• 検索結果がありません。

No v e l  aptamer t o   v on W i l l e b r a n d   f a c t o r  A  1  domain ( T   AGX‑0004) show s  t o t a l  i n h i b i t i o n  o f  thrombus  f o r mation supe r i o r  t o  ARC  1 7 7 9  and 

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

シェア "No v e l  aptamer t o   v on W i l l e b r a n d   f a c t o r  A  1  domain ( T   AGX‑0004) show s  t o t a l  i n h i b i t i o n  o f  thrombus  f o r mation supe r i o r  t o  ARC  1 7 7 9  and "

Copied!
36
0
0

読み込み中.... (全文を見る)

全文

(1)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n  3 

H a e r n a t o l o g i c a   HAEMATOL/2019/235549 

Version 3 

No v e l  aptamer t o   v on W i l l e b r a n d   f a c t o r  A  1  domain ( T   AGX‑0004) show s  t o t a l  i n h i b i t i o n  o f  thrombus  f o r mation supe r i o r  t o  ARC  1 7 7 9  and 

compa r a b l e  t o  c a p l a c i z u mab 

K a z u y a  S aka i ,  T a t s u h i k o  Some y a ,  K a o r i  Harada, Hideo Y a g i ,  Taei  M a t s u i ,  and Masanori Matsumoto 

D i s c l o s u r e s :  M. M. i s  a  member o f  an a d v i s o r y  board o f  S a n o f i .  T . S .  and K.H .  are 

employees o f  TAGCyx B i o t e c h n o l o g i e s ,  I n c .  Other a u t h o r s  d e c l a r e  no competing f i n a n c i a l   i n t e r e s t s .  

Con t r i b u t i o n s :  K . S ,  T . S ,  K.H ,  and T.M performed experiments and wrote t h e  paper .  H.Y 

designed t h e  study and analyzed t h e  d a t a .  M . M designed t h e  r e s e a r c h  and wrote t h e  

p a p e r .  

(2)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549  Ve r s i o n  3 

H a e m a t o l o g i c a   A r t i c l e  

Novel aptamer t o  von羽1 i l l e b r a n dfactor  Al  domain  (TAGX ・ 0 0 0 4 )

shows t o t a l  i n h i b i t i o n  of thrombus formation superior to  ARCl  779 

and comparable  t o   caplacizumab 

Kazuya S a k a i , 1  T a t s u h i k o   S o m e y a , 2  K a o r i  H a r a d a 2 ,  H i d e o  Y a g i , 1   T a e i  M a t s u i , 3  and  M a s a n o r i  Matsumoto  1 

1 D e p a r t m e n t  o f  Blood T r a n s f u s i o n  M e d i c i n e

NaraMed i c a l   U n i v e r s i t y ,  K a s h i h a r a ,   J a p a n ;  

. .

  TAGCyx  B i o t e c h n o l o g i e s   I n

Tokyo , J a p

3 C l i n i c a l  L a b o r a t o r y   M e d i c i n e ,  F 可 i t aH e a l t h  U n i v e r s i t y  S c h o o l  o f   M e d i c a l  S c i e n c e s ,   T o y o a k e ,   J a p a n  

Running  t i t l e :  Novel DNA  a p t a m e r  t a r g e t i n g   VWFAl domain 

C o r r e s p o n d e n c e :  

M a s a n o r i  Matsumoto ,  MD,  P h D 

P r o f e s s o r  o f  D e p a r t m e n t  o f  Blood T r a n s f u s i o n  M e d i c i n e   Nara M e d i c a l   U n i v e r s i t y  

840  S h i j y o ‑ c h o ,   K a s h i h a r a   c i t y ,  Nara  6 3 4 ‑ 8 5 2 2 ,  J a p a n  

Word  c o u n t s :  A b s t r a c t s  249 words  T e x t   body  3402  words  Number o f  r e f e r e n c e s :  3 0  

Number o f

白伊

1 ・ e s : 6 

Number  o f  s u p p l e m e n t a r y 五 l e : I 

(3)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n  3 

ABSTRACT 

von W i l l e b r a n d  f a c t o r  (VWF) i s   a  b l o o d  g l y c o p r o t e i n  t h a t  p l a y s  an  i m p o r t a n t   r o l e  i n   p l a t e l e t  t h r o m b u s  f o r m a t i o n  t h r o u g h  i n t e r a c t i o n  b e t w e e n  i t s   Al domain and p l a t e l e t   g l y c o p r o t e i n  l b .   ARCl  7 7 9 ,  an a p t a m e r  t o   t h e  VWF  Al d o m a i n ,  was e v a l u a t e d  i n  a  c l i n i c a l

a lf o r  a c q u i r e d  t h r o m b o t i c  t h r o r n b o c y t o p e n i c   p u r p u r a   ( a T T P ) .  S u b s e q u e n t l y ,  c a p l a c i z u m a b ,  a n   anti‑VWF  A  1  domain n a n o b o d y ,   was a p p r o v e d   f o r  aTTP  i n  E u r o p e   and t h e   U n i t e d   S t a t e s .   We  r e c e n t l y  d e v e l o p e d  a  n o v e l  DNA  a p t a m e r ,  TAGX‑0004,  t o  t h e   VWF  Al d o m a i n ;  i t   c o n t a i n s   a n   a r t i f i c i a l  b a s e  a n d  d e m o n s t r a t e s  h i g h  a

n i t yf o r  VWF. 

To c o m p a r e  t h e   e f f e c t s   o f  t h e s e  t h r e e  a g e n t s  on VWF Al, t h e i r  a b i l i t y  t o   i n h i b i t   i i s t o c e t i n

o r b o t r o c e t i n ‑ i n d u c e d   p l a t e l e t   a g g r e g a t i o n   u n d e r   s t a t i c   c o n d i t i o n s   w

a n a l y z e d ,   a n d  t h e   i n h i b i t i o n   of t h r o m b u s   f o r m a t i o n   u n d e r  h i g h   s h e a r   s

e s swas 

i n v e s t i g a t e d  i n  a  m i c r o c h i p  f l o w  chamber s y s t e m .   I n   b o t h   a s s a y s ,  TAGX ・ 0 0 0 4showed 

s t r o n g e r   i n h i b i t i o n   t h a n   ARCl  7 7 9 ,   a n d   had  c o m p a r a b l e   i n h i b i t o r y   e f f e c t s   t o  

c a p l a c i z u m a b .

i eb i n d i n g  s i t e s   o f  TAGX

0004a n d  ARCl  7 7 9  were a n a l y z e d  wi t h  

s u r f a c e   p l a s m o n  r e s o n a n c e  p e r f o n n e d  u s i n g  a l a n i n e  s c a n n i n g  m u t a g e n e s i s  o f  t h e   VWF 

Al  d o m a i n .   An  e l e c t r o p h o r e t i c   m o b i l i t y  s h i f t  a s s a y  showed  t h a t  R1395  and  R1399 i n  

t h e  Al domain bound t o   b o t h  a p t a m e r s .  R 1 2 8 7 ,  K l 3 6 2 ,  a n d  Rl392 c o n t r i b u t e d  t o  

ARCl  7 7 9   b i n d i n g ,  a n d  F1366 was e s s e n t i a l   f o r  TAGX‑0004 b i n d i n g .  Smface  p l a s m o n  

r e s o n a n c e  a n a l y s i s  o f  t h e  b i n d i n g  s i t e s  o f  c a p l a c i z u m a b  i d e n t i f i e d  f i v e  amino  a c i d s  i n  

t h e  VWF Al domain ( K l 3 6 2 ,   Rl392 ,  R l 3 9 5 ,  R l 3 9 9 ,  a n d  Kl406 ) . 百 i e s er e s u l t s  

s u g g e s t e d

i a t TAGX‑0004  p o s s e s s e d   b e t t e r   p h a r m a c o l o g i c a l   p r o p e r t i e s   t h a n  

c a p l a c i z m n a b  i n  v i t r o  a n d  m i g h t   be  s i m i l a r l y   p r o m i s i n g   f o r  aTTP  t r e a t m e n t .  

