プロアクロシン結合タンパク sp32 前駆体のヒトホモログ遺伝子の同定とがん・精巣 (CT) 抗原－岡山大学医学賞（林原賞）を受賞して－

プ ロ ア ク ロ シ ン結合 タ ンパ クsp32前 駆 体 の ヒ トホ モ ロ グ遺 伝 子 の

同定 とが ん ・精 巣(CT)抗

原

小

野

俊

朗

― 岡 山 大 学 医 学 賞(林 原 賞)を 受 賞 して ― キ ー ワ ー ド; OY-TES-1,sp32,Cancer/testis(CT)antigen,Sperm protein,Cancer は じ め に 現 在 ま で に,が ん ・精 巣(cancer/ testis, CT) 抗 原,分 化 抗 原,突 然 変 異 に よ る も の,遺 伝 子 増 幅 や 過 剰 発 現 に よ る も の,ス プ ラ イ シ ン グ 異 常,レ ト ロ ウ イ ル ス 抗 原 な ど さ ま ざ ま な 種 類 の が ん 抗 原 が 同 定 さ れ て き て い る.こ れ ら の 中 で そ の 発 現 特 異 性 か ら,が ん 免 疫 療 法 の 標 的 分 子 と し て 最 も有 望 と期 待 さ れ て い る の はCT抗 原 で あ る.CT抗 原 は 正 常 で は 精 巣 の み に 発 現 す る が,さ ま ざ ま な 種 類 の が ん に 発 現 が み ら れ る と い う 特 徴 を 有 す る.こ れ ま で に CT抗 原 と し て は 細 胞 傷 害 性T細 胞(CTL)認 識 抗 原 と し て 同 定 さ れ たMAGE1),BAGE2),GAGE3),が ん 患 者 血 清 を 用 い て が ん 細 胞 由 来 のcDNAラ イ ブ ラ リ ー を ス ク リ ー ニ ン グ し てIgG認 識 抗 原 を 同 定 す る SEREX法 に よ りSSX4,5),NY-ESO-16), SCP17), CT78),CT89),cTAGE-110)が 同 定 さ れ た.ま た, デ イ フ ァ レ ン シ ャ ル デ ィス プ レ イ 法 な ど の 非 免 疫 学 的 方 法 に よ りCT911),CT1012),CTp1113), SAGE14)が 同 定 さ れ た. わ れ わ れ はSEREX法 を 用 い てBALB/cマ ウ ス 線 維 肉 腫Meth Aよ りマ ウ スCT抗 原 を コ ー ドす る 遺 伝 子pemを 単 離,同 定 し た15).こ のpemの ヒ トホ モ ロ グ 遺 伝 子 を 同 定 す る 目 的 で,マ ウ スpemの 塩 基 配 列 とpemに 関 係 す る ヒ ト精 巣 由 来 のEST配 列 情 報 を 基 に,ヒ ト精 巣cDNAラ イ ブ ラ リ ー を 解 析 し た.そ の 結 果,新 規 ヒ ト遺 伝 子OY-TES-1が ク ロ ー ニ ン グ さ れ た16).こ れ はpemの ヒ トホ モ ロ グ で は な く精 巣 ア 論 文 請 求 先:岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 免 疫 学 電 話:086-235-7192FAX:086-235- 7193 E-mail:[email protected] ● フ ロ フ ィ ー ル ● 1978年 岡 山 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 修 士 課 程 修 了.重 井 医 学 研 究 所,岡 山 大 学 歯 学 部 助 手 を経 て,1990年 医学 部 助 手(寄 生 虫学 教 室).1991年,中 山睿 一 教 授(現 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 免 疫 学)の 着 任 に と も な い,腫 瘍 免 疫 学 の研 究 に 従 事.1996年4月 よ り2年 間 米 国 ア ル バ ー ト ・ア イ ン シ ュ タ イ ン医 科 大 学(Stanley G.Nathenson教 授)に お い てT細 胞 レ セ プ タ の ペ プ チ ド/MHC複 合 体 認 識機 構 の研 究 に 従 事.帰 国 後,再 渡 米 し,ニ ュ ー ヨ ー ク, ラ ドウ ィ ック癌 研 究所,Lloyd J. Old, Matthew J. Scanlan両 博 士 の も と で,SEREX法(が ん患 者 抗 体 を用 い るcDNA発 現 ク ロ ー ニ ン グ法)の 手 技 を研 修.こ のSEREX法 で,マ ウ ス 線 維 肉腫Meth A抗 原 の解 析 を行 い,が ん ・精 巣(CT)抗 原pemを 同 定 した(平 成13年 度 岡 山 医 学 賞(山 田 賞)).こ の マ ウ ス で の 解 析 を も と に,ヒ ト精 巣 よ り新 規 ヒ トCT抗 原, OY-TES-1を 同 定 した。CT抗 原 はMAGEやNY-ESO-1な どが 知 られ てい るが,そ の 発 現 特 異 性 か らが ん免 疫 療 法 の 標 的 分 子 と して現 在 も っ と も可 能 性 の あ る抗 原 と して,世 界 中 で新 た なCT抗 原 の 同 定 の 努 力 が な さ れ て る.現 在 肺 癌,大 腸 癌,腎 臓 癌 な どの 癌 の 他,自 己 免 疫 病 につ い て もSEREX解 析 を行 っ て い る.ま た,こ れ らに 関 連 して が ん と精 子 形 成,胚 形 成 反 応 との 関 連 に も興 味 を持 っ て い る. 本 年4月 よ り,自 然 生 命 科 学 研 究 支 援 セ ン ター 光 ・放 射 線解 析 部 門 鹿 田施 設助 教 授.

