Author(s)
鈴木, 敏彦
Citation
琉球医学会誌 = Ryukyu Medical Journal, 26(1・2): 9-18
Issue Date
2007
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12001/1911
Ryukyu Med. J., 26(1,2) 9-18, 2007
細菌性赤痢の病態形成における感染と宿主応答の分子機構
鈴木敏彦琉球大学医学研究科感染分子生物学講座病原因子解析学分野
Molecular mechanisms of bacterial infection and host responses for the pathology of bacillary dysentery
Toshihiko Suzuki
Division of Bacterial Pathogenesis, Department of Microbiology, Graduate School of Medicine, University of the Ryukyus, Okinawa, Japan
ABSTRACT
Shigella are highly adapted human pathogens that cause bacillary dysentery (also
referred to shigellosis). When the pathogen reaches the human colon, bacteria translocate through the epithelial barrier by way of the M Cells that overlay the soli-tary lymphoid nodules. Once it reaches the underlying M cells, Shigella infects the resi-dent macrophages and induces proinflammatory cell death with interleukin-1 β release. Meanwhile, a bacterium release from the macrophages enters enterocytes via the
basolateral surface by directing membrane ruffling and macropmocytosis. The bacte-rium is surrounded by a phagocytic vacuole; however, it immediately disrupts the mem-brane to escape into the cytoplasm, where it can multiply and move by inducing actm polymerization at one pole of the bacterium, allowing mtracellular spread within the
cytoplasm as well as into adjacent epithelial cells. The prominent pathogenic feature of Shigella is their ability to invade a variety of host cells, including epithelial cells, macrophages, and dendritic cells, which leads to severe inflammatory responses in mtes-tmal tissue. Thus, the ability of Shigella spp. to infect host cells, including the contmu-ous mtra-and intercellular spreading, is essential for leading to bacillary dysentery. Recently, our molecular and cell biological approaches to the study of linkages between the bacterial factors and host cellular hgands have shed light on the molecular basis of actin polymerization and of proinflammatory responses directed by intracellular
bacte-ria. Here, we summarize and discuss the present model for the interaction between bac-teria and host cells on Shigella infection. Ryukyu Med. J., 26(1,2) 9--18, 2007
Key words: Shigella, pathogemcity, actm polymerization, inflammation, caspase-1
はじめに 赤痢菌(Shigelld)は1897年に志賀潔博士により細菌 性赤痢の起因菌として発見された.細菌性赤痢の主な症 状は発熱,下痢,粘血便,腹痛等で特に乳幼児と高齢者 では激症化する傾向がある.現在でも発展途上国の乳幼 児を中心に年間1億人以上が罷患し,うち100万人の死 者を数え依然大きな脅威となっている1).多剤耐性菌の 増加と有効なワクチンがないことから新たな予防・治療 手段の開発が求められている2).本菌はグラム陰性菌の 一つでAID群の4亜群からなり,腸管組織侵入性大腸菌 (Enteroinvasive Escherichia coli, EIEC)と共に赤 痢を惹起する.赤痢菌とEIECは共通に180-230kbの大 プラスミドを有し,その上には主要などルレンス(病原 悼)因子がコードされている. 赤痢菌は付着因子や鞭毛がなく経口摂取により消化管 に入った菌は腸管下部で増殖しつつ大腸や直腸の孤立リ ンパ小節の円蓋部に散在するM細胞から粘膜上皮下に 侵入する3,4)菌は一旦常在マクロファージに侵入する がマクロファージ内で殺菌されずに細胞死を誘導して破
壊する5-8)マクロファージを殺した菌は固有層-は向 かわず,吸収上皮細胞に対して側底面(basolateral side)から侵入する9).菌は吸収上皮細胞内で増殖・分 裂しながら細胞質内を運動し隣接上皮細胞-感染を繰り 返す10,ll)赤痢菌が感染したマクロファージではproIL-1 βあるいはproIL-返す10,ll)赤痢菌が感染したマクロファージではproIL-18の切断が起きmature IL-返す10,ll)赤痢菌が感染したマクロファージではproIL-1およ びmature IL-18が放出される12,13)また上皮細胞では菌 から遊離されるペプチドグリカン断片が細胞内の病原体 認識分子Nodiによって認識されNF- K Bの活性化とイ ンターロイキン(ID-8の産生を促す14,15)マクロファー ジの炎症誘導性細胞死や上皮細胞からの炎症性サイトカ イン産生には菌が細胞質に侵入することが必要である. その結果感染部位の粘膜固有層に強い炎症が生じるとと もに粘膜組織にびらんや潰癌が形成され,感染の極期に は粘血性分泌物を含む下痢を生じると考えられている. すなわち本菌の病態形成の本質は宿主の激しい炎症誘導 によるものである16)この複雑な粘膜感染機構を進行さ せるために赤痢菌は多くの機能性分子(エフェクター) を分泌している.近年の研究で,エフェクターの分泌機 構およびそれらの宿主標的分子が同定され,赤痢菌によ る粘膜感染のメカニズムが明らかになりつつある17-20) 本総説では,筆者らの研究によって明らかになった細 胞内・細胞間拡散機構,細胞死誘導機構,および新しい 弱毒ワクチンの開発について紹介する.