(4)

H a e m a t o l o g i c a   HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n  3 

I n t r o d u c t i o n  

von  W i l l e b r a n d  f a c t o r  (VWF) i s   a  l a r g e   m u l t i m e r i c  p l a s m a   g l y c o p r o t e i n   t h a t  p l a y s  a n   e s s e n t i a l  r o l e  i n  t e t h e r i n g  c i r c u l a t i n g  p l a t e l e t s  t o  damaged e n d o t h e l i a l   c e l l s . 1  I n t e r a c t i o n   b e t w e e n   t h e  VWF  Al  domain and  t h e  p l a t e l e t  g l y c o p r o t e i n  ( G P )  l b  r e c e p t o r  l e a d s  t o   r a p i d  d e v e l o p m e n t  of VWF‑rich  p l a t e l e t  t h r o m b i ,  t h u s  p r e v e n t i n g

r t h e rb l e e d i n g . 2   A l t h o u g h  n o r m a l  a m o u n t s  o f   VWF  a r e  u s u a l l y  h e l p f u l  i n   h e m o s t a s i s   r e a c t i o n s ,  s e v e r a l   VWF‑mediated d i s e a s e s ,  s u c h   a s  a c u t e  c o r o n a r y  syndrome

工,

4c e r e b r a l  i n f a r c t i o n , 5   and  t h r o m b o t i c  t h r o m b o c y t o p e n i c  pu

u r a ( T T P ) , 6   d e m o n s t r a t e   r e m a r k a b l y  e l e v a t e d  plasma  l e v e l s  o f   VWF. I n h i b i t i n g  V

T F a c t i v i t y   by  b l o c k i n g  i t s   Al domain h a s   r e c e n t l y  been  d e m o n s t r a t e d   t o  be 

印 刷

r a c t i v et h e r a p e u t i c  t a r g e t   i n   t h e s e  a r t e 1 i a l  t h r o m b o s e s . 1 ‑ 1 0  

C a p l a c i z u m a b  ( A b l

i x ) , an anti‑VWF  Al  humanized n a n o b o d y ,   1 1 '   1 2   was  a p p r o v e d   by  t h e  E u r o p e a n  M e d i c i n e s  Agency i n   2018 and by  U n i t e d  S t a t e s   Food a n d  Drug  Adm i n i s t r a t i o n  i n   2019 f o r   t r e a t m e n t  o f  a c q u i r e d  TTP ( a T T P ) .   The a nti‑VWF Al  a p t a m e r  ARC  1 7 7 9  ( A r c h e m i x )   was  d e v e l o p e d  a s   a n  a n t i t h r o m b o t i c  a g e n t  f o r  u s e  i n   p a t i e n t s   w i t h   a T T P ,   a n d   i t   showed s u f f i c i e n t   i n h i b i t o r y   e f f e c t s  on  VWF  a c t i v i t y  w i t h o u t   any s e v e r e  b l e e d i n g  e v e n t s  i n  a  r a n d o m i z e d  c o n t r o l  t r i a l .   1 3  However, ARCl  7 7 9  h a s  n o t   y e t   b e e n   a p p r o v e d  f o r   t h e   t r e a t m e n t   o f  VWF‑mediated t h r o m b o s i s .   We  r e c e n t l y   g e n e r a t e d  a  n o v e l   DNA  a p t a m e r ,  TAGX‑0004

,出

a t c o n t a i n s  t h e  a r t i f i c i a l   h y d r o p h o b i c   b a s e  7 ‑ ( 2

t h i e n y l ) i m i d a z o [ 4  , 5

b ] p y r i d i n e( D s ) ;  t h i s   a p t a m e r  t a r g e t s   huma n VWF  A l  w i t h  veηhigh  a

n i t y ( K v =  6 1 . 3  pM) a n d  s p e c i

c i t y . 1 4

I n  t h i s  s

d y ,we compared TAGX

0 0 0 4 ,ARCl  7 7 9 ,  and c a p l a c i z u m a b   i n  t e r m s  of 

t h e i r   i n h i b i t o r y   e f f e c t s   on  VWF a c t i v i t y ,  by p e r f o n n i n g   c o n v e n t i o n a l   p l a t e l e t  

a g g r e g a t i o n   a s s a y s ,  r i s t o c e t i n ‑and  b o t r o c e t i n ‑ i n d u c e d   p l a t e l e t  a g g r e g a t i o n   a s s a y s  ( R I P A 

and  B I P A ,   r e s p e c t i v e l y ) ,  and  s h e a r ‑ s t r e s s ‑ i n d u c e d   a g g r e g a t i o n   a s s a y s  u s i n g   t h e  

(5)

l a e m a t o l o g i c aHAEMA  TOυ2019/235549 V e r s i o n  3 

m i c r o c h i p  f l o w  chamber s y s t e m   ( 下 TAS R ) . 1 5To a s s

st h e  a

n i t yand b i n d i n g  s i t e s  of  t h e  two a p t a m e r s ,  we  p e r f o n n e d   b i o p h y s i c a l   i n t e r a c t i o n   a n a l y s i s  a n d  a l a n i n e  s c a n n i n g   mutagen e s i s   o f   t h e  VWF  Al d o m a i n .  I n  add i t i o n ,  we a n a l y z e d  t h e  b i n d i n g  s i t e s   o f   c a p l a c i z u m a b  u s i n g   s u r f a c e   p l a s m o n   r e s o n a n c e   ( S P R ) . 

1 e t h o d s

D e t a i l e d   o f  m a t e r i a l s  a n d   m e t h o d s  a r e  p r e s e n t e d  i n  t h e   Su p p l e m e n t a l  i n f o n n a t i o n .  

Sourc e s  of  n u c l e o s i d e ,  o l i g o n u c l e o t i d e s ,  n a n o b o d y ,

αnd  p r o t e i n 

The  a i i i f i c i a l   n u c l e o s i d e   t r i p h o s p h a t e   ( d D s T P )   w a s   s y n t h e s i z e d   a s   d e s c r i b e d   p r e v i o u s l y   1 . ・ 6 1 7 百 i eo l i g o n u c l e o t i d e s  TAGX‑0004 and  ARC l  7 7 9  ( w i t h o u t  p o l y e t h y l e n e   g l y c o l  [ P E G ] )  w e r e  s y n t h e s i z e d  by  a nd p u r c h a s e d  f r o m  Ge n eDes i gn ,  I n c .   ( O s a k a ,   J a p a n ) .  The o l i g o n u c l e o t i d e  s e q u e n c e  ofTAGX‑0004 ( a s  R n ‑ D s D s ‑ 5 l m h 2 ) 1 4  and  t h a t  o f   ARCl  7 7 9 1 8  were  r e p o r t e d  p r e v i o u s l テ Thea n t i ‑ h u m a n  VWF nanobody  c

l a c i

mab ( a s   TAB

2 3 4 )was p u r c h a s e d

omC r e a t i v e ‑ B i o l a b s   ( N Y ,  USA ) .  The r e c o mbin a n t   human  VWF  Al domain p r o t e i n  was  p u r c h a s e d   f r o m   U‑P r o t e i n   E x p r e s s   B V  ( U t r e c h t ,  N e t h e r l a n d s ) ,  a n d  u s e d   f o r   t h e   m e a s u r e m e n t   of b i n d i n g   a

n i t y t o  a n t i

human V W F  Al  a g e n t s  u s i n g  SPR. 

A l a n i n e ‑ s c a n n i n g  m u t a g e n e s i s  

Based on  p r e v i o u s  r e p o r t s   t h a t   d e s c r i b ed  t h e  i n t e r a c t i o n  b e t w e e n  VWF  A  1  a nd 

G P i b , 1 9  b o t r o c e t i n , 2 0  o r  ARC1172 , 2 1  we  d e s i g n e d  1 6  a l a n i n e ‑ s u b s t i t u t e d  m u t a n t s  o f  t h e  

human V

l F Al domain  ( R l 2 8 7 ,  K1312 ,  R l 3 3 4 ,   R13 3 6 ,  Kl34 8 ,  K 1 3 62 ,  Fl366 ,  Kl371 , 

(6)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n  3 

El376

R l 3 9 2 ,R l 3 9 5 ,  R l 3 9 9 ,  Kl406, Kl423, Rl426 ,  a n d  K l 4 3 0 ) .  T h e s e  m u t a n t   p r o t e i n s  were g e n e r a t e d  u s i n g  a  c e l l

−企

e ee x p r e s s i o n  s y s t e m  ( T a i y o  Nippon S a n s o   Co

o r a t i o n ,Tokyo ,  J a p a n ) .  

Pl α : t e l e t  A g g r e g a t i o n  T e s t  ( P A T )  

PAT  was p e r f o t m e d  w i t h  PRP313M  a g g r e g o m e t e r  (TAIYO I n s t r u m e n t s   INC,  O s a k a ,   J a p a n ) .  A g g r e g a t i o n  i n d u c i n g  s u b s t a n c e s  a n d   t h e i r   f i n a l  c o n c e n t r a t i o n  w e r e   a s  f o l l o w s ;   r i s t o c e t i n   ( 1 . 5   m g / m L ) ,  b o t r o c e t i n   ( 1 . 0

i g / m L ) , c o l l a g e n  ( 4

/ mL ) ,  e p i n e p h r i n e   ( 1 . 0

×

1 0 ‑ 4  M)  and  a d e n o s i n e  d i p h o s p h a t e   (ADP)  ( 1 . 0

×

1 0 ‑ 5 M ) .  