10 小 野 俊 朗 ク ロ ソ ー ム 内 の プ ロ ア ク ロ シ ン 結 合 タ ン パ ク 質 sp32前 駆 体 で あ っ た.本 稿 で は こ のOY-TES-1の 同 定 と そ のCT抗 原 性 の 解 析,及 び が ん に発 現 す る 他 の 精 子 タ ン パ ク に つ い て 解 説 す る. OY-TES-1遺 伝 子 の 同 定 とOY-TES-1タ ン パ ク マ ウ スpemの 塩 基 配 列 とpemに 関 係 す る ヒ ト精 巣 由 来 のEST配 列 情 報 を 基 に,プ ラ イ マ ー を 設 計 し, ヒ ト精 巣cDNAラ イ ブ ラ リ ー を 鋳 型 に し てPCR法 を 行 い1.1kbのPCR増 幅 産 物 を 得 た.デ ー タ ベ ー ス で の 検 索 の 結 果,こ の1.1kbの 遺 伝 子 断 片 は14個 の ESTク ロ ー ン と相 同 性 が あ っ た.14個 のESTク ロ ー ン の う ち12個 は 得 ら れ た 遺 伝 子 断 片 の37端 に 位 置 し,さ ら に そ の う ち の10個 は ヒ ト精 巣 由 来 の ク ロ ー ン で あ っ た.さ ら に57RACE法 な ど を 行 い,全 長 1895bpのcDNAを 得 た.こ れ は 新 規 ヒ ト遺 伝 子 で