I.アクチン重合を利用した赤痢菌の
細胞内・細胞間拡散
赤痢菌をはじめグラム陽性細菌のリステリア,細胞内 寄生細菌リケッチアあるいはある種のウイルス(ワクシニ アウイルス等)は,細胞内-侵入後細胞質内でアクチン の重合を誘導し,これを原動力として細胞質内で移動す ることが知られている.実際に赤痢菌やリステリアは細胞 -侵入後直ちにフアゴゾ-ム膜を溶解し,細胞質中-離 脱し,菌の周囲にアクチンの重合によるアクチンフィラメ ントの凝集を引き起こす.その後菌体の一極からコメッ ト状の凝集束(アクチンコメット)を形成し,細胞質中 を運動する(Fig.1 ).このアクチンコメットの形成によ り細胞質内の菌は1分間に数〃m∼数十〃mの速度で移 動が可能となる.さらに菌の一部は偽足(pseudopod) となって細胞膜から突出しこれを隣接細胞-挿入して周 囲の上皮細胞へ感染する.したがってアクチン重合によ る細胞内運動は,病原細菌やウイルスの感染病巣の拡大 に必要な機能であることが知られている21) Ⅱ.赤痢菌のアクチンコメット形成に必要な 赤痢菌のエフェクターVirG 赤痢菌によるアクチン重合には,菌の表面に発現する 外膜蛋白VirG (別名intra-and intercellular spreadFig. 1 Actin polymerization induced by lntracellular Listena monocytogenes in infected epithelial cells. Bacteria are immunostained with Listeria anti-body and FITC-labeled secondary antianti-body (A). Actin filaments are visualized by rhodamine-phalloidin ( B). Arrows indicate lntracellular bacteria with long actin
comet. Bar indicates lO 〝m.
vincuhn アV侶P ---Grycnerichrepeats shigela^BIIIwG / r ^^^^^^m N-WAS P actin polymerization
Fig. 2 Working model for VirG-induced actin polym-erization on Shigella in infected mammalian cells. The surface-exposed VirG-domam recruits vinculin and N-WASP through binding to the glycine-nch repeats of VirG. Vinculin could then interact with actm fila-ments and VASP which may contribute to actin p0-lymerization. The activity of Cdc42 facilitates the formation of the VirG-N-WASP complex, and then the
complex could achieve an activating state in which the exposed VCA domain stimulates the Arp2/3 com-plex to induce rapid actin polymerization.