T o t a l  t h r o m b u s  f o r m a t i o n  a n a l y s i s  s y s t e m   ( T ‑ T A S )  

The

TAS R( Z a c r o s ,   F u j i m o r i  Kogyo Co .  L t d . ,  T o k y o ,  J a p a n )   i s   a  m i c r o ‑ c h i p   f l o w ‑ c h a m b e r  d e v i c e  u s e d  t o   v i s u a l l y  a n d   q u a n t i t a t i v e l y  a n a l y z e   t h r o m b u s   f o n n a t i o n  i n   whole b l o o d  s a m p l e s  u n d e r  v a r i o u s  b l o o d   f l o w   c o n d i t i o n s . 1 5  Whole b l o o d   s a m p l e s   w i t h   e a c h  a n t i  

S u b s e q u e n t l y ,   t h e  t h r o m b u s  f o r m a t i o n  i n   t h e  c a p i l l a r i e s  a n d  a n   i n c r e a s e  i n   f l o w   p r e s s u r e   were o b s e r v e d .  

E l e c t r o p h o r e s i s  m o b i l i t y  s h i f t  a s s a y  (EMSA) 

百 1 eb i n d i n g  a b i l i t i e s  o f   t h e  two a p t a m e r s  t o  t h e  human  VWF  A l  doma i n  a n d   i t s  

a l a n i n e ‑ s u b s t i t u t e d   m u t a n t s   were  a n a l y z e d  by EMSA. Each a p t a m e r  ( f i n a l   c o n c e n t r a t i o n  

o f   1 0 0  nM)  was  mi x e d  w i t h  VWF  A  1  ( f i n a l  c o n c e n t r a t i o n  o f  0  t o  800  nM)  i n  b i n d i n g  

bu

ra n d   i n c u b a t e d  a t  3 7  °C f o r  3 0  m i n

t h e n s u b j e c t e d  t o  8%  n a t i v e  P A GE  i n  0 . 5 x  

TBE b u f f e r   f o r   50 mi n a t   room t e m p e r a

r e( 2 0 0  V/ cm) .  The aptamer‑VWF Al 

(7)

H a e m a t o l o g i c a   HAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n   3 

c om p l e x e s  were  d e t e c t e d   a s  a  s h i f t  band ,  a n d  t h e   b and  p a t t e r n s  were  d e t e c t e d   by  SYER  Go l d .  The  d i s s o c i a t i o n   r a t e  ( K n )   was c a l c u l a t ed  by S c a t c h a r d   p l o t  a n a l y s i s . 

Su r : f i α c e pl α smon 

s o n a n c e

C o m p e t i t i o n  a s s a y s  w i t h   t h e  two a p t a m e r s  were  p e 1 f o r m e d  by  SPR a n a l y s i s  u s i n g   B i a c o r e   T200  (GE H e a l t h c a r e  UK  L t d . ,  L i

l e C h a l f o n t ,   UK),  a s  d e s c r i b e d   p r e v i o u s l y .  1 4  

We  a l s o  p e r f o r m e d   SPR  a n a l y s i s   t o  i n v e s t i g a t e  t h e  b i n d i n g   s i t e  o f  t h e   VWF  Al  domain  t o   c a p l a c i z u m a b .  

S t r u c t u r e  mod e l s  of  t h e  VWF  Al  d

側 側

Thr e e ‑ d i m e n s i o n a l  ( 3 D )  s t m c t u r e  m o d e l s   o f   t he  VWF  A l  domain  were v i s u a l i z e d   w i t h  t h e  PyMOL  Mo l e c u l a r  Graph i c s  S y s tem  (DeLano S c i e n t i f i c ,  San C a r l o s ,  USA) . 

E t h i c a l   s t a t e m e n t  

T h i s  s t u d y  was a p p r o v e d  by t h e   e t h i c s   c 0 1 m n i t t e e   o f   Nara M e d i c a l  U n i v e r s i

' ・

W r i t t e n  i n f o r m e d  c o n s e n t  w a s  o b t a i n e d

企0

t h ei n d i v i d u a l  who  d o n a t e d   p l asma f o r  u s e   i n  t h i s   s t u d y .  

R e s u l t s  

I n h i b i t o r y   e f f e c t s  on  pl α ' . t e l e t  aggreg

i o n

The i

i b i t o r ye

c t so f   TAGX

0 0 0 4 ,ARCl  779 ,  a n d  c a p l a c i z u m a b  l U l d e r  s t a t i c 

c o n d i t i o n s   w e r e  a n a l y z e d  b y  P A T .  F i g u r e  1  s h ows  r

r e s e n t a t i v er e s u l t s  o f  t h e  a n a l y s e s 

of  t h e  t h r e e け pe s o f   p l a s m a .   A l l   t h r e e   a g e n t s  showed  i n h i b i t i o n  a c t i v i t i e s  i n  b o t h  RIPA 

(8)

l a e m a t o l o g i c a HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n  3 

and  BIPA .  H o w e v e r ,  t h e  i n h i b i t o r y  e f f e c t s  on  p l a t e l e t  a gg r e g a t i o n  d i f f e r e d  b e t w e e n  t h e   t h r e e  a g e n t s .  I n  RIPA ,  t h e   80%  maximal i n h i b i t o r y  c o n c e n t r a t i o n  ( I C s o )  o f   T AG X‑0004  was  50 nM ,  w h e r e a s  t h a t  o f  ARCl  779  w a s  5 0 0   nM  an d  t h a t  o f   c a p l a c i z u m a b   was  5 0   nM;  t h u s  TAGX‑0004 b l o c k e d  VWF  f u n c t i o n  v i a  t h e  A l  domain  a p p r o x i m a t e l y  1 0   t

1 e smore p o t e n t l y  t h a n  ARCl  779 ,  and e x h i b i t e d  a  s

出世

a r p o t e n c y

c a p l a c i z u m a b . I n  BIPA ,  t h e  I C s o  o f  TAGX

0004was  5 0   nM ,  whe r e a s  t h a t  o f   ARCl  7 7 9  was 5 0 0  nM  and t h a t  o f  c a p l a c i z u r n a b  was 5 0  nM, r e s p e c t i v e l y ;  t h u s  TAGX ‑ 0004 b l o c k e d  VWF  f u n c t i o n   a p p r o x i m a t e l y  1 0  t i m e s   more p o t e n t l y  t h a n  ARC l  779 s h o w i n g  a  s i m i l a r   p o t e n c y  a s   c a p l a c i z u m a b .  No n e o f   t h e   t h r e e   a g e n t s   i n h i b i t e d  p l a t e l e t   a g g r e g a t i o n   i n d u c e d  by c o l l a g e n ,  e p i n e p h r i n

o r AD P  ( d a t a  n o t  s h o v ; 佃 ).

I n h i b i t o r y   e f f e c t s  on  t hrombus  f o r m a t i o n  

To  a s s e s s  t h e   i n h i b i t o r y  e f f e c t  o f  t h e  t h r e e  a g e n t s   o n  p l a t e l e t   t h r o m b u s  f o n n a t i o n ,   we  p e r f o m 1 e d

TAS. I n   t h i s  s t u d y ,  compl e t e   i n h i b i t i o n   was d e f i n e d  a s  a n   i n c r e a s e   i n  f l o w   p r e s s u r e   f r o m   b a s e l i n e   o f  no mo r e   t h a n   1 0   kPa .  TAG X ・ 0004 , ARC1 7 7 9 ,   a n d   c a p l a c i z u m a b   w e r e   a n a l y z e d   t h r e e   t i m e s  e a c h ,  a nd  F i g u r e  2  show s  r e p r e s e n t a t i v e  f l ow  p r e s s u r e  c u r v e s .   Both T AGX‑0004 and c a p l a c i z u m a b  p r e v e n t e d  t h r o m b u s  o c c l u s i o n   und e r   t h e 臼 owc o n d i t i o n  a t  5 0

v i . I n   c o n

a s t , ARCl  779  d i d   n o t   demon s t r a t e   c o m p l e t e   i n h i b i t i o n ,  e v e n  a t  a  c o n c e n t r a t i on o f   1 0 0 0   nM .  T h e s e  r e s u l t s  i n d i c a t e d  t h a t  T AGX ・ 0004 i n h i b i t e d  p l a t e l e t  t h r ombus f o n n a t i o n  a t  l e a s t  20 t i m e s  more p o t e n t l y  t h a n  ARC  1 7 7 9  u n d e r  h i g h   s h e a r   s t r e s s ,   a n d   w i t h  a  s i m i l a r   po t e n c y   a s  c a p l a c i z u m a b . 

B i o p h y s i c a l  i n t e r αc t i o n α n a l y s i s  w i t h  EMSA 

Bi op h y s i c a l   i n t e r a c t i o n  a n a l y s i s  w i t h EMSA  was p e r f o nn e d  f o u r  t i m e s  f o r  e a c h  

(9)

l a e m a t o l o g i c a HAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n   3 

a p t a m e

F i g u r e 3  s h o w s   t h a t  t h e  a

節 目

t y ofTAGX‑0004 t o  VWF  Al domain (Kn= 2 . 2  

0 . 9nM  [ n  =  4 ] )  was  a p p r o x i m a t e l y  1 6

明白

I dh i g h e r   t h a n   t h a t  o f  ARCl  7 7 9  (Kn =  3 5 . 5

士 山

nM  [ n   =4]) . 

