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ラット変形性関節症モデルの関節軟骨におけるc-fos,c-jun発現の免疫組織学的研究

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Academic year: 2021

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(1)博 士 学 位 論 文. ラ ッ ト変形性 関節 症 モデルの関節 軟 骨 にお ける c-fos,c-jun発. 現 の 免 疫 組 織 学 的 研 究. 近 畿 大 学 医 学 部 整 形 外 科 学 教 室. 浩. 宮. 崎.

(2) 博 士 学 位 論 文. ラ ッ ト変 形 性 関節 症 モデ ル の関 節 軟 骨 にお け る c-fos,c-jun発. 現 の 免 疫 組 織 学 的 研 究. 平 成9年11月. 近畿大学医学部 (指 導:田. 整形外科学教室 中 清 介 教 授). 浩. 宮. 崎.

(3) ラ ッ ト変 形 性 関 節 症 モ デ ル の 関 節 軟 骨 に お け る c-fos,c-jun発. 現 の 免 疫 組 織 学 的 研 究. 近畿大学医学部整形外科学教室 宮. 崎. 浩. (指導:田 中. Immunohistochemical articular. 清介. study. chondrocytes. of. Hiroshi Department Kinki. of rat. る.今. osteoarthritis. in. model. : Prof.. Seisu. Surgery,. of Medicine. School. University. ke Tanaka). 録. 伝 子 が 過 剰 発 現 す る と 関 節 軟 骨 の 変 性 ・破 壊 に っ な が る 可 能 性 も 報 告 さ れ て い. ッ ト変 形 性 関 節 症(OA)モ. デ ル を 作 成 し,関. 白 の 発 現 を 免 疫 組 織 学 的 に 検 索 し た.そ に,1週. protein. 伝 子 は 細 胞 増 殖 遺 伝 子 と して 胎 生 期 の 関 節 や 関 節 軟 骨 の 発 生 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て. た 最 近C-fOS遺. 回,ラ. c-Jun. Miyazaki. 抄. い る.ま. c-Fos,. of Orthopaedic. (Director. c-fos,c-jun遺. 教 授). 目 で 浅 層 か ら 中 間 層 に,2週. 失 す る こ と が わ か っ た.ま. 節 軟 骨 の 変 性 過 程 に お け るc-fos,c-jun蛋. の 結 果,c-fos,c-jun蛋. 白 は,と. も にOA誘. 発 の3日. 目で 全 層. 目 で 中 間 層 の 軟 骨 網 胞 核 内 お よ び 細 胞 質 に 発 現 し,4週. た サ フ ラ ニ ン0(S-0)染. 現 に と も な っ て 低 下 し た.c-fos,c-lun蛋. 目で は 消. 色 に よ る 軟 骨 基 質 の 染 色 性 は,c-fos,c-junの. 発. 白 の 発 現 が メ カ ニ カ ル ス ト レ ス の 異 常 に 対 応 し てOA発. 症 の初. 期 に 軟 骨 変 性 に 先 立 ち 強 く認 め られ た こ と は,c-fos,c-junに. よ っ て誘 導 され た 軟 骨 細 胞 の 分 裂 増 殖 お. よ び 幼 若 化 が 基 質 破 壊 に っ な が る 可 能 性 を 示 唆 す る. ま た,OAに. お け るproteinkinaseC(PKC)の. 役 割 とc-fosと. の 関 係 を 検 討 す る た め に,PKC活. 化 型 ホ ル ボ ー ル エ ス テ ル で あ るphorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)を c-fos蛋. 白 の 発 現 を 観 察 し た.そ. は 認 め ら れ ず,ま. たOAの. の 結 果,PMA注. 入 群 で はc-fosの. 進 行 も 明 らか に 抑 制 さ れ た.こ. 活 性 化 がtertiarymessengerで. あ るc-fosの. 質 が 破 壊 か ら守 られ た こ と を 示 唆 し,OAの. 関 節 内 に 注 入 し,同 発 現 が 抑 制 さ れ,S-0染. れ はsecondarymessengerで. 発 現 に 抑 制 的 に 作 用 し た こ と,そ. Chondrocyte,. 色 性 の 低下 あ るPKCの. 発 症 と進 行 の メ カ ニ ズ ム の 一 端 が 明 らか に さ れ た と考 え ら. c-fos, c-jun, Osteoarthritis. Immunohistochemistry. 様 に. れ に よ り結 果 的 に 軟 骨 基. れ る.. Key Words. 性. (OA),. Articular. cartilage,.