A: IcsA)が必要である. virG (icsA)遺伝子は赤痢 菌の他の病原遺伝子と同様に菌の保有する230kbのビル レンスプラスミド上にコードされている VirGは 菌の分裂とともに菌体の分裂隔壁とは反対側の一極に次 第に集積し,そこからアクチンコメットが形成される23) 実際に, virG欠損株は宿主細胞に侵入するもののアク チン重合による細胞内および細胞間拡散能を失ってい る ¥ VirGは1102アミノ酸からなりそのN-末端にはシ グナル配列があり, C-末端の343アミノ酸領域で菌体の 外膜と結合している(Fig.2)23,24)中央部(α-ドメイ ン)にはグリシンに富む6つの繰り返し領域があり,こ の領域はアクチン重合に必要である(後述).またその
鈴 木 敏 彦 下流域はVirGの菌体一極発現に重要な領域がある.ち なみに赤痢菌と同様にアクチンコメットを形成するリス テリアでは, ActAと呼ばれる表面蛋白がアクチン重合 を引き起こすことが知られているがVirGとActAでは アミノ酸レベルでの類似性が全く認められない25,26) このようにVirGは宿主のアクチン重合機構に直接関 与すると考えられていたが,本蛋白によるアクチン重合 のメカニズムは全く分かっていなかった.そこで,この 分子機構の解明を目的としてVirGの菌体外分泌機構お よびVirG分子内機能領域の解析を行い,さらにVirGに 結合する宿主細胞側因子の同定を行った. m. VirGの菌体外分泌機構 VirGは, 1102個のアミノ酸で構成される外膜蛋白で, シグナルペプチド(Metl-Ala52) , 80kDaの菌体外露 出領域(Thr53-Arg758) , 37kDa外膜貫通領域(Arg 759-PhellO2)の3つの領域から構成される.まず赤痢 菌の表層発現蛋白に対してプロテアーゼによる限定分解 を行い,菌体表層におけるVirGのトポロジーについて 解析した.その結果, N-末端側706残基(α-ドメイン と命名)が表面に露出し, C-末端側344残基( β-コアと 命名)は外膜に埋もれていることを見出した(Fig. 2 )' つぎにVirGのα-ドメインが菌体外-分泌する 際にβ-コアがどのような役割を果たしているのかを調 べるために, AMPHI膜蛋白二次構造予測プログラム (AMPHI program)を用いてβ-コアを構成する344ア ミノ酸の二次構造を予測し,その構造的な特性を解析し た.その結果, 11個の両親媒性膜貫通型β鎖と4個の 膜貫通領域と思われる配列が認められたことから, Vir Gのβ-コアはβ-バレル(棒形)と呼ばれる特殊な外膜 貫通型チャンネル構造をとり,このβ-コア自身がN-末 端側のα-ドメインを菌体外-転移分泌する機能を有し ていることが示唆された.これを証明するために,大腸 菌K-12株のペリプラズム蛋白の1つマルトース結合蛋 白(MalE)をVirGβ-コアのN-末端に連結した融合蛋 白発現系を作成し, MalEの菌体表層分泌の有無を解析 した.その結果, MalEはペリプラズムから菌体表面-転移分泌されることが示された.また菌体外輸送機能に 必要なVirGβ-コア最小領域を求めるため, VirGβ-コ アのN-末端側を順次欠失させた4種類のβコアを作成 し,同様にMalEとの融合蛋白を発現させることにより MalEの菌体表層分泌能を解析した結果,菌体外分泌能 に必要な領域はVirG β -コアのTyr801からPhell02で あることが示された.さらにVirGβ-コアを介して分泌 される蛋白の折りたたみ(フォールディング)がVirG β-コアの通過にいかなる影響を与えるかを検討した. アルカリフオスフアタ-ゼ(PhoA)はペリプラズム蛋 白で分子内に2つのジスルフイド結合を形成することが 知られている.そこでVirGβ-コアのN-末端側にPhoA ill を連結し, PhoAの菌体表層分泌能を解析した.その結 果,菌を通常の培地で培養した場合にはPhoAは菌体外 -分泌されず,一方,培地中に21メルカプトエタノー ルを添加するか,あるいは菌にdsbAy.Tn5変異を導入 し,ペリプラズム中のPhoA分子内ジスルフイド結合の 形成を阻害すると, PhoAの菌体外-の発現量は顕著に 増大した.