A l a n i n e   s c a n n i n g   mut α gen

i s w i t h  E MSA 

F i g u r e   4  shows t h e  r e s u l t s   o f   EMSA u s i n g   1 6   a l a n i n e ‑ m u t a t e d  VWF Al w i t h   TAGX ‑ 0 0 0 4  ( A )  o r   ARC  1 779  ( B ) .  F i r s t ,  we a n a l y z e d   n i n e  m u t a n t s   a s  s ho wn  i n  t h e  l e

p a n e l s .  B a s e d  on  t h e   r e s u l t s  o f   t h i s  i n i t i a l  a n a l y s i s ,  we t h e n  a n a l y z e d   a d d i t i o n a l  s e v e n   mu t a n t s  a s  shown  i n   t h e   r i g h t  p a n e l s .  Of  t h e s e ,  1 0   VWF  A l  m u t a n t s   (Kl312A ,  R1334 A ,   R1336A ,  K1348A, K1371A,  E 1 3 7 6 A ,  K1406 A ,  Kl 4 23A ,  R1 4 26 A ,  a n d  K 1 4 30A)  f o r m e d   s h i f t e d   b a n d s  r e p r e s e n t i n g   c o m p l e x e s  b e t w e e n   a n   a p t a mer and  VWF  A l

a s w e l l   a s  b e t w e e n   w i l d 勾 pe (WT)  VWF  Al a n d  e a c h   a p t a m e

h t h e  r e m a i n i n g   s i x  mut a n t s ,  t h e  i n t e n s i t y  o f  t h e  comp l e x e d  b a n d s  was d e c r e a s e d ,  a n d   t h e   i n t e n s i t y  o f  t h e  unbound  a p t a r n e r   b a n d s   was i n c r e a s e d .   Of  t h e s e   mutan t s ,  R l395A a n d   Rl399A showed  d e c r e a s e d   i n t e n s i t y   i n  b o t h   TAGX ‑ 0004  a ndARCl  779  band  c ompl e x e s

 

Wh i l e   t h e  b i n d i n g  a 百 i n i t y t o   ARCl  7 7 9  was s i g n i f i c a n t l y  d e c r e a s e d  i n   R l 2 8 7  A, 

K1362 A ,  a n d  Rl392A, t h a t  t o  TAGX

0004 was  d e c r e a s e d  i n  Fl366A. T h e s e  f i n d i n g s  

s u g g e s t e d  t h a t  R1395  a nd  R l 3 9 9   w e r e  e s s e n t i a l  r e s i d u e s  f o r   b i n d i n g  t o  b o t h   a p t a r n e r s ,  

and  t l 1 a t  Rl287 ,  K1362

, 組

dRl392 p r o b a b l y  c o n t r i b u t e d  t o  b i n d i n g  t o  on l y  ARC1779 , 

w h i l e  Fl3 6 6  was r e q u i r e d  f o r  b i n d i n g  t o   TAG X0004 .  Our d a t a  i n d i c a t e d  t h a t   b o t h  

a p t a m e r s   bound t o  t h e  V WF  A l  dom a i n ,   e v e n   t h o u g h  t h e  r e s i d u e s  n e c e s s a η お r t h i s  

b i n d i n g   w e r e  pa r t i a l l y  d i f f e r e n t ,  a n d  t h e s e  d i

e r e n c e s mi g h t  a f f e c t   t h e i r   V

京市

i n h i b i t o r y

a c t i v i t y . 

(10)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n  3 

C o m p e t i t i o n   α SS αy  w i t h  B i a c o r e  

To c o m p a r e  t h e  b i n d i n g  s i t e s  o f  t h e  a p t a m e r s   t o  t h e  VWF  Al d o m a i n ,   a  c o m p e t i t i o n   a s s a y  was p e r f o n n e d  by SPR u s i n g  B i a c o r e .  B i o t i n y l a t e d  TAGX ・ 0004 was  i m m o b i l i z e d   on  t h e  s e n s o r  c h i p  SA. T h e n ,  VWF  Al  and a  c o m p e t i t o r  a p t a m e r  (TAGX‑0004  o r   ARCl  7 7 9 )  a s  a n  a n a l y t e  was i n j e c t e d  i n t o  t h e  c h i p .  The r e s u l t s  o f   a  s e l f ‑ c o m p e t i t i o n   a s s a y  u s i n g  TAGX

0004showed  t h a t  t h e   amount o f  VWF Al  b i n d i n g  t o   t h e  c h i p   d e c r e a s e d  d e p e n d i n g  on t h e  c o n c e n t r a t i o n  o f   c o m p e t i t o r  TAGX ‑ 0 0 0 4  ( S u p p l e m e n t a r y   F i g u r e  1 ) .   ARC1779 a l s o  d o s e ‑ d e p e n d e n t l y  d e c r e a s e d  t h e  r e s p o n s e  u n i t  v a l u e .

i e s e r e s u l t s  i n d i c a t e d  t h a t  TAGX

0004and  ARC  1 7 7 9  bound  t o  t h e  o v e r l a p p e d  r e g i o n  on  t h e   VWF  Al  d o m a i n .  M o r e o v e r ,  t h e  comp

t i t i v e a b i l i t y  of ARCl  779 a g a i n s t  i m m o b i l i z e d   TAGX‑0004  on  t h e   c h i p   s u r f a c e   was  l o w e r   t h a n   t h a t   o f   TAGX‑0004  a g a i n s t   TAGX‑0004. T h e s e  r e s u l t s  were c o n s i s t e n t  w i t h  t h o s e  o f   EMSA  and  i n d i c a t e d  t h a t  t h e   b i n d i n g   a

n i t yofTAGX ・ 0004 f o r  VWF  A  1  was  h i g h e r  t h a n   t h a t  o f  ARC  1 7 7 9 . 

VWF  Al domain b i n d i n g  s i t e  of  c a p l a c i z u m αb 

We p e r f o r m e d  SPR  a n a l y s i s  t o   i n v e s t i g a t e  t h e   VWF  Al  domain b i n d i n g  s i t e  o f  

c a p l a c i z u m a b .   A f t e r   i m m o b i l i z i n g   c a p l a c i z u m a b   on  t h e   s e n s o r   c h i p   CMS,  1 6  

a l a n i n e

s u b s t i t u t e dm u t a n t s  o f  VWF  Al  w e r e  a n a l y z e d   ( F i g u r e   5 ) .  The  r e l a t i v e  b i n d i n g  

amount  o f  W T   was d e

neda s  100%. The  b i n d i n g  amount o f   e a c h  m u t a n t   was e x p r e s s e d  

a s   t h e  r e l a t i v e   r a t i o  compared  t o  t h a t  of  WT. 京 司 1 e na  r e l a t i v e  r a t i o   o f   80% was s e t   a s  t h e  

c u t ‑ o f f ,   f i v e  m u t a n t s  were j u d g e d  a s  p o s i t i v e .   T h e s e  r e s u l t s  i n d i c a t e d  t h a t  t h e s e  f i v e  

r e s i d u e s   (Kl362 ,  R 1 3 9 2 ,  R l 3 9 5 ,   R1399 ,  a n d  K1406) were l i k e l y  t o  b e   t h e  b i n d i n g  s i t e s  

of c a p l a c i z u m a b .  

(11)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n   3 

C o m p a r i s o n   of VWF  Al  dom α i n   b i n d i n g   s i t e s   of TAGX  0 0 0 4 ,   ARCJ  7 7 9 ,   and 

C

l a c i z u m a b

F i g u r e  6  shows 3D  s t r u c

r em o d e l s  o f  t h e  VWF Al domain.τb e  amino a c i d   r e s i d u e s  shown i n  r e d  i n d i c a t e  t h e  e s s e n t i a l  r e s i d u e s  f o r  b i n d i n g  t o   e a c h   a p t a m e r   o r   c a p l a c i z u m a b .  The r e s i d u e s  shown  i n  y e l l o w   were n o t   i n v o l v e d  i n  b i n d i n g .  Of  t h e  1 6   a l a n i n e

i b s t i t u t e d VWF  Al m u t a n t s ,  EMSA  p r e d i c t e d  t h a t  t h r e e  amino a c i d s  ( f  1 3 6 6 ,   Rl395

a n dRl  3 9 9 )   w e r e  b i n d i n g   s i t e s  f o r  TAGX‑0004,  a s   shown i n  r e d   i n   F i g u r e  6  l e f t .  The r e m a i n i n g  1 3  amino a c i d  r e s i d u e s  a r e  shown  i n  y e l l o w .  As  f o r  ARC  1  7 7 9

f i v e amino a c i d   r e s i d u e s  ( R l 2 8 7 ,   Kl362, R l 3 9 2 ,  R 1 3 9 5 ,  a n d   R1399)  p l a y e d  a n  i m p o r t a n t   r o l e  i n  b i n d i n g  t o  VWF  Al ,  a s  shown i n  r e d  i n  F i g u r e   6  m i d d l e .  Of

i e s e , R1395 a n d   R1399 w e r e  amino  a c i d s   s h a r e d  by b o t h   a p t a m e r s .  F u r t h e r ,  u s i n g  B i a c o r e   we  i d e n t i f i e d   f i v e  amino  a c i d  r e s i d u e s  i n  t h e  VWF  Al  domain  ( K . 1 3 6 2 ,  R 1 3 9 2 ,  R 1 3 9 5 ,  R 1 3 9 9 ,   a n d   Kl406)  t h a t  w e r e   b i n d i n g  s i t e s  t o  c a p l a c i z u m a b ,   a s  shown i n   r e d  i n  F i g u r e  6  r i g h t .  Of  t h e s e ,   Kl406  was  u n i q u e   t o  c a p l a c i z u m a b . 百 i ed i

e r e n c e s i n  VWF  A  1  domain b i n d i n g   s i t e s  s u g g e s t e d   t h a t  t h e s e  a p t a m e r s  o r  nanobody  m i g h t  ha ve  u n i q u e  e f f e c t s  on  p l a t e l e t   a g g r e g a t i o n  and t h r o m b o s i s  f o r m a t i o n .  