(4) 緒. 言 関 節 軟 骨 は 低 摩 耗 性 の 組 織 で,関. 用 が あ る.軟. 骨 細 胞 は,軟. 節 運 動 を 円 滑 に行 い,ま. た 衝 撃 を 吸 収 して 骨 へ の 伝 導 を 低 減 す る 作. 骨 基 質 の主 た る構 成 成分 で あ る プ ロテ オ グ リカ ンや コ ラ ー ゲ ンな ど の 基 質 構. 成 成 分 と サ イ トカ イ ンや 基 質 分 解 酵 素 を 産 生 し,軟 骨 基 質 を 合 成 す る と と も に 分 解 に も関 与 し て い る1. し た が っ て,軟 OAは. 骨 代 謝 に 異 常 が 生 じ る と 軟 骨 基 質 の 合 成 も 障 害 さ れ,基. 関 節 軟 骨 の 破 壊 と 修 復 が 混 在 し,退. あ る.従. 来,OAの. き た.近. 年,分. 発 症 機 序 は 荷 重 関 節 に お け る 力 学 的 負 荷 に よ る 軟 骨 のwearandtearと. 明 に 始 ま り,基. 研 究 分 野 で は,プ. 考 え られ て. ロ テ オ グ リカ ンや コ ラ ー ゲ ンの 構 造 解. 質 分 解 に お け る 各 種 酵 素 お よ び イ ン タ ー ロ イ キ ン な ど を は じ め と す るchemical. 作 用 も明 ら か に さ れ っ つ あ る.し. なmessengersystemに 験 的OAモ. 行 性 変 化 と増殖 性 変 化 を 特 徴 と す る 非 炎 症 性 の 関 節 疾 患 で. 子 生 物 学 の 飛 躍 に よ り,OAの. mediatorsの. 質 は 変 性 し破 壊 さ れ る2.. か し,そ. れ ら様 々 のmediatorsが. 軟 骨細胞 内 で どの よ う. 働 き影 響 を 及 ぼ す か に っ い て は 不 明 な 点 が 多 く残 さ れ て い た.そ. デ ル を 用 い,ま. ず 核 内 最 終messengerで. の 関 連 を,c-fos,c-jun蛋. あ るc-fos,c-jun遺. 白 の 軟 骨 組 織 内 発 現 とS-0に. secondarymessengerで. あ るPKCを. こ で 今 回,実. 伝 子 の 発 現 と関 節 軟 骨 変 性 と. よ る 基 質 染 色 性 を 比 較 し検 討 し た.っ. 活 性 化 し,c-fos蛋. い で,. 白発 現 お よ び 関 節 軟 骨 変 性 と の 関 連 と 関 節 破. 壊 へ の 関 与 を 検 討 し た.. 材料 お よ び 方 法 実 験動 物 生 後6-8週. 齢(体. 重130-180g)のWistar系. 雄 ラ ッ ト(日 本 ク レ ア 株 式 会 社,大. 予 備 飼 育 し,順. 調 に 発 育 し た も の40匹 を 実 験 に 供 し た.予. 備 飼 育 期 間,実. 湿 度50±10%の. 一 定 の 空 調 下 で 飼 育 し た.照. 間 人 工 照 明 と し,ま. 形 飼 料(CE-2,日. OAモ. 本 ク レ ア 株 式 会 社)を. 明 は1日12時. 使 用 した.給. 阪)を,1週. 間以上. 験 期 間 を 通 し て 室 温23±0.5℃, た 飼 料 は ラ ッ ト飼 育 用 固. 水 は 水 道 水 を 使 用 し飼 料 と と も に 自 由摂 取 と した.. デ ル お よ び組 織 標 本 の 作 製. OA側 実 験 群 の ラ ッ トは,sodiumpentobarbita1(ネ の 腹 腔 内 投 与 に て 麻 酔 し,後 ヨ ー ド(イ 3-4mm切. ソ ジ ン⑬,明 除 し,次. ン ブ タ ー ル ⑧,ダ. 肢 右 膝 関 節 を 剃 毛 後,70%エ. 治 製 菓,東. 京)に. て 消 毒 後,膝. い で 内 側 半 月 板 摘 出 と,前. 生 理 食 塩 水 で 関 節 内 を 洗 浄 後,5.0ナ. タ ノ ー一ル(和. イ ナ ボ ッ ト,大 光 純 薬,大. 阪)30-40mg/kg. 阪)お. 蓋 骨 内 側 傍 切 開 を 行 っ た .ま. ず,内. よ び ポ ピ ドン 側側副靭 帯 を. ・後 十 字 靭 帯 の 切 離 を 加 え て 動 揺 関 節 を 作 製 し た3'4'5.. イ ロ ン に て 皮 膚 を縫 合 し た 。 こ れ をOA側. 対照側 左 膝 関 節 に は,皮 膚 切 開 の み を 加 え た もの を作 成 し,こ れ を対 照 側 と した6.. と し た..

(5) PMA注. 入 側. 強 力 な 非 特 異 的PKC賦. 活 剤 で あ るphorbol-12-myristate-13-acetate(PMA,Sigma,St.Louis,. MO)1mgを1.6m1のdimethylsulfoxide(DMSO,和 solutionを. 作 成 し た.そ. 内 に 術 前3日,術. 光 純 薬)に. の0.8μ1を500μ1の. 溶 解. 生 理 的 食 塩 水 に 溶 解 し,20匹. 後3日,10日,17日,24日. し,1mmMのTPAstock. の ラ ッ トの 手 術 側 の 膝 関 節 腔. に 注 入 し た 。 そ して 何 も注 入 し て い な い 関 節 の 手 術 の み を. 行 っ た も の を 対 照 と し た.. 術 後3日,1,2,4週 し た4%パ. にPMA注. 入群. ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・0.2%ピ. れ ぞ れ 一 塊 と して 採 取 し,膝. 非 注 入 群 の 各 々5匹. ク リ ン酸 固 定 液(和. ず っ を,0.2Mリ. 光 純 薬)で. ン 酸(pH7.4)で. 潅 流 固 定 し た 後,両. 緩衝. 膝 関節 を そ. 関 節 を 中 心 に 肉 眼 的 観 察 お よ び 組 織 学 的 検 討 を 行 っ た.. 組織学的および組織化学的検討. 組織 学 的 検 討 潅 流 固 定 後,右 軟 骨 小 片 を,潅. 膝 関 節 の 脛 骨 内 側 部 の 荷 重 部 で 最 も圧 迫 を 受 け て い た 軟 骨 全 層 を 含 む よ う に 採 取 し た 流 固 定 に 用 い た の と 同 じ固 定 液 で4℃. 厚 さ1mm,縦2mm,横2mmに Na(和. 光 純 薬)で4℃. 細 切 し,さ. ら に,4℃. ンパ ウ ン ド(MilesInc)を 連 続 切 片 を 作 製 し た.形. の 後,こ. ・48時 間 浸 漬 固 定 し た.そ. ・1週 聞 脱 灰 した 。 試 料 を ク リ オ モ ル ド2号(テ. Elkhart,U.S)に0.C.Tコ トに て 約6μmの. ・24時 間 浸 漬 固 定 し た.そ. れ らの試料 を. して,5%EDTA-2. ィ シ ュ ー テ ッ ク⑭,MilesInc,. 満 た した 中 に 包 埋 し凍 結 さ せ,ク. 態 学 的 変 化 を ヘ マ トキ シ リ ン ・ エ オ ジ ン(H-E)染. 骨 基 質 に お け る グ リ コ サ ミ ノ グ リカ ン をS-0染. 色 で,光. リオ ス タ ッ 色 で,軟. 学 顕 微 鏡 に よ り観 察 し た.. 関節 軟 骨 変 化 に対 す る評 価 サ フ ラ ニ ンOは コ ー ル,キ. 軟 骨 中 に お け る コ ン ド ロ イ チ ン6一 硫 酸 お よ び ケ ラ タ ン硫 酸 と1対1の. シ レ ン を 通 し た 永 久 標 本 で はorthochromasiaに. と の 組 み あ わ せ に よ り,組. よ る 鮮 赤 色 を 呈 す る7.そ. ル. こ で,H-E染. 色. 織 学 的 ・組 織 化 学 的 評 価 基 準 に 従 っ て 関 節 軟 骨 の 変 性 を 評 価 し た.Mankin8. ら の 提 唱 し た 組 織 学 的 ・組 織 化 学 的 評 価 基 準 は,ヒ. ト変 形 性 関 節 症 の 評 価 に 用 い ら れ た も の で 構 造 の 項. 目 で 関 節 軟 骨 の 亀 裂 の 深 達 度 に つ い て の 評 価 も加 え られ て い た が,ラ 従 い,そ. 結 合 を し,ア. ッ トを 用 い た 本 研 究 で は 薩 摩 ら9に. れ ら の 項 目 を 表1の よ う に 簡 略 化 し て 用 い た.. ま た,各. デ ー タ は 平 均 値 ± 標 準 偏 差(mean±SD)で. 表 し,各. 側 間 の 値 の 差 は,student'st-testに. て. 検 定 し た.. 免 疫 組 織 学 的 検 討(Avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,ABC法) 作 製 し た6μmの ラ イ テ ス ク,大. 連 続 切 片 を 各 試 薬 の 組 織 へ の 浸 透 性 を 向 上 さ せ る た め に0.03%TritonX-100(ナ 阪)を. 含 む0.01Mphosphate-bufferedsalin(0.01MPBS-T)で. A. 洗 浄 し た.次. カ い で,.

