Microsoft PowerPoint - è⁄ªå‰Łå„Œå‘¯è…½ã†ªGLP_GMPå¯¾å¿œéł»æ°Šæ³³å‰Łã‡·ã‡¹ã…ƒã…€ã†«ã‡‹ã‡‰ã•†AAVã…»ã…Šã…©ã‡¹ã…�ã…›ã…»mRNAã†®åﬁ†è³ªç®¡ç’ƒå¿œçﬂ¨.pptx

(1)

2021年5月25日

SCIEX

遺伝子治療用ウィルスベクター創製：

研究開発から製造・上市まで～

AAVを中心に～

自動化可能な

GLP/GMP対応電気泳動システムによる、

AAV・プラスミド・mRNAの品質管理応用

DOC-MKT11-884A

中空毛細ガラス管内の

電解液中での

自由泳動が基本

泳動電解液中の

添加物との動的会合も

分離に応用できる

キャピラリー

内径：20、50、75、100μｍ、有効長：10～50cm、

キャピラリー電気泳動（

CE）法

(2)

キャピラリー電気泳動法が、

第十四改定日本薬局方

第二追補第二部に

参考情報として収載されました!

JP

生物製剤（タンパク質医薬品）について、

特に詳しく記載されています。

ヨーロッパ薬局方（EP）では、エリスロポイエチンの多様性

試験にキャピラリー電気泳動法が採用されています。

USPでは抗体医薬品応用での収載があります。

その他の製剤への応用もあります。

キャピラリー電気泳動

in 薬局方

PA 800 Plus

生物製薬開発キャピラリー

電気泳動システム

(3)

糖鎖の有無

がポイントに

_{サイズ分離（}

_{SDS PAGE）の置換・標準化}

純度試験に応用！

ＩｇＧアッセイキット

（

SDSゲル分子量解析キットと同じ泳動系）

キャピラリーSDS ゲル電気泳動法（Beckman Coulter ＩｇＧアッセイキット）

還元状態：

L鎖、糖鎖の無いH鎖、H鎖の割合

非還元状態：内部標準ピーク以降の全ピーク面積と、IgGメインピークの割合

試料前処理（SDS変性）、システム適合性試験の記述が含まれる。

Available from Beckman Coulter as a component of test kit,

catalog number A10663, or a suitable equivalent.

Capillary : Beckman Coulter catalog number 338472 or equivalent.

(4)

ssDNA 100-Rキット

１塩基違いの分離（Poly A, 40～60 mer）

１本鎖

DNA／RNAのサイズ分離、20～100 mer

泳動ポリマー溶液の希釈により、さらに大きなサイズの分離に対応

キャピラリー電気泳動法による

遺伝子治療用ベクタ－関連応用

(5)

PA 800 Plus 遺伝子治療関連応用

遺伝子ベクター周辺の品質管理応用

プラスミド

トポロジー解析（

DNA高次構造評価）

導入遺伝子評価（2本鎖DNA サイズ分離）

AAV（アデノ随伴ウィルス）

ウィルス構成蛋白質（カプシド）解析（蛋白質サイズ分離）

導入遺伝子の有無（Full/Empty）（電荷変化解析）

導入遺伝子完全性評価（

1本鎖DNA サイズ分離）

mRNA

断片化体の純度試験（1本鎖RNA サイズ分離）

トポロジー解析

導入遺伝子評価制限酵素消化断片2本鎖DNA解析

Sciex参考テクニカルノート

PA 800 Plus 遺伝子治療関連応用

プラスミド

Sciex参考テクニカルノート

(6)

プラスミドトポロジー解析

（ベクター応用されるプラスミドの品質管理）

RE

nicking

enzyme

Liniar

DNA高次構造評価

プラスミドトポロジー解析

（ベクター応用されるプラスミドの品質管理）

Overlay of 18 runs of untreated 5 kb plasmid preparation

Separation of plasmid isoforms in a 7 kb plasmid

preparation

(7)

プラスミドトポロジー解析

（最適化、安定性及び純度試験応用）

７ kbpプラスミドの熱ストレス（40℃）による構造変化

非ストレス状態（T0）から12週間（T12）までの変化をモニタ―、 SYBR Goldによる蛍光検出

安定性試験応用

DNA高次構造評価

ΦX 174のHaeIII消化断片

a : ΦX 174構造とHaeIII切断部位

b : 消化物泳動結果

2本鎖DNA サイズプロファイル評価

制限酵素消化断片解析

（導入遺伝子

DNAの品質管理）

(8)