D i s c u s s i o n  

VWF  p l a y s  a  p i v o t a l  r o l e  i n  t h e  i n i t i a l  p h a s e  o f  p l a t e l e t   t h r o m b u s   f o r m a t i o n   u n d e r   h i g h  s h e a r  s t r e s s  t h r o u g h   t h e  i n t e r a c t i o n  b e t w e e n  i t s   Al domain  a n d   p l a t e l e t  GPib . '   1 2 

T h e  b i n d i n g  s i t e  of t h e  V

T F A l  do m a i n  i s   u s u a l l y  c r y p t i c  and p r e v e n t s  s p o n t a n e o u s  

b i n d i n g  t o   p l a t e l e t s .   f 五 g hs h e a r  s

e s s o f   b l o o d  f l o w  i n d u c e s  c o n f o r m a t i o n a l  c h a n g e s   i n  

(12)

H a e m a t o l o g i c a   HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n   3 

VWF  a n d   e x p o s e s   t h e  VWF  Al  d o m a i n .  T h e r e f o r e ,  t h e  a s s o c i a t i o n  b e t w e e n   V

T F Al  a n d   p l a t e l e t   GPib  u s u a l l y  o c c u r s   u n d e r  h i g h  s h e a r  s t r e s s . 2  

h l h i b i t i o n   o f  VWF Al domain  b i n d i n g   t o   p l a t e l e t   GPib  c o u l d   p r e v e n t   t h e   d e v e l o p m e n t  o f   p l a t e l e t  t h r o m b u s  f o r m a t i o n  t h a t  c a u s e s  c a r d i a c  i n f a r c t i o n ,  c e r e b r a l   i n f a r c t i o n

andTTP .  TIP r e s u l t s

omt h e   f o r m a t i o n   o f  p l a t e l e t   t h r o m b i   i n   t h e   m i c r o v a s c u l a t u r e  d u e  t o  a  d e f i c i e n c y  o f  ADAMTSl  3 ,   a  VWF‑cleaving p r o t e a s e . 2 2 '   2 3  

i e r e f o r e ,p r e v e n t i n g   VWF Al b i n d i n g   t o   p l a t e l e t   GPib  c o u l d   be  a p r o m i s i n g   t h e r a p e u t i c   t a r g e t   f o r   T T P .   F o r  t h i s   pu

中 田 久

c a p l a c i z u m a bwas e v a l u a t e d f o r   i t s  a n t i ‑ t h r o m b o t i c  e 旺 e c t si n  a  p h a s e  2  c l i n i c a l  t r i a l  ( t h e  TITAN s ぬ d y ) 1 1a n d  a  p h a s e  3  c l i n i c a l  t r i a l  ( t h e  HERCULES  s t u d y ) . 1 2  T h e s e   s t u d i e s  r e p m t e d   a  t h e r a p e u t i c  e f f e c t  of  c a p l a c i z u m a b  on aTTP ,  i n c l u d i n g  f a s t e r   r e c o v e 1 y  of p l a t e l e t   c o u n t s

f e w e rp l a s m a   e x c h a n g e  s e s s i o n s ,  a n d  s h o r t e r  h o s p i t a l   s t a y s .  B l e e d i n g   e v e n t   was r e p o r t e d  a s  a  c o 1mnon  a d v e r s e   e v e n t  i n   p a t i e n t s  t r e a t e d  w i t h   c a p l a c i z u m a b   c o m p a r e d   w i t h   p a t i e n t s  w i t h o u t   i t . 1 2  I n   t h e  TITAN and HERCULES s t u d y ,  3 6  a n d  7 2  p a t i e n t s  o f  aTTP were t r e a t e d  w i t h   c a p l a c i z u r n a b  a n d  1 9  ( 5 4 % )  a n d  46 ( 6 5 % )  p a t i e n t s  had  b l e e d i n g   e v e n t s ,  r e s p e c t i v e l y .  The m o s t  common  a d v e r s e  e v e n t s  w e r e  e p i s t a x i s  and g i n g i v a l  b l e e d i n g ,  n e i t h e r  o f   whic h  g e n e r a l l y   r e q u i r e d   t r e a t m e n t .  

Nu c l e i c  a c i d  a p t a r n e r s  a r e  s i n g l e ‑ s t r a n d  DNA  o r  RNA  m o l e c u l e s  t h a t  c a n  f o r m   3D 

s t r u c t u r e s  c a p a b l e   o f   s p e c i f i c a l l y  b i n d i n g  t o  p r o t e i n s  o r   o t h e r  c e l l u l a r   t a r g e t s .   They  a r e  

s u p e r i o r   t o  e x i s t i n g  a n t i b o d y  p r o d u c t s   i n  t e r m s   o f   t h e i r  s p e c i f i c i t y

manu 血 c

加出

i g c o s t ,  

r e l a t i v e l y  s m a l l  s i z e ,  a n d   n o n ‑ i m r n u n o g e n i c i ち ' ・ P e g a p t a n i b  ( M a c u g e n R ,  P

z e r ) i s   t h e  

o n l y   a p t a r n e r  a p p r o v e d  by  FDA i n   2004  f o r  t h e  t r e a

1 e n to f   wet  a g e ‑ r e l a t e d   m a c u l a r  

d e g e n e r a t i o n   b l o c k i n g   v a s c u l a r  e n d o t h e l i a l  g r o w t h   f a c t o r . 2 4  As o f  J u n e   2019 ,  t h e r e  a r e  

no a p t a r n e r  f o r   t h e   p a t i e n t s   w i t h  c o a g u l a t i o n   o r   t h r o m b o t i c   d i s o r d e r  i s   a p p r o v e d .  

(13)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOU2019/235549 V e r s i o n   3 

H o w e v e r ,  some a p t a m e r s  t a r g e t i n g  c o a g u l a t i o n  f a c t o r s ,   ARC  1 7 7 9  a g a i n s t   VWF  A l ,   NUl  7 2  (ARCA  B i o p h a r m a )   a g a i n s t   f a c t o r  I l a ,  a n d   REG  1 ほ EG2( R e g a d o  B i o s c i e n c e s )   a g a i n s t  f a c t o r

a ,s t e p p e d  i n t o  c l i n i c a l  t r i a l s . 1 3 ' 2 5 ‑ 2 7  ARC1779  was  d e v e l o p e d  t o  t a r g e t   t h e  VWF  Al domain  a nd was e v a l u a t e d  i n   a  p h a s e  2  c l i n i c a l  t r i a l   i n  p a t i e n t s  w i t h   aTTP . 1 3   U n f o r t u n a t e l y ,   t h e  r e c r u i h n e n t  o f   p a t i e n t s  i n  t h i s  t r i a l  was  t e r m i n a t e d   w i t h o u t   c o m p l e t i n g  t h e  s t u d y  d u e   t o   s p o n s o r ‑ r e l a t e d  f i n a n c i a l  i s s u

s , b u t  s e v e n  p a t i e n t s  w i t h   a TTP  r e c e i v e d  c o m b i n e d  t h e r a p y  w i t h  i n t r a v e n o u s  ARCl  7 7 9  i n j e c t i o n s   a n d  p l a s m a   e x c h a n g e .   1 3

i et r i a l   showed no s e v e r e  a d v e r s e  e v e n t s   s u c h   a s   b l e e d i n g ,  e v e n  i n   p a t i e n t s  w i t h   a  TIP  who h a d  s e v e r e  t h r o m b o c y t o p e n i a .  1 3   A  s t u d y  i n  h e a l t h y  v o l u n t e e r s   c o n f i r m e d  t h a t  t h i s   a p t a m e r  had an a n t i t h r o m b o t i c  e

c ta n d  d i d  no t  c a u s e  s e v e r e   b l e e d i n g   e v e n t s . 2 8  

TAGX‑0004  i s   a  n o v e l  DNA  a p t a m e r   t h a t  t a r g e t s  t h e   V WF  Al  domain and  c o n t a i n s   D s ,   a n  a r t i f i c i a l   n u c l e i c   a c i d .  TAGX ‑ 0 004 was o b t a i n e d  u s i n g  m o d i f i e d   SELEX  ( s y s t e m i c  e v o l u t i o n  o f  l i g a n d s  by  e x p o n e n t i a l  e n r i c h m e n t )  m e t h o d s  i n c o r p o r a t i n g  t h e   Ds b a s e . 1 4  S i n c e  t h e  Ds  b a s e  h a s   no  c o m p l e m e n t a r y   ba s e   i n  n a t u r e ,   Dsc o n t a i n i n g   DNA  a p t a m e r s  c a n   h a v e   un

u e3 D  s t r u c

r

s .