(6) 組 織 の 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー一ゼ 活 性 を 抑 え る た め に,組 MPBS-Tで. 洗 浄 し た.そ. よ びc-junに. 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(ONCOGENESCIENCE,INC,NY,US)を200倍. こ れ と 室 温 ・1時 サ ギIgG血. し て1.5%正. 織 切 片 を0.3%H202に. 間 反 応 さ せ,さ. 清 と 室 温 ・1時. 室 温 ・30分 間 浸 漬 し,0.01. 常 ウ サ ギ 血 清 と 室 温 ・20分 聞 反 応 さ せ た.第1抗. ら に0.01MPBS-Tで10分. 希 釈 し,. 間 洗 浄 後,500倍. 間 反 応 さ せ た.0.01MPBS-Tで. 希 釈 ビ オ チ ン化 マ ウ ス 抗 ウ. 同 様 に 洗 浄 し た 後,ELITEABC試. (VECTORLABORATORIES,Burlingame,U.S)で30分. 間 反 応 さ せ0。01MPBS-Tで. れ をDAB-H202-Trisbuffer[3,3'diaminobenzidine・4HCI(和 衝 液75m1,30%H20215μ1/100m4]で. 室 温 ・5分 間 反 応 さ せ,蒸. 照 と し て は,1次. 薬. 洗 浄 し た.こ. 光 純 薬)20mg,0.05MTris緩 留 水 で 洗 浄 後,エ. シ レ ン で 透 徹 し,EUKITT⑪(0.KinderGmbH&Co,Freiburg,Germany)に 顕 微 鏡 で 観 察 し た.対. 体 と し てc.fosお. タ ノ ー ル で 脱 水,キ て 封 入 し た 後,光. 抗 体 に 非 免 疫 血 清(正. 常 ウ サ ギ 血 清)を. 使 用 し,他. 学. の操 作 はす. べ て 同 様 に 行 っ た 標 本 を 用 い た.. 結. 果. 肉眼的観察 対照側 術 後3日,1週,2週,4週. と もに,対 照 側 は何 れ の 個 体 で も大 腿 骨 お よ び 脛 骨 関 節 面 の 軟 骨 の 色 調. や 光 沢 に変 化 は認 め られ な か った.滑 膜 も同様 に明 らか な変 化 は な く,関 節 の 腫 脹 や 水 腫 も認 め ら れ な か った.. OA側 術 後3日 で は,軟 骨 表 面 に変 化 は見 られ ず,色 調 も正 常 で あ った.術 後1週. で は,軟. 骨表面 の光 沢. が や や失 わ れ て い た.術 後2週 で は,脛 骨 関 節 面 辺 縁 部 に お い て結 合 組 織 性 の増 殖 を認 め,滑 膜 は充 血 し 浮 腫 状 を 呈 し,関 節 面 の 光 沢 は失 わ れ て い た.術 後4週 で は脛 骨 関 節 面 辺 縁 部 に 肉 芽 組 織 性 の 増 殖 お よ び骨 棘 様 所 見 が観 察 され た.軟 骨 表 面 は明 らか に粗 とな り,不 整 が 認 め られ,こ. の よ うな 変 化 は荷 重 部. で あ る内 穎 中 央 部 で 著 明 に認 め られ た.. 組織学的所見. H-E染. 色所 見. 対照側 関 節 軟 骨 は 軟 骨 細 胞 の 形 態,配 (tangentiallayer),中. 間 層(transitionallayer),軟. お よ び 石 灰 化 層(calcifiedlayer)に (pericellularmatrix)と て 術 後4週 に 至 る ま で,軟. 列 や 軟 骨 基 質 の 状 態 か ら4層. 分 け られ た.さ. 軟 骨 基 質,軟. 節 面 か ら浅 層. 骨 細 胞 が 柱 状 に 配 列 す る 深 層(radiallayer) ら に,軟. 骨 細 胞 を 中 心 と し て 周 囲 に細 胞 周 囲 基 質. 細 胞 外 基 質(extracellularmatrix)が 骨細 胞. 構 造 が 認 め ら れ,関. 骨 細 胞 の 配 列,細. 一4一. 観 察 さ れ た.対. 照 側 で は荷 重 部 に お い. 胞 密 度 に お いて も著 明 な 変 化 を 認 め な.