あ り,OY-TES-1と 名 付 け た(GenBank accession number ABO51833).デ ー タ ベ ー ス に よ る ホ モ ロ ジ ー 検 索 の 結 果 ,こ のOY-TES-1はpemの ヒ トホ モ ロ グ で は な く,精 子 ア ク ロ ソ ー ム に 局 在 す る プ ロ ア ク ロ シ ン 結 合 タ ン パ クsp32前 駆 体 の ヒ トホ モ ロ グ で あ っ た.こ のsp32は マ ウ ス,モ ル モ ッ ト,ブ タ で 同 定 さ れ て い る が ヒ ト で は は じ め て の 発 見 で あ っ た. FISH法 や ゲ ノ ム 情 報 解 析 に よ りOY-TES-1は12p12-p13に マ ッ ピ ン グ さ れ て お り,10個 の エ ク ソ ン よ り 構 成 さ れ,全 長 は9339bpで あ っ た.さ ら に,サ ザ ン プ ロ ッ ト法 に よ り少 な く と も2個 の 遺 伝 子 フ ァ ミ リ ー よ り な っ て い る こ とが わ か っ た(図1).OY-TES-1タ ン パ ク は12個 の シ ス テ イ ン残 基 を含 む543 ア ミ ノ 酸 残 基 よ り な り,そ の 中 に は,グ ル タ ミ ン-グ ル タ ミ ン 酸 リ ッ チ ド メ イ ン,酸 性 ア ミ ノ 酸 リ ッ チ 領 域 が あ り,各 動 物 種 問 で よ く保 存 さ れ て い た.タ ン パ ク 質 レ ベ ル で の 各 動 物 種 問 で の 相 同 性 は ヒ トー モ ル モ ッ トで77.2%,ヒ トーブ タ で81.9%,ヒ トーマ ウ ス で75.2%で あ っ た.sp32前 駆 体 タ ン パ ク は そ のN-末 端 に シ グ ナ ル 配 列 を 持 ち,さ ら に ア ル ギ ニ ン273 と グ ル タ ミ ン 酸274の 間 で ク リ ー ベ イ ジ さ れ,そ の 後 半 部 分 が 成 熟sp32タ ンパ ク と な る(図2).sp32 は 精 子 先 端 の ア ク ロ ソ ー ム 内 で プ ロ ア ク ロ シ ン を 効 率 的 に パ ッケ ー ジ ン グ して い る と予 想 さ れ る. 図1OY-TES-1遺 伝 子 (A)サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析.(B)OY-TES-1の ゲ ノ ム 構 造.10個 の エ ク ソ ン よ り 構 成 さ れ 、 全 長9339bpで あ る. (Ono T,et al,Proc Natl Acad Sci USA(2001)98,3282-3287.よ り 改 変)

図2プ ロ ア ク ロ シ ン結 合 タ ンパ クsp32前 駆 体 の 模 式 図 ア ミ ノ 末 端 の シ グ ナ ル 配 列 が ク リ ー ベ イ ジ さ れ た 後(灰 色 矢 頭),ア ル ギ ニ ン273と グ ル タ ミ ン酸274の 問 で ク リ ー ベ イ ジ さ れ(矢 頭),そ の 後 半 部 分 が 成 熟sp32タ ン パ ク と な る. OY-TES-1の 正 常 組 織 及 び 癌 で の 発 現 と そ の 免 疫 原 性 の 解 析 OY-TES-1遺 伝 子 の 正 常 組 織 及 び 各 種 の 癌 で の 発 現 をRT-PCR法 で 解 析 し た.〇Y-TES-1は 正 常 組 織 で は 調 べ た16種 類 の 組 織 の う ち,予 想 通 り精 巣 に の み 発 現 し て い た(図3).癌 組 織 で は 膀 胱 癌,乳 癌, 肝 癌,肺 癌,大 腸 癌 に 発 現 し て い た(図4,表1). 次 にOY-TES-1組 み 換 え タ ンパ ク を 作 製 し,こ れ を 用 い てELISA法 に よ り,癌 患 者 血 清 中 の 抗 体 の 有 無 を 解 析 し た.健 常 人20名 に は 抗 体 産 生 は ま っ た く 図3正 常 組 織 で のOY-TES-1mRNAの 発 現

(Ono T,et al,Proc Natl Acad Sci USA(2001)98,3282-3287.よ り 改 変)