1 eh i g h  h y d r o p h o b i c i t y  o f  t h e  D s  b a s e  may  c o n t r i b u t e   t o  s i g n i f i c a n t l y   h i g h   b i n d i n g  a

西国

t yt o  t a r g e t  p r o t e i n s

h f a c t ,  t h e  r e s u l t s  of  EMSA  s h o w e d  t h a t   t h e  TAGX‑0004 b i n d i n g   a f f m i t y   f o r   VWF  (Kn=  2 . 2

0 . 9 nM)  was  1 6

f o l dh i g h e r   t h a n   t h a t  o f   ARC  1  779  (Kn=  3  5 .  5

1 . 5 nM)  ( F i g u r e  3 ) .  Howe v e r ,  t h e   Kn  v a l u e s  i n  t h i s  s t u d y   m i g h t  be  unde r e s t i m a t e d  i n  c o m p a r i s o n   w i t h  p r e v i o u s  r e p o r t s ;  t h e   Ko v a l u e   o f   TAGX‑0004 was  shown  t o  b e   6 1 . 3  pM  b y  a  SPR a s s a y ,   1 4   a n d  t h e  Kn  v a l u e   of  ARCl  779  was 2  nM  i n  a  R I ‑ l a b e l e d  a s s a y . 1 8   P r e v i o u s   r e s u l t s  a l s o  i n d i c a t e d   t h a t  t h e  b i n d i n g   a

n i t yofTAGX ‑ 0 004 w a s  much  h i g h e r  t h a n   t h a t   ofARCl  7 7 9 .  

The b i n d i n g  a

n i t yo f  a p t a m e r s  t o   V

7 F Al domain m i g h t  a f f e c t  t h e  i n t e r a c t i o n  

(14)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n   3 

b e t w e e n  VWF  and p l a t e l e t s .  A l t h o u g h  b o t h  TAGX‑0004  a n d  ARC1779 i n h i b i t e d  t h e   p l a t e l e t  a g g r e g a t i o n s  w h i c h  w e r e  i n d u c e d  by  r i s t o c e t i n  a n d   b o t r o c e t i n ,  t h e  minimum  c o n c e n h ・ a t i o n  o f   TAGX

0004 n e c e s s a r y  f o r  i n h i b i t i o n  was  s i g n i 五 c a n t l y l o w e r  t h a n  t h a t   o f   ARCl  7 7 9  i n   b o t h   RIPA a n d  BIPA  ( F i g u r e  1 ) .  PAT a n a l y s i s  r e v e a l e d  t h a t  TAGX‑0004  c o u l d  b l o c k  VWF  f u n c t i o n  v i a  t h e  Al  domain a t   l e a s t   1 0  t i m e s  more  s

o n g l y t h a n   ARC1779.

TAS a l s o   r e v e a l e d   t h a t   TAGX‑0004 was  s u p e r i o r   t o   ARCl  7 7 9   a t   i n h i b i t i n g   VWF  f u n c t i o n   ( F i g u r e   2 ) .  I n   a d d i t i o n ,   c o m p a r

w i t h c a p l a c i z u m a b ,   TAGX‑0004 showed e q u a l l y  e

e c t i vei n h i b i t i o n  a g a i n s t  t h r o m b o s i s  f o ロ n a t i o n u n d e r   v a r i o u s   b l o o d  f l o w   c o n d i t i o n s .  M o r e o v e r ,  TAGX

0004 h a s  a  u n i q u e   m i n i ‑ h a i r p i n  DNA  s t r n c

r e t h a t  o f f e r s  b e n e f i t s  i n   p h a r m a c e u t i c a l   a p p l i c a t i o n s ,  1 4   s p e c i f i c a l l y  by  c o n f e r r i n g   r e s i s t a n c e  t o  d e g r a d a t i o n  by n u c l e a s e s .  T h i s  s h u c t u r e   s h o u l d  e x t e n d   t h e  h a l f こ l i f e o f   t h i s   m o l e c u l e  i n ν i νo .  

As d e s c r i b e d  a b o v e   r e g a r d i n g   t h e  a d v e r s e  e f f e c t s  o f  c a p l a c i z u m a b   t r e a t m e n t ,  t h e r e  

a r e   s t i l l   c o n c e r n s   r e g a r d i n g   b l e e d i n g   c a u s e d   by anti‑VWF  a n t a g o n i s t s .   A l t h o u g h  

a

i‑VWF a g e n t s  h a v e  d e m o n s t r a t e d  s u p e r i o r  s a f e 匂 rp r o f i l e s  i n

i sr e g a r d  c o m p a r e d  

w i t h  a n t i ‑ p l a t e l e t  a g e n t s ,  we s h o u l d  p r e p a r e  m e a s u r e s  t o   q u i c k l y  t r e a t  b l e e d i n g  t h a t  

o c c u r s   d u r i n g   a p t a m e r   t r e a t m e n t .  We  s p e c u l a t e  t h a t   i f  a  n e u t r a l i z i n g   a g e n t  c o m p r i s i n g   a 

DNA  s e q u e n c e  t h a t  i s  p a r t i a l l y  c o m p l e m e n t a r y  t o  t h a t   o f  a  s p e c i 五 c a p

meri s  p r e p a r e d ,  

i t   may  s e r v e  a s  an e f f e c t i v e  a n t i d o t e  a s   i n t r o d u c e d  i n  t h e  l i t e r a t u r e . 2 9  I n

e c a s e  o f  

TAGX

0 0 0 4 ,s u c h  p a r t i a l  DNA  s e q u e n c e   may  c o n t a i n  p

r o l e ‑ 2 ‑ c a r b a l d e h y d e ( P a ) ,  t h e  

c o m p l e m e n t a r y   b a s e   p a i r  t o  D s . 1 6  I n  t h e  p a s t  d e v e l o p m e n t  o f   a n t i t h r o m b o t i c  a p t ame r 

t h e r a p e u t i c s ,  s i m i l a r   a p p r o a c h e s   o f  a n t i d o t e   w e r e   t a k e n  t o  n e u t r a l i z e  t h e   u n w a n t e d  e f f e c t  

of  a p t a m e r ,  t h o u g h  s u c h   a p t a m e r s  a

y e tt o  be no t  a p p r o v e d .  2 6   The s p e c i f i c  a n t i d o t e  

c o u l d   c o n t r i b u t e  t o   c o n t r o l   s e v e r e   b l e e d i n g   compared w i t h  c a p l a c i zumab . 

(15)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n  3 

A l a n i n e  m u t a g e n e s i s  a n a l y s i s  of t h e   VWF  Al  domain  was  p e r f o r m e d  i n  t h i s  s t u d y  t o   d e t e r m i n e  t h e  b i n d i n g   s i t e s  of TAGX

0004 , ARCl  7 7 9 ,   a n d   c a p l a c i z u m a b .   The  b i n d i n g   s i t e s  o f   ARCl  7 7 9 ,  b u t  n o t  TAGX‑0004 o r  c a p l a c i z u m a b ,  were  r e p o r t e d   p r e v i o u s l y . 2 1   Our r e s u l t s   showed t h a t   t h e   b i n d i n g   s i t e s   of t h e s e   t h r e e   a g e n t s   o n l y   p a r t i a l l y   c o r r e s p o n d e d   e a c h   o t h e r  ( F i g u r e  6 ) .  Huang  e t  a i 2 1  r e p o r t e d  t h a t  1 8  amino a c i d  r e s i d u e s   i n   t h e   VWF Al domain were b i n d i n g   s i t e s   f o r   ARCl  1 7 2 ,   which h a s   t h e   same  f u n d a m e n t a l  s t r n c

r ea s   ARCl  7 7 9 .   T h a t   s t u d y  d i d  n o t   i d e n t i f y   Rl399 a s  a  b i n d i n g   s i t e ,   even t h o u g h  i n  t h e  p r e s e n t  s t u d y  i t  was a  common  b i n d i n g   s i t e  f o r  a l l  t h r e e  a g e n t s .  Chen  e t   a l  i d e n t i f i e d   Rl399 a s  o n e  of t h e   key amino a c i d s  f o r  t h e   e f f e c t  ofVWF  t o   h e m o s t a s i s   and t h r o m b o s i s . 3 0  I n t e r e s t i n g l y ,  a  h y d r o p h o b i c  amino  a c i d  r e s i d u e  ( F l 3 6 6 )  i s   r e q u i r e d  t o   b i n d  t o  TAGX‑0004 ,  wh i c h   h a s  two h y d r o p h o b i c  Ds b a s e s .  Ma t s u n a g a   e t  a l  p r e v i o u s l y   r e p o r t e d  t h a t  t h e  number of Ds b a s e   ( 0