すなわちVirGβ-コアによる菌体外輸送機構 には,ペリプラズムでのPhoA分子内ジスルフイド結合 の解離が必要であり,おそらく折りたたみ構造が解離し た形状(アンフオールド)であればβ-バレル内を通過 できることが示唆された.以上の結果から, VirGはβ- コアによってα-ドメインをペリプラズムから菌体外-転移分泌するという自己輸送蛋白(auto-transporter) であることが明らかになった27)この分泌機構は,赤痢 菌の他のエフェクター分泌機構とは異なり,淋菌 (Neisseria gonorrhoeae)が有するイムノグロブリン (Ig) Aプロテアーゼの分泌機構28,29)で示されたような ユニークなものであり,現在I型からⅤ型に分類される 細菌蛋白の分泌装置のなかではⅤ型分泌装置に属するこ とになった.ちなみに赤痢菌をはじめとするグラム陰性 細菌のエフェクター分泌は主にIII型分泌装置による30-32) IV. VirGの機能蘭域の解析 Ⅲ.の研究からVirGの菌体表層における局在とアク チン重合には菌体露出領域( α-ドメイン)が関与する と考えられた.そこで, α-ドメインに一部欠失変異を 導入して機能領域の解析を行った.その結果, α-ドメ インのC-末端側1/3の領域は菌体表層での一極発現に, 残るN-末端側の2/3の領域は宿主細胞質内におけるアク チン重合に必要な領域であることが示された.したがっ て菌体表層での局在とアクチン重合に必要な機能領域が それぞれ独立に存在することが明らかになった(Fig.2 ); V. VirGと結合する宿主細胞側因子の同定 A.ビンキュリン in vitroアクチン重合試験に用いる条件においてVir Gと単量体アクチンを混合してもアクチンの重合は起こ らないことから, VirGは直接アクチンの重合を誘起し ているのではなく,まず宿主側のアクチン重合制御因子 との結合することによってアクチン重合が生じるものと 考えられた.最初に細胞接着斑形成に重要な蛋白の1つ であるビンキュリンが感染細胞内の菌表面のVirG局在 部位に凝集することが認められた.種々の変異VirG発 現株を用いて菌体へのビンキュリン凝集に関与するVir Gα-ドメイン領域を調べた結果, α-ドメインのアクチ ン重合に必要な領域はビンキュリンの凝集にも関与して いること,さらにビンキュリンはアクチンの重合と凝集 に先立って菌体のVirG局在部位に凝集することが示唆
された.したがってVirGはアクチンの重合・凝集を引 き起こす前に,ビンキュリンと結合するのではないかと 推定された33) 次にVirGとビンキュリンの相互作用を明らかにする 目的で,グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)と VirGα-ドメインの各種断片とを連結した融合蛋白を作 成し,赤痢菌のアクチン重合のin vitro実験系として用 いられるアフリカツメガェル卵母細胞抽出液や,ニワト リ砂嚢より精製したビンキュリンを用い, in vitroの条 件下で種々のGST-VirGα-ドメインとビンキュリンと の結合の有無を検討した.その結果, α-ドメインのア クチン重合に必要な領域がビンキュリンに直接結合する ことが示された.ビンキュリンは117kDaの蛋白で95 kDa頭部および30kDa尾部から構成される.これをブド ウ球菌由来V8プロテアーゼを用いて95kDa頭部および 30kDa尾部に分離精製し,同様にGST-VirGα-ドメイ ンとの結合実験を行った結果,ビンキュリンのGST-α-ドメイン結合領域は95kDa頭部にあることが示された33) さらにT125放射標識したビンキュリンとの定量的な結合 実験の結果, GST-VirGα-ドメインは117kDa全長ビン キュリンに対する結合に比べ, 30kDa尾部を除去した 95kDa頭部に対してより強く結合することが示された (117kDa全長蛋白とのKd値はIOOOnM以上であったの に対し, 95kDa頭部とのKd値は約300nM). in vitroに おいて95kDa頭部-30kDa尾部間の分子内相互作用が他 の蛋白との結合を制御することが知られている34,35)が, VirGα-ドメインとの結合においてもそのような制御を 受けている可能性が示唆された.