinC)の前処動こよってPGF2aによるPLDの活性化はほぼ半減した｡また,PMAと PGF2aの同時刺激によるPLDの活性化は相乗的に上昇した｡これらの結果より.PGF2a受容体を介するPLD の活性化には,PKC依存性と非依存性経路の存在が示された｡ 4)PKC依存性経路によるPLD活性化機構をさらに確めるために,PMA長時間処理によってPKCをdown-regulationさせたCHO-PGF2a-R細胞についてPLD活性化とPKCアイソザイムの変化をウエスタンプロットで 検討した結果,a型PKCの特異的な減少とともにPLDの活性化が著しく抑制された｡したがって,PKCaが PGF2a受容体を介するPLD活性化に重要な因子として作用していることが示された｡ 5)PGF2a刺激で誘起されるPI-PLCの活性化による[Ca2+]i上昇とDG産生が,PKCaの活性化をもたらし, その下流シグナル分子のPLDを活性化すると推測された｡ 6)CHO-PGF2a-R細胞はPGF2a刺激により,MAPキナpゼ(42kDa/44kDa)の活性化に伴うチロシンリ ン酸化が起こるが,プロテインチロシンキナーゼ(PTK)の阻害剤であるgenisteinあるいはherbimycin Aで MAPキナーゼのチロシンリン酸化は著しく抑制された｡なお,この条件下でPLD活性化を調べたところ,これ らのPTK阻害剤による影響が見られないことから,PLDはMAPキナーゼの下流には位置しないことが示唆され た｡ 以上の結果から,PGF2a受容休遺伝子を過剰発現させたCHO細胞のPGF2a刺激によって生じるPLD活性化 には,プロテインキナーゼC(PKC)依存性と非依存性の2経路があることが示された｡また,PKCアイソザイ ムの中でa型PKCが主要な役割を果たしていることが推測された｡なお.この細胞系ではt MAPキナーゼはPL D活性化に関与していないことが示された｡PKC非依存性経路に関しては,低分子量GTP結合蛋白質(Arf, Rho,Rac,Cdc42)あるいは,ある種の特異的PTKの関与が考えられるが,今後の詳細な検討が必要とされる｡ 論文審査の結果の要旨 申請者文り波は,PGF2a受容体cDNAを過剰発現させたCHO-PGF2a-R細胞を用いて,PGF2aによるPLD活 性化機構について検討し,PGF2αによるPLD活性化にはプロテインキナーゼC(PKC)依存性および非依存性 経路が作動していることを示した｡またt 前者の経路において,α型PKCが主要因子であることを明らかにし た｡さらに,MAPキナーゼはPGF2a受容体を介するPLD活性化の上流シグナル分子としては作用していない ことが示された｡これらの結果は,新規情報変換酵素PLDの活性化機構の解明,ひいては細胞シグナル伝達の 分子メカニズムの解明に有意義な知見を提供したものと考えられる｡ [主論文公表誌]
PLD activationin Chinese hamster ovary(CHO)cells transfected with PGF2α reCeptOr CDNA
平成8年4月発行 Prostaglandins 51(4):233∼248