図4各 種 の 癌 組 織 で のOY-TES-1mRNAの 発 現

12 小 野 俊 朗

表1各 種 が ん組 織 で のOY-TES-1mRNAの 発 現

(Ono T,et al,Proc Natl Acad Sci USA(2001)98,3282-3287.よ り 改 変)

認 め ら れ な か っ た が,調 べ た393人 の 癌 患 者 の う ち 25人(6.4%)にOY-TES-1に 対 す る 抗 体 が 認 め ら れ, 新 しいCT抗 原 で あ る こ と が 証 明 さ れ た(表2).表 に は 同 じ癌 患 者 血 清 を 用 い て,代 表 的 なCT抗 原 で あ るNY-ESO-1に 対 す る 抗 体 産 生 を 調 べ た 結 果 も示 し て あ る.NY-ESO-1はCTLと 抗 体 で 共 に 認 識 さ れ る 抗 原 と し て,現 在 免 疫 療 法 の 最 も有 力 な タ ー ゲ ッ ト と さ れ て お り,欧 米 で は す で に 悪 性 黒 色 腫 患 者 な ど に 対 し て 臨 床 応 用 が な さ れ,一 定 の 効 果 が 得 ら れ て い る17,18).OY-TES-1も 癌 患 者 に 対 し て 高 い 免 疫 原 性 を 有 し て い る こ と が わ か っ た. 表2健 常 人 及 び が ん 患 者 血 清 のOY-TES-1及 びNY-ESO-1に 対 す る 反 応 性

(Ono T,et al,Proc Natl Acad Sci USA(2001)98,3282-3287.よ り 改 変)

精 子 タ ン パ ク と 癌 現 在 ま で にOY-TES-1を 含 め て14種 類 を超 え る ヒ トCT抗 原 が 同 定 さ れ て い る が,タ ン パ ク と し て の 機 能 が 知 ら れ て い る の は,OY-TES-1の 他 は 減 数 分 裂 に 関 与 す る タ ン パ ク で あ るSCP-1の み で あ る19). そ の 他CTp11が 精 子 タ ン パ ク と し て み い だ さ れ た SPAN-Xで あ る こ とが わ か っ た20).こ れ ら の こ と か ら,精 子 タ ン パ ク の 中 に は,癌 に 発 現 し,し か も CT抗 原 性 を 有 す る も の が 存 在 す る こ とが 考 え ら れ た.わ れ わ れ は,デ ー タ ベ ー ス や 文 献 上 か らOY-TES-1/sp32やSPAN-X/CTp11を 含 む12種 類 の 精 子 タ ン パ ク を リ ス ト ア ッ プ し た(表3). SPAN-X/CTp11を 除 く11種 の 精 子 タ ン パ ク に つ い て,そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 特 異 的 プ ラ イ マ ー を作 製 し,正 常 組 織 で の 発 現 をRT-PCR法 及 び リ ア ル タ イ ムRT-PCR 法 で 解 析 し た(表4).精 巣 の み に 発 現 が 認 め ら れ