しかし,実際に赤痢菌 が感染した細胞内においてビンキュリンによる制御機構 がいかなるのものかは不明である.一方,ビンキュリン がVirGによるアクチン重合に必要かどうか調べるため に,免疫沈降によってアフリカツメガェル卵母細胞抽出 液よりビンキュリンを除去後,アクチンコメット形成の 有無を検討した結果,ビンキュリン除去によりアクチン コメットを形成する菌の率が約1/3に低下し,さらにニ ワトリ由来ビンキュリンを添加することによって約80% まで回復した.したがってVirGによるアクチン重合に はVirGとビンキュリンの結合が関連していることが示 された. ビンキュリンは細胞接着斑において,チ-リン, α-アクチニン, F-アクチン,テンシンといった蛋白間を 架橋するとともに,パキシリン,フオスフアチジルイノ シトール(4,5)二リン酸といったシグナル伝達分子 とも結合して,アクチンの再構成に重要な役割を担って いる.またvasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP)と呼ばれる蛋白がアクチン重合促進因子の1 つであるプロフイリンと結合することが報告され,この VASPがビンキュリンとも結合できることが報告されて いる36)一方で,リステリアのActAによるアクチン重 合機構ではVASPが直接ActAに結合することによって プロフイリンを呼び寄せてアクチン重合を促進すること が知られている37)このことからVirGに結合したビン キュリンがさらに別のアクチン重合制御分子と結合する ことによって, VirGによるアクチン重合に促進的に作 用する可能性が考えられた(Fig.2 ).
B. Neural-Wiskott Aldrich syndrome protein (N-WASP)
さらにVirGのα-ドメインはN-WASPと結合し,そ の結合が赤痢菌によるアクチン重合に不可欠であること を明らかにした;). N-WASPはシグナル伝達分子Ash/ Grb2の結合蛋白として竹縄らによって同定された分子 で,ヒトの遺伝疾患の1つWiskott Aldrich Syndrome の原因遺伝子産物であるWASPと高いホモロジーを有 する39)本蛋白は脳や大腸をはじめ各臓器に広範囲に存 在し,実際に細胞内ではEGF刺激や低分子量GTP ア-ゼの1つCdc42の活性化によって生じる糸状仮足 (filopodia)の形成や,神経細胞における突起の伸長に 関与していることが知られている40)分子内にはCdc42/ Rac結合領域を含むWHl (WASP-homologyl )顔 域,プロフイリン結合性プロリンリッチ領域,そして Arp2/3複合体のアクチン重合活性化領域といった興味 深い機能領域が存在している.実際に感染細胞内の赤痢 菌の一極に発現するVirGと同じ位置にN-WASPの集積 がみられ,そこからアクチンコメットが形成されている のが認められた.このようなN-WASPの集積はリステ リアによるアクチンコメットでは全く認められず,した がってこの現象は赤痢菌に特異的なものであることが示 された.またN-WASPはVirGに直接結合することが示 され, N-WASPの結合領域は先のビンキュリンと同様, VirGのα-ドメイン内にあるアクチン重合に必要な領域 であることが明らかになった.さらにin vitroアクチン コメット形成実験に用いられるアフリカツメガエル卵母 細胞抽出液から, N-WASPを免疫沈降によって除去す るとVirGによるアクチンコメット形成能が著しく低下 し,次にバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞よ り精製したN-WASPを添加するとアクチンコメットが 回復することが認められた.この結果から, N-WASP はVirGによるアクチン重合機構に必須な因子であるこ とが明らかになった(Fig.2); 晴乳動物細胞においてN-WASPはWASPおよび WAVE1 -3と呼ばれる蛋白とともにWASPファミリー を形成しており,いずれの蛋白もそのC-末端側にArp 2/3複合体結合および活性化領域をもつ. WASPは血球 系細胞にのみ発現するが, N-WASPやWAVEは普遍的 に発現すると考えられている41)しかしマクロファージ, 多形核白血球といった赤痢菌の粘膜感染に関連する細胞 や血小板にはN-WASPがほとんど発現していないこと を見出した.そのかわりこれらの細胞ではWASPが大 量に発現している.血球系細胞ではなぜWASPが優先