(7) か っ た(図1-A).. OA側 術 後3日 対 照 側 と比 較 し て,組. 織 学 的 に は 著 明 な 変 化 を 認 め な か っ た(図1.B).. 術 後1週 肉 眼 的 に は軟 骨 表 面 に変 化 を認 め な か った が,組 織 学 的 に は既 に 軟 骨 最 表 層 は不 整 で 粗 造 化 が 認 め られ た.ま た,表 層 で は基 質 に対 す る細 胞 密 度 の増 加 が 認 め られ た(図1-C).. 術 後2週 表 層 軟 骨 の剥 離 が み られ るよ うに な り,細 胞 数 の減 少 と細 胞 の集 籏 傾 向 も認 め られ た.ま. た軟 骨 が. 軟 骨 下 骨 層 に ま で 陥没 して い る部 分 も認 め られ た(図1-D).. 術 後4週 浅 層 は 消 失 し中 間 層 の 一 部 は 減 少 した.ま. た,タ. イ ドマ ー ク は 不 整 で あ っ た.. 軟 骨 が 軟 骨 下 骨 層 に ま で 陥 没 して い る部 分 も認 め られ た(図1-E).. 図1脛. 骨 関 節 面 荷 重 部 の 組 織 像(H-E染 図1-A:対. 照 側(術. 図1-B:術. 後3日. 図1-C:術. 後1週. 図1・D:術. 後2週. 図1-E:術. 後4週. 後3日). 色 ×50). 術 後2週. と 同 様 に,.

(8) PMA注. 入 軟骨. 術 後3日 組 織 学 的 に は 著 明 な 変 化 を 認 め な か っ た(図2-A).. 術 後1週 術 後3日. と同 様 に,組. 織 学 的 に は 著 明 な 変 化 を 認 め な か っ た(図2-B).. 術 後2週 最 表 層 は 不 整 で あ り,表. 層 に 近 い 部 位 で は 基 質 に 対 す る 細 胞 密 度 の 増 加 が 認 め られ た(図2-C).. 術 後4週 最 表 層 は さ ら に 不 整 と な り,一. 図2PMA注. S-O染. 部 の 細 胞 に 集 籏 化 が 認 め られ た(図2-D).. 入 軟 骨 の 脛 骨 関 節 面 荷 重 部 の 組 織 像(H-E染 図2-A:術. 後3日. 図2-B:術. 後1週. 図2-C:術. 後2週. 図2-D:術. 後4週. 色 ×50). 色所見. 対 照側 S-0染. 色 標 本 に お い て 染 色 性 は 浅 層,中. 基 質 に 強 い 染 色 性 が 認 め られ た.ま (図3-A).観. 察 開 始 か ら術 後4週. た,深. 間 層 お よ び深 層 で 均 一 で あ り,特. に 深 層 の 細 胞 周 囲 ・細 胞 外. 層 の 深 部 か ら石 灰 化 層 で は 細 胞 周 囲 で 著 明 に 濃 染 し て い た. に 至 る ま で,こ. れ ら の 所 見 に 変 化 は認 あ ら れ な か っ た.. 一6一.

(9) OA側 術 後3日 表 層 の 染 色 性 が 低 下 して い た(図3-B).. 術 後1週 表 層 か ら浅 層 に お け る細 胞 数 の 増 加 に と も な っ て,細 た.ま. た,深. 胞 外 基 質 の 染 色 性 は 不 均 一 と な り低 下 して い. 層 に お け る タ イ ドマ ー ク 周 辺 部 の 細 胞 周 囲 ・細 胞 外 基 質 の 染 色 性 も低 下 し て い た(図3-. C).. 術 後2週 中 間 層 か ら深 層 で 染 色 性 の 低 下 は抑 え られ た が, 石 灰 化 層 で の 染 色性 の低 下 は一 層 著 明 と な っ た (図3-D).. 術 後4週 浅 層 は 消 失 して,軟 く認 め ら れ た.石. 骨 の 厚 さ は 著 明 に 減 少 し た.し. か し,深 層 に お け る細 胞 周 囲 基 質 の 染 色 性 は 強. 灰 化 層 の 幅 は 減 少 しっ っ あ り,細 胞 周 囲 ・細 胞 外 基 質 の 染 色 性 も低 下 し て い た(図. 3.E).. 図3脛. 骨 関 節 面 荷 重 部 の 組 織 像(S-0染 図3-A:対. 照 側(術. 図3-B:術. 後3日. 図3-C:術. 後1週. 図3.D:術. 後2週. 図3-E:術. 後4週. _7_. 後3日). 色 ×50).

(10) PMA注. 入軟 骨. 術 後3日 染 色 性 は 浅 層,中. 間 層 お よ び 深 層 ま で 均 一 で あ っ た(図4-A).. 術 後1週 術 後3日. と 同 様 に,染. 色 性 は 浅 層,中. 間 層 お よ び 深 層 ま で 均 一 で あ っ た(図4-B).. 術 後2週 染 色 性 は 浅 層 で 低 下 して い た(図4-C).. 術 後4週 中 間 層 で は 染 色 性 は 減 少 し,深 層 で は 細 胞 外 基 質 の 染 色 性 も低 下 して い た(図4-D).. 図4PMA注. 入 軟 骨 の 脛 骨 関 節 面 荷 重 部 の 組 織 像(S-0染 図4-A:術. 後3日. 図4-B:術. 後1週. 図4-C:術. 後2週. 図4-D:術. 後4週. 色 ×50). 関 節軟 骨 変 化 の 数 値 的 評 価 術 後3日. で は,OA側1.1±0.3(n=5)で. あ っ た が,PMA注. 週 に は,OA側. は3.4±0.5点. と増 加 し た が,PMA注. な る と,OA側. は4.4±0.4点. で あ っ た が,PMA注. は7.8±0.7点,PMA注. 入 側0.1±0.3点(p〈0.01)で. 入 側 は0.5±0.5点(p〈0.01)で 入 側 は3.4±0.5点(p〈0.01)と. 入 側 は4.3±0.4点(p〈0.01)と. な り,各. 有 意 に 抑 制 さ れ た.(図5). 一8一. 段 階 でOAの. あ っ た.術. あ っ た.1. な り,4週 進 行 はPMA注. 後2週. に. で はOA側 入 に よ って.