制限酵素消化断片解析

（導入遺伝子

DNAの品質管理）

ΦX 174のHaeIII消化断片、

リニア

pUC18dGプラスミドDNA、1 kb plus DNAラダー

2本鎖DNA サイズプロファイル評価

PA 800 Plus 遺伝子治療関連応用

AAV（アデノ随伴ウィルス）

ウィルス構成蛋白質（カプシド）解析

導入遺伝子の有無（Full/Empty）

導入遺伝子完全性評価

Sciex参考データシート

AAV Full

Capsid

AAV Empty

Capsid

AAV Partial

Capsid

AAV Full

Capsid

“Other”

(9)

AAV2、1×10

12 _GC/mL

蛋白質

SDSサイズ分離・評価

検出方法の比較

AAV8、1×10

13 _GC/mL

蛍光

UV 220 nm

(ATTO-TAG

TM

_FQ)

AAV ウィルス構成蛋白質（カプシド）解析

（プロファイリング品質管理）

AAV8、1×10

10 _GC/mL

濃度直線性

AAV8、

1X10

10 _～

_1.6X10

14 _GC/mL

蛋白質

SDSサイズ分離・評価

AAV ウィルス構成蛋白質（カプシド）解析

（プロファイリング品質管理）

(10)

AAV 導入遺伝子の有無（Full/Empty）

導入遺伝子DNAによる等電点シフトを応用

セロタイプ、導入遺伝子により異なるpI

同定／確認試験応用

pI of AAV Full Capsid

<

pI of AAV Empty Capsid

<

cIEF Separates analytes by pI (isoelectric point) values

Proprietary AAV、Empty rich vs Full rich

キャピラリー等電点電気泳動

<

4.5 kb遺伝子を含むAAV8

繰返し再現性

RSD for migration time

was < 0.5%.

AAV Full

Capsid

“Other”

Capsid

AAV Partial

Capsid

１～10 kbレベルの１本鎖RNAまたはDNA用サイズ分離

AAV 導入遺伝子の完全性評価

（DNAレベルの純度試験）

1本鎖DNA サイズ分離

(11)

AAV 導入遺伝子の完全性評価

（1本鎖DNAサイズ評価）

元のサンプルにはカプシド外の核酸も含まれる。

①

AAVカプシド外の核酸のBenzonase消化

② フィルタリングによる分離

③ カプシドの分解（Proteinase K処理）

④ 導入遺伝子DNA抽出（PCR精製キット）

以上の前処理の効果、及び迅速化のための省略も検討

1本鎖DNA サイズ分離

Intact

Genome

Partial

Genome

Small Size

Impurities

R

F

U

Fast size-based screening workflow

①→②→③→

④

AAV 導入遺伝子の完全性評価

（1本鎖DNAサイズ評価）

(12)

mRNA純度試験

今後の応用条件開発

Sciex参考テクニカルノート

PA 800 Plus 遺伝子治療関連応用

mRNA（RNAワクチン）

5’ UTR

3’ UTR

Poly A

CAP

Open Reading Flame

サイズは相当か？断片化は？

CAP check

Poly A check

RNAワクチン mRNA純度試験

断片化体を分離・存在割合を

確認

(13)

PA 800 Plus 遺伝子治療関連応用

遺伝子ベクター周辺の品質管理応用

プラスミド

トポロジー解析（

DNA高次構造評価）

導入遺伝子評価（2本鎖DNA サイズ分離）

AAV（アデノ随伴ウィルス）

ウィルス構成蛋白質（カプシド）解析（蛋白質サイズ分離）

導入遺伝子の有無（Full/Empty）（電荷変化解析）

導入遺伝子完全性評価（

1本鎖DNA サイズ分離）

mRNA

断片化体の純度試験（1本鎖RNA サイズ分離）

ご参加、有難う

ございました。

(14)

SCIEX Diagnostics products are for in vitro diagnostic use. Rx Only. Product(s)

may not be available in all countries. For information on availability, please contact

your local sales representative or refer to https://sciex.com/diagnostics. All other

SCIEX products are for research use only. Not for use in diagnostic procedures.