鈴 木 敏 彦 的に発現しているのか明らかではないが, VirGはNI WASPとのみ特異的に結合することから,赤痢菌が感 染したマクロファージではアクチンコメットの形成が阻 害されていることが明らかになった42)実際に腸管粘膜 上皮において赤痢菌はマクロファージに感染してすみや かに細胞死を引き起こすと考えられている.マクロファー ジ内でアクチンコメットを形成しないことが菌の感染や 細胞死誘導に有利に働くのかどうか現時点ではわかって い''kい. VI. N-WASP-Arp2/3複合体を介した VirGによるアクチン重合機構 Arp2/3複合体はArp2 , Arp3とさらに5つの蛋白 からなり,元々はアカントアメーバよりプロフイリンの アフイニティーカラムを用いて精製されたが,現在では 酵母から晴乳動物まで広く保存されていることが知られ ている.しかし長らくこの複合体の機能は不明であった. 現在では, WASPファミリーのC末端側に共通して保存 されている領域(バープロリン相同顔域, verprolin homology region: V,コフイリン相同領域, cofilin homology region: Cおよび酸性アミノ酸配列, acidic amino acid segment: AからなるVCA領域)がArp 2/3複合体に結合すると, Arp2/3によるアクチン重合 活性が顕著に増大することが知られている41)したがっ て赤痢菌VirGにN-WASPが結合しそこにArp2/3複合 体が結合することにより,菌の一極でアクチンの重合が 促進するものと考えられる(Fig.2).さらにArp2/3複 合体はアクチンフィラメントの側面に70度の角度で結 合する性質があるため, Arp2/3複合体を核として重合 したアクチンフィラメントが枝分かれ状の構造を作るこ とによりコメット構造の支持体を形成し,運動力を生み 出しているものと思われる.この枝分かれ構造は細胞運 動に必要な葉状仮足におけるアクチンフィラメントの構 造と類似していることから,赤痢菌は細胞運動における アクチン重合機構を擬態することによって推進力を獲得 しているものと考えられる.一方リステリアではActA がWASPファミリーのCA regionと類似の配列をもっ ており,これに直接Arp2/3複合体は結合することにより アクチンの重合を促進することが明らかになっている43) 精製蛋白によるアクチンコメットの再構成実験44)が 可能になると,アクチンフィラメントの成長端(反矢じ り端)に結合して重合を阻害するキヤツビングプロテイ ン,反対側の矢じり端に結合してアクチンフィラメント から単量体アクチンを脱重合させるADF/コフイリン が重合に必要であることが証明され,アクチンフィラメ ントのターンオーバーがコメット伸長に必要であること が示された.またアクチン重合を促進する作用をもつプ ロフイリンがコメット伸長に促進的に働くことが示され た.著者らはアクチンモノマーあるいはプロリンリッチ IK 領域に結合できないプロフイリンの変異体を用いること によって, VirGによるアクチン重合にプロフイリンが 促進的に作用することを明らかにした45) 低分子量GTP結合蛋白の1つ, Rhoファミリー(Rho, Rac, Cdc42)はそれぞれ異なるシグナル伝達経路の下 流で特徴あるアクチン系細胞骨格蛋白を制御している. 前述したN-WASPは通常の状態では分子内相互作用に よりVCA領域が隠れている.しかしN-WASPに活性化 型のGTP結合型Cdc42がN-WASPに結合するとVCA領 域が露出L N-WASP-Arp2/3によるアクチン重合活性 が増大することが報告されている46)筆者らはCdc42が 赤痢菌の細胞内運動に関与していることを見出した.