(11) 表1簡. 略化 した組 織 学 的 ・組 織 化 学 的評 価 基 準. 評価 基質 染 色 性. 4﹂ バ﹁. 丹 ﹂ 4. ラ ニ ン0の 常 度 減少 等 度減 少 度 減少. α 消失 IV.タ. -墨 ( ∠. a.正 b.血. 常 管 交差. 3. 慢 性 細胞数 増加 ロー ニ ン グ 胞 数減 少. イ ドマ ー ク. 0 14. ハU. 胞 乱 正常 h瀟 c.ク d.細. フ a.正 b.軽 c.中 d.高. ハU -盈 ( ∠. C.b+パ ンヌ ス d.亀 裂 形 成 e.完 全 破 壊. 皿.サ. 2. a.正 常 h表 面 不 整. 1. II.細. 造. 0. i.構. 評価. 一. 〇A側. 一 ◆一一PMA注 +一. 入側. 対照側. (mean±SD). 術後経過 (mean±SD). 図5簡. 略化 した組織学的評価基準による関節軟骨変化の経時的点数評価. 免疫 組 織 染 色 所 見 c-fos免 疫 染 色 対 照側 正 常,術 後3日,1週,. 2週,4週. と も に,. 全 くc-fos蛋. 白 陽 性 細 胞 は 認 め られ な か っ た(図6-A),. OA側 術 後3日 全層 の軟 骨 細 胞 核 内 お よび 細 胞 質 にc-fos蛋 白 の発 現 が 認 あ られ た(図6-B).. 一9一.

(12) 術 後1週 浅 層 か ら中 間 層 ま で 発 現 を 認 め た が,特. に 分 裂 集 籏 傾 向 の あ る細 胞 に 強 く認 め た(図6-C).. 術 後2週 浅 層 は 消 失 し,残. 存 す る 中 間 層 の 軟 骨 細 胞 にc-fos蛋. 白 の 発 現 が 認 め られ た(図6-D).. 術 後4週 中 間 層 の 軟 骨 細 胞 も ほ ぼ 消 失 し,残. 存 す る 深 層 軟 骨 細 胞 に はc-fos蛋. 白陽 性 細 胞 を認 め な か っ た. (図6-E).. 図6c-fos免. PMA注. 疫 組 織 染 色 所 見(ABC染. 図6-A:対. 照 側(術. 図6-B:術. 後3日. 図6-C:術. 後1週. 図6-D:術. 後2週. 図6-E:術. 後4週. 後3日). 入軟骨. 術 後3日 浅 層 ∼ 中 間 層 に か け てc-fos蛋. 白 の 染 色 性 を 認 め た(図7-A).. 術 後1週 浅 層 の みc-fos蛋. 白 の 染 色 性 を 認 め た(図7-B).. 一10一. 色 ×50).

(13) 術 後2週 c-fos蛋. 白 の 染 色 性 は 認 め ら れ な か っ た(図7-C).. 術 後4週 術 後2週. と 同 様 にc-fos蛋. 図7PMA注. c-jun免. 白 の 染 色 性 は 認 め られ な か っ た(図7-D).. 入 軟 骨 のc-fos免 図7-A:術. 後3日. 図7-B:術. 後1週. 図7・C:術. 後2週. 図7-D:術. 後4週. 疫 組 織 染 色 所 見(ABC染. 色 ×50). 疫染色. 対照側 正 常,術. 後3日,1週,2週,4週. と も に,全. くcjun染. 色 陽 性 細 胞 を 認 め な か っ た(図8-A). 。. OA側 術 後3日 全 層 の 軟 骨 細 胞 核 内 お よ び 細 胞 質 にc-lun蛋. 白 の 発 現 を 認 め た(図8-B).. 術 後1週 浅 層 か ら 中 間 層 ま でc-lun蛋. 白 の 発 現 を 認 め た が,特. 8.C).. 一11一. に分 裂 集 籏 傾 向 の あ る 細 胞 に 強 く 認 め た(図.

(14) 術 後2週 浅 層 は 消 失 し,残. 存 す る 中 間 層 の 軟 骨 細 胞 にc-jun蛋. 白 の 発 現 を 認 め た.(図8-D).. 術 後4週 組 織 学 的 に術 後4週. で は 中 間 層 も ほ ぼ 消 失 し,残. 存 す る 深 層 軟 骨 細 胞 にc-jun蛋. 白陽性細 胞 を認 め. な か っ た(図8-E).. 図8c-jun免. 考. 疫 組 織 染 色 所 見(ABC染. 図8-A:対. 照 側(術. 図8-B:術. 後3日. 図8-C:術. 後1週. 図8-D:術. 後2週. 図8-E:術. 後4週. 色 ×50). 後3日). 察 多 細 胞 生 物 に お い て,個. す.そ. の ひ と つ と して,細. 々の 細 胞 はそ の微 小 環 境 や外 界 の 変 化 に応 答 して 細 胞 内 に 遺 伝 子 発 現 を きた 胞 の 増 殖 や 分 化 を 誘 導 す るtumorpromotingagentsの. た だ ち に超 初 期 遺 伝 子 群(immediateearlygenes)と 回 検 討 したc-fosやc-junは. ウ ス に 骨 肉 腫 を 起 こ すFBJ-MuSV,な れ た が ん 遺 伝 子,v-fosとv-junの. 胞 は. 呼 ば れ る 遺 伝 子 群 の 一 過 性 の 発 現 を き た す1免 今. 超 初 期 遺 伝 子 群 に 含 ま れ て お り,こ. (serumresponseelement)を. 刺 激 に よ り,細. れ らの 発 現 は エ ン ハ ン サ ー で あ るSRE. 介 して 生 じ る こ と が 知 られ て い る'1.c-fosお. よ びc-junは,そ. ら び に ニ ワ ト リに 線 維 肉 種 を 起 こ すASV17の 細 胞 染 色 体 上 の 対 応 遺 伝 子 と し て 単 離 さ れ,現. れぞれ マ. ゲ ノ ム 中 に見 出 さ 在 ど ち らの 遺 伝 子 も そ. れ ぞ れ 別 の 遺 伝 子 フ ァ ミ リー に 属 して い る こ と が わ か っ て い る1礼 ま た,c-fos,c-jun遺. 伝 子 は細 胞 増 殖. 遺 伝 子 と して 胎 生 期 の 骨 軟 骨 組 織 の 分 化 発 生 に 関 与 し'3・'4,外的 刺 激 に 反 応 して 最 初 に 発 現 が 誘 導 さ れ る. 一12一.