2 )s t r o n g l y  c o r r e l a t e d   w i t h  b i n d i n g  a

n i t yt o   VWF  Al  1 4   and we c o n f i r m e d   t h a t  Ds

−合

e eTAGX‑0004 cou l d  n o t  i n h i b i t  t h r o m b u s   f o 1 m a t i o n  on

TAS( d a t a  n o t  s h o w n ) .  T h e s e  r e s u l t s  i n d i c a t e d   t h a t   t h e  Ds b a s e  i n t e r a c t s   d i r e c t l y  t o  t h e  VWF  Al  domain and t h e r e f o r e  Fl366  a p p e a r s  t o  be an  e s s e n t i a l  and  u n i q u e   b i n d i n g   s i t e   o f  TAGX ・ 0004 t o   t h e   VWF‑Al  domain  w i t h   h y d r o p h o b i c   i n t e r a c t i o n  ( e . g .  p i ‑ s t a c k i n g ) .  Of  n o t e ,  a l a n i n e  s c a m 1 i n g   o f  c a p l a c i z u m a b   showed  t h a t  l i k e  ARCl  779 and TAGX‑0004 ,  b o t h   Rl395 and  Rl399  were n e c e s s a r y  t o  b i n d  t h e   VWF  Al domain ( F i g u r e  6 ) . 

Due t o   t h e   method l i m i t a t i o n s ,   t h e   a f f i m 匂 f between t h e   VWF A l  domain and 

TAGX‑0004  o r   ARCl  7 7 9   was  n o t   a n a l y z e d   by t h e   SPR m e t h o d .   S i n c e   b o t h  

o l i g o n u c l e o t i d e s   and t h e   s e n s o r   c h i p   a r e   n e g a t i ve l y   c h a r g e d ,   t h e   KD  va l u e   was 

u n d e r e s t i m a t e d  when  we  i m m o b i l i z e d  t h e  VWF Al  p r o t e i n  on t h e  s e n s o r  c h i p  and 

a p p l i e d  TAGX ‑ 0 004 o r  ARCl  779 a s   a n  a n a l y t e .  Th e r e f o r e ,   we p e r f o n n e d  a l a n i n e  

(16)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOυ2019/235549  V e r s i o n  3 

s c a n n i n g  by EMSA  f o r  DNA  a p t a m e r s .   I n   a d d i t i o n ,   t h e   b i n d i n g   s i t e  o f   c a p l a c i z u m a b  t o   VWF  Al domain  was  n o t  a n a l y z e d   w i t h  EM S A ,   which  w

u s e dt o  a s s e s s   TAGX‑0004  a n d  ARCl  7 7 9 ,  s i n c e   t h i s  t e c h n i q u e  i s   n o t   s u i t a b l e  f o r  t h e   a n a l y s i s  o f  p r o t e i n s  s u c h   a s   n a n o b o d i e s  a n d  a n t i b o d i e s .  S e c o n d l y ,  ARC1779  was o r i g i n a l l y  P E G y l a t e d .  H o w e v e r ,   we  u s e d  ARCl  779  wi t h o u t   PEG i n   t h i s  s t u d y  b e c a u s e   we f o u n d   no  o b v i o u s  d i f f e r

i c e s b e t w e e n   ARCl  7 7 9  w i t h  a n d  w i t h o u t  PEG u s i n g  RIPA ,  B I P A ,  T ‑ T A S ,  a n d  EMSA  ( d a

n o t  s h o w n ) .  

I n  a d d i t i o n ,   c a p l a c i z umab was u s e d  i n   c l i n i c a l   s i u d y  a n d  a p p r o v e d  a s   b i v a l e n t   nanobody  which h a s

r o b i n d i n g   s i t e s  t o  t h e  t a r g e t .   On  t h e  o t h e r   hand ,

r o a p t a m e r s   u s e d  i n  t h i s  s t u d y  were f o 1 m e d  a s  mono v a l e n t .  I t  i s  known t h a t  d i r e c t   c o m p a r i s o n   o f  a n   a

n i t yo f  m o n o v a l e n t  e n t i 1 y  w i t h   a n  a v i d i t y  o f  b i v a l e n t   e n t i t y  i s   n o t   s t r a i g h t f o r w a r d .   N e v e r t h e l e s s ,  i t   i s   o f   i n t r i g u i n g  t h a t  TAGX‑0004 h a s  shown  c o m p a r a b l e  i n h i b i t o r y   e

e c t a g a i n s t  c a p l a c i z u m a b  i n  t h e  s t u d i e s  we p e r f o r m e d ,  and how b i v a l e n t  form of  TAGX‑0004, which  i s  n o t   a v a i l a b l e  t h o u g h ,  b e h a v e s   i n  t h e  same  e x p e r i m e n t s  

T r e a t m e n t  w i t h  c a p l a c i z u m a b  h a s  d e m o n s t r a t e d   a  r a p i d  d e c r e a s e  o f   VWF  r i s t o c e t i n   c o f a c t o r  a s s a y  i n  p a t i e n t s  w i t h  a TTP a n d   t h e  l e v e l s  o f  V W F  a n t i g e n  a n d   f a c t o r  V I I I   wer e  a l s o

n s i e n t l y r e d u c e d   w i t h  c a p l a c i z u m a b  t r e a t m e n t  compared w i t h  p l a c e b o  d u e   t o   an i n c r e a s e d   c l e a r a n c e   o f  t h e   c a p l a c i z u m a b ‑ VVIF c o m p l e x . J I   Whether o r   n o t   TAGX

0004s h o u l d  d e m o n s t r a t e s   e q u i v a l e n t  e f f e c t   i s  y e t  t o  s t u d y  u s i n g  i n  v i v o  m o d e l .   N e v e r t h e l e s s ,   j u d g i n g 企 om t h e   b i n d i n g   a b i l i t y  ofTAGX‑0004 t o  plasma

d e r i v e dhuman  VWF c o n f i r m e d  w i t h  EMSA ( d a t a  n o t  s h o w n ) ,  i t   i s   l i k e l y  t h a t  t h e

t a mershows  s i m i l a r   e 旺 e c ta s   c a p l a c i z u m a b   i n  aTTP p a t i e n t .  

I n  c o n c l u s i o n ,  we  confamed t h e  p o t e n c y  o f  TA GX ‑ 0 0 0 4

r p r e v e n t

gp l a t e l e t 

t h r o m l

u sf o r m a t i o n  i n   v i t r o .  E p i t o p e  mapping o f  t h e  b i n d i n g  s i t e s   o f   TAGX‑0004 

(17)

l a e m a t o l o g i c aHAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n  3 

compared w i t h  ARCl  7 7 9  a n d  c a p l a c i z u m a b  p r o v i d e d  u s  w i t h  i n f o r m a t i o n  on e a c h   m o l e c u l es  e

c a c yand c h a r a c t e r i s t i c s .   C a p l a c i z u m a b  i s   now coming i n t o  u s e  a s   a 

r r s t ‑ l i n e  t h e r a p y  f o r  a T T P .   H o w e v e r ,  t h e r e   a r e  s t i l l  c h a l l e n g e s  t o  b e  o v e r c o m e   w i t h  t h i s   a g e n t ,  s u c h   a s  b l e e d i n g  a d v e r s e  e v e n t s  a n d  h i g h  c o s t . 3 1  TAGX‑0004 h a s  t h e  p o t e n t i a l  t o   o ve rc om e t h e s e  p r o b l e m s  a n d  c o u l d  be d e v e l o p e d  a s  a  p r o m i s i n g  d r u g  n o t  o n l y  f o r   a T T P ,  b u t   a l s o  f o r   v a r i o u s  VWF‑mediated t h r o m b o t i c  d i s o r d e r s  s u c h  a s  a c u t e  c o r o n a

S

i d r o m eand c e r e b r a l  i n f a r c t i o n .  

Funding 

T h i s  work was s u p p o r t e d   by r e s e a r c h   g r a n t s

omt h e  M i n i s t r y   o f  Hea l t h ,  L a b o u r ,  and 

W e l f a r e  o f  J a p a n . 

(18)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n   3 

R e f e r e n c e  

I .   S a d l e r  J E .   B i o c h e m i s t r y  and g e n e t i c s   o f  von  Wi l l e b r a n d  f a c t o r .   Annu  Rev  B i o c h e m .   1 9 9 8 ; 6 7 : 3 9 5 ‑ 4 2 4 .  

2 .  R u g g e r i  ZM.  Von  W i l l e b r a n d  f a c t o r ,  p l a t e l e t s  and e n d o t h e l i a l  c e l l   i n t e r a c t i o n s .   J  Thromb H a e m o s t .   2 0 0 3 ; 1 ( 7 ) : 1 3 3 5

1 3 4 2 .