赤 痢菌の感染細胞に対してRho, Rac, Cdc42の活性化蛋 白を微量注入すると, Cdc42にのみ細胞内の赤痢菌の運 動速度の増大作用が認められた.また,アフリカツメガ エルの卵母細胞抽出液にRhoファミリーの阻害蛋白であ るRhoGDIを添加するとVirGによるアクチンコメット 形成が阻害され,さらにCdc42の活性化蛋白の添加によ りアクチンコメット形成が回復した. Egileら47'はin vitroの条件でVirG単独でN-WASP-Arp2/3の活性を 増大することを報告したが,著者らは同様の手法により Cdc42がVirGによる活性化を顕著に増大することを証 明し,さらにCdc42が赤痢菌感染細胞内においてアクチ ン重合による細胞内および細胞間拡散に必須な役割をに なっていることを明らかにした48) Ⅶ.抗原提示細胞に対する細胞死誘導機構 赤痢菌が樹状細胞(DC)やマクロファージといった 抗原提示細胞に侵入する(あるいは会食される)と,フア ゴゾ-ムを溶解して細胞質-離脱しその後細胞死を誘導 することが知られている5).これまで,菌による細胞死 誘導は典型的なアポトーシスであり,そのメカニズムと して菌が分泌するエフェクターの1つIpaBが直接カ スパーゼ11を活性化することによると報告されてき た12,49-51)しかしながら,この説には疑問な点が多く我々 もIpaBによるカスパーゼ11の直接活性化に関して再現 性が得られていなかった.一方,赤痢菌による細胞死を アポトーシスではなく細胞膜の破綻を伴うネクローシス であるとする報告もある52,53)また,カスパーゼ11は proIL-1 βおよびproIL-18を切断し活性化体を生成する セリンプロテアーゼとして知られているが,生体内にお けるアポトーシスに関しては重要でないことがノックア ウトマウスを用いた研究で明らかになっている54)そこ で我々は赤痢菌をカスパーゼ11ノックアウトマウス骨 髄由来の樹状細胞やマクロファージに感染して精査した 結果,カスパーゼ11の活性化は菌の細胞死誘導に促進 的に働くが必須ではないこと,また赤痢菌による細胞死 は典型的なアポトーシスではなくむしろネクローシスで あることを明らかにした8).現在,このような炎症誘導
性の細胞死をpyroptosisと呼ぶことが我々を含めた細 菌研究者によって提唱されている55,56)各種赤痢菌変異 株を用いた実験の結果,赤痢菌や大腸菌といったグラム 陰性細菌に共通の因子がマクロファージの細胞質-移行 することによって細胞死の誘導が起きることが示された. さらに細胞死誘導因子の同定を行い最終的にIipid Aが 細胞死誘導分子の1つであることを明らかにした.実際 に(あるいはLPS)がTLR4を介してアポトーシス活 性あるいは抗アポトーシス活性を誘導することは広く知 られている.しかし, TLR4欠損マクロファージに赤 痢菌が感染しても依然細胞死の誘導が認められた.した がって感染細胞の細胞質において赤痢菌から放出される lipid AがTLR4を介さない全く別の細胞死誘導シグナ ルを刺激していることが示唆された8).しかしながら, 細菌由来の構成成分による生物活性に関してはこれまで も他の成分の微量混入の結果であったといった問題が続 いていることから注意深く研究を進める必要がある. Ⅷ.新規弱毒ワクチン株の作製とその評価 細菌性赤痢に対して有効でかつ安全性が高いワクチン は末だ開発されていない.赤痢菌の場合,他の毒素産生 性病原細菌による感染症と異なり防御抗原となる分泌性 蛋白(毒素等)が同定されておらず,もっぱら菌体表層 のリボポリサッカライド(LPS)が防御抗原としてい る特徴があるため強力な獲得免疫を誘導しにくい.また, 開発したワクチンを注射すると血中の免疫グロブリン産 生といった全身性免疫は誘導されるが,感染局所の腸管 において感染を阻止できうる粘膜免疫は成立しにくいと いう欠点がある.このような背景から,赤痢ワクチンと して経口投与型の弱毒生菌ワクチンの研究が主に行われ ている57,58)これまでの研究では細胞侵入性を保持した 弱毒菌による粘膜免疫の誘導は非細胞侵入性菌より優れ ていることがわかってきたが,発熱・下痢といった看過 できない副作用も報告されている59-70)前項で示したよ うに,赤痢菌がマクロファージに侵入し細胞質に遊離す ると細胞死の誘導とそれに伴いIL-1 βの分泌が引き起 こされる.