Trademarks and/or registered trademarks mentioned herein are the property of AB

Sciex Pte. Ltd., or their respective owners, in the United States and/or certain other

countries.

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2021年5月25日

SCIEX

遺伝子治療用ウィルスベクター創製：

研究開発から製造・上市まで～

AAVを中心に～

自動化可能な

GLP/GMP対応電気泳動システムによる、

AAV・プラスミド・mRNAの品質管理応用

中空毛細ガラス管内の

電解液中での

自由泳動が基本

泳動電解液中の

添加物との動的会合も

分離に応用できる

キャピラリー

内径：20、50、75、100μｍ、有効長：10～50cm、

キャピラリー電気泳動（

CE）法

キャピラリー電気泳動法が、

第十四改定日本薬局方

第二追補第二部に

参考情報として収載されました!

JP

生物製剤（タンパク質医薬品）について、

特に詳しく記載されています。

ヨーロッパ薬局方（EP）では、エリスロポイエチンの多様性

試験にキャピラリー電気泳動法が採用されています。

USPでは抗体医薬品応用での収載があります。

その他の製剤への応用もあります。

キャピラリー電気泳動

in 薬局方

PA 800 Plus

生物製薬開発キャピラリー

電気泳動システム

糖鎖の有無

がポイントに

サイズ分離（

SDS PAGE）の置換・標準化

純度試験に応用！

ＩｇＧアッセイキット

（

SDSゲル分子量解析キットと同じ泳動系）

キャピラリーSDS ゲル電気泳動法（Beckman Coulter ＩｇＧ アッセイキット）

還元状態 ：

L鎖、糖鎖の無いH鎖、H鎖の割合

非還元状態 ： 内部標準ピーク以降の全ピーク面積と、IgGメインピークの割合

試料前処理（SDS変性）、 システム適合性試験 の記述が含まれる。

Available from Beckman Coulter as a component of test kit,

catalog number A10663, or a suitable equivalent.

Capillary : Beckman Coulter catalog number 338472 or equivalent.

ssDNA 100-Rキット

１塩基違いの分離（Poly A, 40～60 mer）

１本鎖

DNA／RNAのサイズ分離、20～100 mer

泳動ポリマー溶液の希釈により、さらに大きなサイズの分離に対応

キャピラリー電気泳動法による

遺伝子治療用ベクタ－関連応用

PA 800 Plus 遺伝子治療関連応用

遺伝子ベクター周辺の品質管理応用

プラスミド

トポロジー解析 （

DNA高次構造評価）

導入遺伝子評価 （2本鎖DNA サイズ分離）

AAV（アデノ随伴ウィルス）

ウィルス構成蛋白質（カプシド）解析 （蛋白質 サイズ分離）

導入遺伝子の有無（Full/Empty） （電荷変化解析）

導入遺伝子完全性評価 （

1本鎖DNA サイズ分離）

mRNA

断片化体の純度試験 （1本鎖RNA サイズ分離）

トポロジー解析

導入遺伝子評価 制限酵素消化断片2本鎖DNA解析

Sciex参考テクニカルノート

PA 800 Plus 遺伝子治療関連応用

プラスミド

Sciex参考テクニカルノート

プラスミド トポロジー解析

（ベクター応用されるプラスミドの品質管理）

RE

_{サイズ分離（}

_{SDS PAGE）の置換・標準化}

キャピラリーSDS ゲル電気泳動法（Beckman Coulter ＩｇＧアッセイキット）

還元状態：

非還元状態：内部標準ピーク以降の全ピーク面積と、IgGメインピークの割合

試料前処理（SDS変性）、システム適合性試験の記述が含まれる。

トポロジー解析（

導入遺伝子評価（2本鎖DNA サイズ分離）

ウィルス構成蛋白質（カプシド）解析（蛋白質サイズ分離）

導入遺伝子の有無（Full/Empty）（電荷変化解析）

導入遺伝子完全性評価（

断片化体の純度試験（1本鎖RNA サイズ分離）

導入遺伝子評価制限酵素消化断片2本鎖DNA解析

プラスミドトポロジー解析

プラスミドトポロジー解析

プラスミドトポロジー解析

_GC/mL

_GC/mL

_FQ)

_GC/mL