(15) 遺 伝 子 群 の 代 表 と 考 え られ て い る1鎚c-fos,c-lun遺 テ ロ2量. 体 を っ く り,DNAに. 伝 子 の 産 物 で あ るc-fos蛋. 結 合 し,転 写 活 性 因 子AP-1と. 白,c-jun蛋. 白 は,ヘ. して 転 写 制 御 に 関 わ っ て お り17,こ. れ まで. こ れ らの 遺 伝 子 は 細 胞 増 殖 と関 連 す る と考 え られ て き た. 当 教 室 の 西 岡 ら は 骨 芽 細 胞(HT-3cel1)に. メ カ ニ カ ル ス ト レ ス と し て 周 期 的 牽 引 力 を 加 え,そ. 殖 お よ び 分 化 能 の 充 進 が 起 こ る こ と を18,ま. た 斎 藤 ら は こ の 際c-fosが. 発 現 す る こ と を 報 告 し た19.戸. ら は ウ サ ギ と ラ ッ トの 仮 骨 延 長 を 行 い 仮 骨 形 成 モ デ ル を 作 成 し,c-fosの た.仮. 骨 形 成 部 に 伸 長 と い う メ カ ニ カ ル ス ト レ ス を 加 え る こ と に よ り,未. 細 胞 にc.fosが. 発 現 し,骨. の こ と か ら,本. 研 究 で は,動. の増. 発 現 をmRNAレ. 谷. ベ ルで検 索 し. 熟 骨 へ 移 行 す る未 分 化 間 葉 系. 芽 細 胞 へ の 分 化 の み な ら ず 軟 骨 細 胞 の 分 化 も惹 起 さ れ る と 報 告 し た2°.こ れ ら 揺 関 節 に よ る 異 常 な メ カ ニ カ ル ス ト レ ス が 軟 骨 組 織 にc-fos,c-jun蛋. 白の. 発 現 を も た ら し た と い え よ う. 最 近c-fos遺. 伝 子 が 過 剰 発 現 す る と 関 節 軟 骨 の 破 壊 に っ な が る可 能 性 が 報 告 さ れ,そ. の 発 現 がOAに. お け る 軟 骨 変 性 に な ん ら か の 形 で 関 与 す る の で は な い か と い う可 能 性 が 示 唆 さ れ た21・2礼す な わ ち,c-fos 発 現 が 未 熟 軟 骨 細 胞 の 増 殖 を 促 し基 質 の 未 熟 さか ら 関 節 破 壊 に っ な が る と い う 可 能 性21,あ 遺 伝 子 の 発 現 が 蛋 白 分 解 酵 素 系 のmatrixmetalloproteinases-3(MMP-3)を inhibitorofmetalloproteinase-1(TIMP-1)を. る い はc-fos. 活 性 化 し,tissue. 不 活 性 化 す る こ と に よ り 基 質 破 壊 を 促 し,関. に っ な が る と い う考 え な ど で あ る2礼 ま た 最 近 に な り,c-fos蛋. 白,c-jun蛋. 節破壊. 白 が 肝 細 胞 に お い て ア ポ トー. シ ス 発 現 に も関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て お り23,こ れ が 軟 骨 破 壊 に 関 与 し て い る 可 能 性 も考 え られ る. しか し,こ. れ ら は 培 養 細 胞 を 用 い た 加 眈roの. と期 待 さ れ る`几 伽oに. 形性 関節症 の根 本 的 な治 療 にっ なが る. お け る軟 骨 基 質 の 変 性 過 程 の 動 的 変 化 をc-fos,c-jun遺. て 観 察 した 報 告 は こ れ ま で な か っ た.そ c-lun蛋. 研 究 で あ り,変. の た め,本. 伝 子 の発 現 と関連 させ. 研 究 で は ラ ッ ト実 験 的 関 節 症 モ デ ル を 作 製 し,c-fos,. 白 の 関 節 内 に お け る経 時 的 局 在 変 化 を 免 疫 組 織 学 的 に 観 察 し た 。 ま た,軟. サ フ ラ ニ ンO染. 色 性 か らGAGの. 骨 基 質 量 の指 標 で あ る. 経 時 的 局 在 変 化 を 比 較 す る こ と に よ り,c-fos,c-lun蛋. 白の軟 骨 代 謝. へ及 ぼ す 影 響 を 検 討 した. そ の 結 果,動. 揺 関 節 に よ る 異 常 な メ カ ニ カ ル ス ト レ ス に 対 応 して,C-fOS,C-jun蛋. 壊 に先 立 ち 強 く認 め ら れ た.ま. た,c-fos,c-lun蛋. れ らの 結 果 は,c-fos,c-junが. 軟 骨 細 胞 の 分 裂 増 殖 を 刺 激 す る,ま. テ オ グ リ カ ン(PG)の. 分 解 を 刺 激 す る,あ. 白 の発 現 が軟 骨 破. 白 の 発 現 に と も な い,S-0の. 染 色 性 が 低 下 し た.こ. た 蛋 白分 解 酵 素 系 を 介 して 直 接 プ ロ. る い は また 分 裂 増 殖 した軟 骨 細 胞 の 中 に は散 発 的 に他 の 細 胞. と 比 較 し て 小 さ く核 の 濃 縮 を 生 じて い る様 な 像 も認 め ら れ,こ. れ らが ア ポ トー シ ス を き た して い る可 能. 性 を 示 唆 す る も の で あ る. 軟 骨 変 性 の 過 程 に お い て,軟 の 宮 城 ら は,軟. 骨 基 質 は そ の 構 成 要 素 に 動 的 な 変 化 が 生 じ て い る と 考 え ら れ る.当. 骨 欠 損 を 生 じた 場 合,そ. の周 囲 の 関 節 軟 骨 細 胞 が メ カ ニ カ ル ス トレ ス に対 応 して 欠 損 後. 30分 で 多 量 のnitricoxide(NO)やsuperoxide(SO)と. い っ た ガ ス メ デ ィ エ ー タ ー を 放 出 し,こ. が 関 節 軟 骨 の 修 復 を 妨 げ る 危 険 因 子 と して 作 用 し て い る と 報 告 し た24.宮 やc-fos,c-lun蛋. 白 発 現 の 前 にNOやSOが. 教室. 城 の 報 告 と 本 研 究 か ら,PKC. 放 出 さ れ て い る こ と が 推 測 さ れ る.し. 節 症 モ デ ル に お け る メ カ ニ カ ル ス ト レ ス に よ り,ま. ずNOやSOが. 一13一. れ ら. 産 生 さ れ,そ. た が っ て,変. 形性関. れ に よ りPKCやc-fos,.