これらによる強い炎症は細胞侵入性を有する 赤痢菌株であれば誘導される.したがってマクロファー ジの細胞死は従来の細胞侵入性弱毒ワクチン株でみられ る炎症(ひいては発熱といった副作用)の誘導に関わる と考えられた.そこで細胞侵入能は有するがマクロファー ジに感染後のフアゴゾ-ム膜溶解能を欠失した変異株を 作成できれば低炎症性の新規のワクチン株になる可能 性があると考えられ,エルシニアの細胞侵入因子 invasin の遺伝子を細胞侵入能欠損株(IpaBエフェ クター欠損株)に導入した.本変異株は細胞侵入性を持 つがマクロファージに感染後細胞死を誘導せず,細胞死 に伴って大量に分泌されるIL-1 βおよびIL-18量も低下 していた.実際にマウスに対する肺炎惹起モデルを用い, invasin発現変異株のワクチンとしての効果を検討した ところ赤痢菌野生株感染に対する感染防御効果が示され, 新規ワクチン株として有望であることが示唆された73) また,動物実験で赤痢を発症させるためにこれまではサ ルを用いなければならなかったが,我々はモルモットを 用いて経直腸的に感染させることにより下痢,テネスム ス等の赤痢様症状を起こさせることに成功した74)これ により,小動物感染実験系を用いて赤痢発症を防御でき るワクチンの評価を行うことが可能となった. おわりに 前半の項目では赤痢菌のアクチン重合に基づく細胞間 感染機構に関する著者らの研究成果を概説した.これら の研究から赤痢菌による細胞内アクチン重合機構の大筋 が明らかになった.またこの一連の研究は,その後の ワクシニアウイルスのアクチン重合に基づく細胞内運 動あるいは腸管病原性大腸菌(Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)の上皮細胞密着におけるア クチン台状突起形成の機構解明の手掛かりとなった.近 午,赤痢菌をはじめ多くの毒素非産生性病原細菌の宿主 感染機構を理解する上で新たな概念が提唱されている. すなわち宿主細胞に接した後,病原細菌はエフェクター と呼ばれる一群の分泌性因子を細胞に注入し,これらが 宿主細胞機能に様々な反応を引き起こすことによって感 染が進行していくという考え方である.個々のエフェク ターの作用機序と宿主細胞の機能変換はまだ不明な点が 多いが,いずれの場合もエフェクターが標的分子-作用 し,それが最終的に細胞高次機能の再構築を引き起こし 菌の感染を成立せしめていると考えられる.これらの分 子基盤を確立することは,感染症の発症機序を正確に理 解するのに役立つばかりではなく,感染を初期に阻止す る薬剤あるいはワクチン等の開発にも貴重な手掛かりを 与えてくれることが期待される.一方,こういった粘膜 病原細菌は細胞の高次機能とその調節機構を解明するた めの生きたプローブとしても研究に活用されている. 後半の項目で述べたように,赤痢菌はグラム陰性細菌 に共通に存在するIipid A (あるいはLPSとして)を細 胞質内に放出し,これらを感知したDCやマクロファー ジはネクローシス様の細胞死を誘導して局所の炎症を惹 起することが明らかとなった.また,カスパーゼ11は この細胞死を促進する作用をもつとともに炎症性サイト カインIL-1 β, IL-18を産生させる.このような細胞応 答は,フアゴゾ-ムを突破して細胞質内に侵入したグラ ム陰性細菌に対する宿主の炎症反応の1つと考えられる が,赤痢菌はこれを逆手にとり,感染細胞を破壊して感 染局所に炎症を誘導すると同時に抗原提示細胞の機能抑 制をはかっているものと思われる.また,ここで明らか になった細胞死誘導機構を基に新たに作製したワクチン 株による感染防御誘導は,低炎症性新規赤痢ワクチン株
鈴 木 敏 彦 のプロトタイプとして有用な基礎知見となりえる. 謝 辞 本稿で紹介した研究内容は,御指導を頂きました笹川 千尋教授が率いる東京大学医科学研究所細菌感染分野を 始めとする多くの研究室の先生方との共同研究の成果で あります.これらの共同研究をお願いした多くの方々に 心から感謝いたします. 文 献
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