たacrosin,PH-20, AKAP110 (AKAP3), NYD-sp10の 他,精 巣 に 加 え て 膵 臓 に も 発 現 が 見 ら れ た SP-10とropporinに つ い て は さ ら に 各 種 の 癌 組 織 で の 発 現 を解 析 した.そ の 結 果,PH-20は 癌 に は ま っ た く発 現 し て い な か っ た が,他 の 精 子 タ ン パ ク,特 にacrosin,AKAP110(AKAP3)は 膀 胱 癌,肝 癌, 肺 癌,大 腸 癌,腎 癌,卵 巣 癌 な ど に 発 現 が 見 ら れ, こ れ ら はCT抗 原 性 を 有 す る こ と が 示 さ れ た21).さ ら に,わ れ わ れ は バ イ オ イ ン フ オ ー マ テ ィ ク ス に 基 づ く デ ー タ マ イ ニ ン グ 法 や,悪 性 黒 色 腫 患 者 血 清 を 用 い たSEREX法 に よ り癌 に 発 現 す る 新 た な 精 子 タ ンパ ク を 見 い だ し て お り,現 在 こ れ ら に つ い て は さ ら に 解 析 中 で あ る. お わ り に わ れ わ れ が 同 定 したOY-TES-1は プ ロ ア ク ロ シ ン 結 合 タ ン パ クsp32前 駆 体 の ヒ トホ モ ロ グ で あ っ た. こ のOY-TES-1の 他,複 数 の 精 子 タ ンパ ク を コ ー ド す る 遺 伝 子 が 癌 に も発 現 し て い る こ とが わ か っ た. す べ て の 体 細 胞 が ほ ぼ 完 全 な 遺 伝 子 の セ ッ トを 持 っ て い て も,発 現 す る の は そ の 一 部 で し か な い と さ れ て い る.精 子 タ ンパ ク を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 癌 に も 発 現 して い る と い う事 実 は,が ん 化 の 過 程 と精 子 形 成 反 応 や 胚 形 成 反 応 が な ん ら か の 関 連 を有 し て い る こ と を 物 語 っ て い る.い い か え る と,癌 の 持 つ 異 常 な 増 殖 能 や 機 能 が 精 子 あ る い は 精 巣 に だ け 発 現 す る 遺 伝 子 の 異 常 発 現 に よ る 可 能 性 が 考 え ら れ る. 癌 の 診 断 や 癌 免 疫 療 法 の 標 的 分 子 と して,最 も 有 望 と期 待 さ れ て い る の はCT抗 原 で あ る.精 巣 に は HLAク ラ ス1の 発 現 が な く,こ の た め,T細 胞 に よ る 細 胞 傷 害 か ら 逃 れ て い る.癌 細 胞 にCT抗 原 が 発 現 す る と そ の 断 片 がAPCを 介 し てHLAク ラ スIに 結

表3精 子 タ ン パ ク 表4精 子 タンパ クmRNAの 正 常組織 での発現 そ れ ぞ れ 遺 伝 子 特 異 的 プ ラ イ マ ー を用 い て30サ イ ク ル でRT-PCRを 行 っ た.PCR産 物 は 通 常 の ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 法,及 び マ イ ク ロ チ ッ プ デ バ イ ス を 用 い た キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 法(Agilent2100)で 解 析 した. 合 し,CTLに 認 識 さ れ る と 考 え ら れ る.OY-TES-1 を は じめ とす る 精 子 タ ンパ ク抗 原 やNY-ESO-1の よ う な 既 存 のCT抗 原 を 組 み 合 わ せ る こ と で よ り効 果 的 な 癌 ワ ク チ ン が 可 能 と な る と 考 え ら れ る.ま た, こ れ ら を使 っ た 抗 原 チ ッ プ を作 り,こ れ を診 断 に応 用 す る こ と も考 え ら れ る.す な わ ち,個 々 の 癌 に つ い て よ り正 確 に そ の 癌 の 悪 性 度 あ る い は 種 々 の 性 質 を 明 ら か に す る こ と が 出 来 る よ う に な る.

14 小 野 俊 朗 謝 辞 岡山大 学大 学 院医 歯学 総合研 究 科免 疫学 中山容 一教授 に は終 始変 わ らぬ御 指 導 を頂 き,お 礼 申 し上 げ ます.ラ ドウ ィ ック癌研 究所L.J.Old博 士 には暖 か い御援 助 と御 指導 をい た だ き,感 謝 い た します.ま た,多 くの貴 重 な検体 を提 供 し て くだ さ った臨床 教 室 の先生 方 にお礼 申 し上 げ ます.免 疫学 教 室 の磯 辺 み ど りさん,水 内純 子 さ ん には,研 究 の 手伝 い, 論 文 の作 成 に協力 い た だ きま した.お 礼 申 し上 げ ます. 文 献

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