(16) c,lunが. 発 現 し た と 考 え ら れ る.. っ い で,secondarymessengerで. あ るPKCの. 遺 伝 子 へ の 働 き か け に つ い て 検 討 し た.当 ル を 作 製 し,PKCサ が,変. 変 形 性 関 節 症 発 症 と 進 行 へ の 関 与 と,PKCのc-fos. 教 室 の 薩 摩 ら は 今 回 と 同 じ ラ ッ トを 用 い た 実 験 的 関 節 症 モ デ. ブ タ イ プ の 出 現 を 観 察 し て い る2へ そ の 結 果,正. 形 性 関 節 症 の 術 後5日. 目 か ら浅 層 か ら 中 間 層 の 軟 骨 細 胞 に 出 現 し,中. 胞 に お い て そ の 発 現 が 認 め られ た.一. 方,正. 骨 変 性 の 進 行 と と も に α 一PKCと. 染 色 性 も徐 々 に 深 層 肥 大 細 胞 へ と 移 動 す る こ と を 観 察 し た.ま. ル を 作 成 し,今. 回 の 実 験 と 同 じ よ う にPMAを. る ε一PKCで. 常 軟 骨 に 存 在 し,変. あ る と 考 え ら れ る,今. 発 現 を 観 察 し た と こ ろ,PMA注. 回,ラ. 活 性 化 と α 一PKC活. 以 上 ま と め る と,OAの NO,SOを. 誘 導 し,軟. 同 じよ うに. 西 ら は ウ サ ギOAモ. デ. 節 症 の進 行 を ほぼ完 全. 形 性 関 節 症 の 初 期 に そ の 発 現 量 が 正 常 軟 骨 に 比 し著 明 に 充 進 す ッ ト関 節 症 モ デ ル の 膝 関 節 内 にPMAを. 入 群 で は 非 注 入 群 と比 較 し てc-fosの. 性 の 抑 制 が,c-fos蛋. れ て 軟 骨 基 質 が 保 護 さ れ,メ. 節. 中 で 変形 性 関 節 症 の 進 行 を 防 ぐ役 割 を主 に果 た. 症 モ デ ル と 同 じ く変 形 性 関 節 症 の 発 症 お よ び 進 行 は 抑 制 さ れ た.こ PKCの. た,浜. 関 節 内 に投 与 す る こ と に よ り,関. に 抑 制 す る こ と が で き る こ と を 報 告 し た2軋 各 種PKCの し て い る も の は,正. 期 に は深 層 の 集 籏 化 した 細. 常 軟 骨 で は 浅 層 と 中 間 層 で 認 め れ ら れ る ε一PKCは,関. 症 軟 骨 で は そ の 発 現 量 が 正 常 軟 骨 に 比 し著 明 に 充 進 し,軟 ε.PKCの. 常 軟 骨 細 胞 に は 存 在 しな い α 一PKC. 注 入 し てc-fos蛋. 発 現 は 抑 制 さ れ,ま れ ら はPKCの. 白 の 発 現 を 抑 制 し,結. 白の. た ウサ ギ 関 節. 活 性 化,お. そ ら くひ. 果 的 に プ ロ テ オ グ リカ ン が 保 た. カ ニ カ ル ス ト レ ス に よ る 軟 骨 破 壊 が 緩 和 さ れ た こ と を 示 唆 し て い る.. 発 症 と 進 行 の メ カ ニ ズ ム と し て,異 骨 細 胞 のPKC,特. に α 一PKCを. 軟 骨 組 織 を 変 性 に い た ら し あ る も の と 考 え られ る.こ. 常 な メ カ ニカ ル ス トレスが軟 骨細 胞 よ り. 活 性 化 し,c-fos蛋 の よ う に,今. 白,c-iun蛋. 白 を 発 現 さ せ,. 回 の 研 究 に よ り変 形 性 関 節 症 の発 症. と進 行 の メ カ ニ ズ ム の 一 端 が 明 ら か に な っ た.. 謝. 辞 稿 を 終 え る に あ た り,御 指 導,御 校 閲 を い ただ い た田 中 清 介教 授,ま. 全 般 に わ た り直 接 御 指 導,御 助 言 を 頂 い た浜 西 千 秋助 教授,な. た本 研 究 を 遂 行 す る に あ た っ て. らび に 御 協 力 い た だ い た 教 室 の 諸 先 生 方. に深 謝 致 します. 本 研 究 の要 旨 は第12回 日本 整 形 外 科 学 会 基 礎 学 術 集 会(平 成9年10月17日,新. 潟)に. お い て 発 表 し た..

(17) 文 1. 献 Ehrlich. •. MG, Houle. cartilage 2. Dean. •. PA, Vigliani. collagenase. activity. DD, Pelletier. JM,. metalloproteinase cartilage. 3. 4. 5. A, Lindberg. orthop. Scandinav. Telhag. H, Lindberg. •. knees.. Clin Orthop. Telhag. H (1972). •. Clin Okhop Myers. 6. DS, Woessner. inhibitor. 21 : 761-766. JrJF. imbalance. articular. (1989). in human. Evidence. for. osteoarthritic. 84 : 678-685. Mitosis. H ( 1970). Experimental. for inducing. of chondrocytes. KD,. changes. L (1971). HJ,. O'Conner. osteoarthritis. osteoarthritic. in experimental. basis. J Bone Joint. Dorfman. DM,. in. rabbits.. chages. Act. in rabbits'. "Osteoarthritis". Albrecht. cartilage Arthritis. ME. after Rheum. the histological. in rabbits.. (1990). anterior. Synovitis. cruciate. and. ligament. 33 : 1406-1415. use of safranin. 0 in the study. of. Surg 53-A : 69-82. H, Lippiello cartilage. with biochemical. 博(1996)ラ. articular. hemostasis.. Chemical. in articular. morphology. BL, Visco. in canine. of surgical. cartilage.. abnormalities. C)の. Rheum. between. 86 : 214-223. Rosenberg. 摩. Arthritis. Howell. L (1972) A method. : effect. 9.薩. Correlation. 41: 522-530. transection. Mankin. ( 1978). 86 : 224-229. osteoarthritic. 8. JP,. metalloproteinase. L, Telhag. SL, Brandt. articular. HJ. and osteoarthritis.. Pelletier. J Clini Invest. Hulth. •. 7. and. G, Mankin. L, Zarins from. A. ( 1971 ). osteo-arthritic. and metabolic. data.. Biochemical. human. J Bone Joint. and. metabolic. hips 11. correlation Surg. 53-A. of. 523-537. ッ ト変 形 性 関 節 症 モ デ ル を 用 い た 関 節 軟 骨 に お け る プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼC(PK. 免 疫 組 織 学 的 研 究.近. 11.吉. 田 哲 郎,鈴. 木 健 之,伊. 12.伊. 庭 英 夫,亀. 田隆. 畿 大 医 誌21:209-220. 庭 英 夫(1990)増. 村 上 政 男(1994)細. 殖 刺 激 に 応 答 す る 癌 遺 伝 子.実. 験 医 学81191-198. 胞 の トラ ン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン に お け るAP4の. 機 能.実. 験. 医 学12:822-828 13.. Sandberg. M, Vuorio. T, Hirvonen. TGF-. and. mRNA. Development 14.. Sandberg. c-fos. I , III, and IV collagen,. 15.. Greenberg c-fos. the. K, Vuorio. growth. plate. of. E (1988) Enhanced developing. human. expression long. of. bones.. 102 : 461-470. M, Autio-Harmainen. Development. in. H, Alitalo. H, Vuorio E (1988) Localization. TGF- /3 1 and c-fos genes. in developing. of the expression human. calvarial. of type bones.. Bio 130: 324-334 ME, Ziff EB (1984) Stimulation. proto-oncogene.. Nature. of 3 T 3 cells induces. 311 : 433-438. — 15—. transcription. of the.

(18) 16.. Kruijer induces. W, Cooper. JA,. Hunter. rapid but transient. T, Verma. expression. 17. Chiu R (1988) Fos-associated. cellular. Im.. (1984). Platelet-derived. of the c-fos gene and protein. p39 is related. nuclear. growth. Nature. transcription. factor. 312 : 711-716. factor. AP-1. •. Cell 54 : 541-552 18.西. 岡 栄 恵(1993)骨. 芽 細 胞 に お け るALP活. 与 お よ び 周 期 的 牽 引 の 影 響.近 19.斎. 藤 政 克,福 す る 影 響.日. 田 寛 二,西. 20.戸. 性 と そ の 細 胞 内 調 節 機 構:プ. ロ テ イ ン キ ナ ー ゼCの. 関. 畿 大 医 誌18:149-161. 岡 栄 恵,田. 中 清 介(1993)骨. 芽 細 胞 に 対 す る 周 期 的 牽 引 力 のc-Fos発. 現 に対. 整 会 誌67:1614. 谷 由 樹(1994)仮. 骨 延 長 に お け る骨 基 質 蛋 白の遺 伝子 発 現. 21. Wroblewski J, Edwall-Arvidsson factor on chondrocyte 22. Tsuji M,Funahashi. C (1995) Inhibitory. differentiation.. S, Takigawa. fos gene inhibits proteoglycan. 近 畿 大 医 誌19:553-572. effects of basic fibroblast. growth. J Bone Miner Res 10 : 735-742. M, Seiki M, Fujii K, Yoshida T (1996) Expression synthesis in transfected. chondrocyte.. of c-. FEBS Letters. 381 :. 222-226 23. Hu L, Hatano apoptosis 24宮 25.. 26.. M, Ruether. Satsuma. H, Saito. isozymes. of protein. articular. cartilage.. Hamanishi. 540-544. of c-Fos. induces. of CD43± pro-B cells. J Immunol 3804-3811. 城 一 郎(1996)ウ. inhibits. U, Tokuhisa T (1996) Overexpression. サ ギ 関 節 軟 骨 欠 損 と フ リー ラ ジ カ ル.近. N, Hamanishi kinase. progression. M, Tanaka. C in the chondrocytes. Calcif Tissue. C, Hashima. C, Hashima. 畿 大 医 誌21:249-262. S (1996). in normal. and. Alpha early. and. epsilon. osteoarthritic. Int 58: 192-194. M, Satsuma. of osteoarthritis. H, Tanaka. S (1996). induced in rabbit. Protein. knee joints.. kinase. C-activator. J Clin Lab Med 127 :.

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