3 .   M o n t a l e s c o t   G ,   P h i l i p p e  F ,  A n k r i   A, e t  a l .   E a r l y   i n c r e a s e  of  von Wi l l e b r a n d   f a c t o r  p r e d i c t s   a d v e r s e   outcome  i n   u n s t a b l e  c o r o n a i y  a r t e r y   d i s e a s e :   ben e f i c i a l  e

e c t sof  e n o x a p a r i n .   F r e n c h   I n v e s t i g a t o r s   o f   t h e   ESSENCE  T r i a l .   C i r c u l a t i o n .   1 9 9 8 ; 9 8 ( 4 ) : 294 ・ 2 9 9 .

4 Ray  KK,  Morrow  DA,  Gibson C M

MurphyS ,   An

an E M ,  Br

nwaldE .   P r

i c t o r s o f  t h e  r i s e  i n  vWF a f t e r  ST e l e v a t i o n   m y o c a r d i a l  i n f a r c t i o n :  i m p l i c a t i o n s   f o r   t r e a t m e n t  s t r a t e g i e s  and c l i n i c a l  outcome :  An  ENTIRE‑TIM I  23 s u b s t u d y .  Eur  H e a r t  J .   200  5  ; 2 6 (  5 ) :  4 4 0 ‑ 4 4 6 . 

5 .   Bath PM, B l a n n  A,  Sm i t h  N,  B u t t e r w o r t h   R J .   Von W i l l e b r a n d   f a c t o r

,巳

s e l e c t i n and f i b r i n o g e n  l e v e l s   i n  p a t i e n t s  w i t h  a c u t e  i s c h a e m i c  and  h a e m o r r h a g i c   s t r o k e ,  and  t h e i r   r e l a t i o n s h i p   w i t h   s t r o k e   s u b ‑ t y p e   and  f u n c t i o n a l   o u t c o m e .   P l a t e l e t s .   1 9 9 8 ; 9 ( 3 ‑ 4 ) :   1 5 5 ‑ 1 5 9 .  

6 .   Moake  J L ,  Rudy CK, T r o l l  J H ,  e t  a l .   U n u s u a l l y  l a r g e  plasma f a c t o r   V I I I : v o n   W i l l e b r a n d   f a c t o r   m u l t i m e r s   i n   c h r o n i c   r e l a p s i n g   t h r o m b o t i c   t h r o m b o c y t o p e n i c   pu

u r a . N E n g l   J  Med.  1 9 8 2 ; 3 0 7 ( 2 3 ) : 1 4 3 2 ‑ 1 4 3 5 .  

7 .   Gragnano  F ,   S p e r l o n g a n o  S ,  G o l i a  E ,   e t   a l .   The  R o l e   o f  von  W i l l e b r a n d   F a c t o r  i n   V a s c u l a r   I n f l a m m a t i o n :  From P a t h o g e n e s i s  t o  T a r g e t e d  T h e r a p y .  M e d i a t o r s   I n f l a m m .   2 0 1 7 ; 2 0 1 7 : 5 6 2 0 3 1 4 . 

8 .   S i l l e r ‑ M a t u l a   JM,  Kmmphuber J ,  J i l r n a  B .  Pham1

a c o k i n e t i c ,   ph a

nacod

i a m i c and c l i n i c a l  p r o f i l e   o f  no v e l   a n t i p l a t e l e t   d r u g s   t a r g e t i n g   v a s c u l a r   d i s e a s e s .   B r  J  P h a r m a c o l .   2 0 1 0 ; 1 5 9 ( 3 ) : 5 0 2 ‑ 5 1 7 .  

9 .  Bae ON. T a r g e t i n g  von W i l l e b r a n d  f a c t o r  a s  a  n o v e l  a n t i ‑ p l a t e l e t  t h e r a p y ;   a p p l i c a t i o n  o f  ARCl  779 ,  an A n t i ‑ v

T F a p t a m e r ,  a g a i n s t   t h r o m b o t i c  r i s k .  Arch  Phann  R e s .  2 0 1 2 ; 3 5 ( 1 0 ) : 1 6 9 3

1 6 9 9 .

1 0 .   Mat s u i   T ,  H o r i   A

Hamako J ,  e t  a l .  Mutant  b o t r o c e t i n ‑ 2   i n h i b i t s   v on  Wi l l e b r a n d   f a c t o r ‑ i n d u c e d  p l a t e l e t  a g g l u t i n a t i o n .   J 百 romb H a e m o s t .  2 0 1 7 ; 1 5 ( 3 ) : 5 3 8 ‑ 5 4 8 . 

1 1 .   P e y v a n d i  F ,  S c u l l y  M, Kremer  Ho v i n g a   J A ,  e t  a l .   C a p l a c i z u m a b  f o r   Acqu i r e d   T h r o m b o t i c 百 r r o m b o c y t o p e n i c Pu

甲 山

a . N  E n g l  J  Med.  2 0 1 6 ; 3 7 4 ( 6 ) : 5 1 1 ‑ 5 2 2 . 

1 2 .   S c u l l y   M,  C a t a l a n d   SR ,  P e y v a n d i  F ,  e t  a l .   C a p l a c i z u m a b   T r e a t m e n t   f o r   A c q u i r e d   Thrombot i c

r r o m b o c y t o p e n i cP u r p u r a .   N  E n g l  J  Med.  2 0 1 9 ; 38 0 ( 4 ) : 335 ‑ 346 . 

1 3 .  C a t a l a n d  S R ,  Peyv and i  F ,  Mannucci PM ,  e t   a l .   I n i t i a l   e x p e r i e n c e  from a 

(19)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549 V e r s i o n  3 

d o u b l e ‑ b l i n d ,  p l a c e b o ‑ c o n t r o l l e d ,  c l i n i c a l   outcome s t u d y   of ARCl  779 i n  p a t i e n t s  w i t h   t h r o m b o t i c   t h r o m b o c y t o p e n i c  pu

u r a . Am  J  H e m a t o l .   2 0 1 2 ; 8 7 ( 4 ) : 4 3 0

432 .

1 4 .   Matsunaga  K I ,  Kimoto M,  H i r a o  I .   H i g h ‑ A f f i n i t y  DNA  Aptamer  G e n e r a t i o n   T a r g e t i n g  von W i l l e b r a n d  F a c t o r  Al‑Domain by  G e n e t i c  A l p h a b e t  E x p a n s i o n  f o r   S y s t e m a t i c  Evo l u t i o n   o f  L i g a n d s  by  E x p o n e n t i a l  Emichment Using Two  Types of  L i b r a r i e s   Composed  of  F i v e   Di

e r e n tB a s e s .  J  A m   Chem S o c .   2 0 1 7 ; 1 3 9 ( 1 ) : 3 2 4 ‑ 3 3 4 .  

1 5 .   Hosokawa K,  0

i i s h iT ,   Kondo T ,   e t   a l .   A  n o v e l   a u t o m a t e d  m i c r o c h i p   flow‑chambe r  s y s t e m  t o  q u a n t i t a t i v e l y  e v a l u a t e   thrombu s  f o r m a t i o n   and a n t i t h r o m b o t i c  a g e n t s   u n d e r  blood  f l o w   c o n d i t i o n s .  J  Thromb Haemost.  2 0 1 1  ; 9 ( 1 0 ) : 2 0 2 9

2 0 3 7 .

1 6 .  H i r a o  I ,   Kimoto M, M i t s u i  T ,  e t  a l .  An  u n n a t u r a l   h y d r o p h o b i c  b a s e  p a i r  s y s t e m :  s i t e ‑ s p e c i f i c  i n c o r p o r a t i o n  of n u c l e o t i d e  a n a l o g s  i n t o  DNA  and RNA.  Nat M e t h o d s .   2006 ; 3 ( 9 ) : 7 2 9 ‑ 7 3 5 .  

1 7 .   Yamashige R ,  Kimoto M, Takezawa Y ,  e t   a l .   H i g h l y   s p e c i f i c  u n n a t u r a l  b a s e   p a i r   s y s t e m s   a s   a  t h i r d   b a s e   p a i r   f o r   PCR a m p l i f i c a t i o n .   N u c l e i c   A c i d s   R e s .   2012 ; 4 0 (  6 ) : 2 7 9 3 ‑ 2 8 0 6 .  

1 8 .   D i e n e r   J L ,   D a n i e l  L a g a s s e   HA,  Duerschmied D, e t   a l .   I n h i b i t i o n  of  von  Wi l l e b r a n d   f a c t o r ‑ m e d i a t e d   p l a t e l e t   a c t i v a t i o n   and  t h r o m b o s i s   by  t h e   a n t i ‑ von  Wi l l e b r a n d   f a c t o r   Al‑domain  a p t a m e r   ARC1779.  J  Thromb  Haemost. 

2 0 0 9 ; 7 ( 7 ) : 1 1 5 5

調

1 1 6 2 .  

1 9 .   Huiz i n g a   EG, T s u j i  S ,  Romijn RA, e t  a l .   S t r u c t u r e s  of g l y c o p r o t e i n   I b a l p h a   and  i t s   complex  w i t h   von  W i l l e b r a n d   f a c t o r   Al  d o m a i n .   S c i e n c e .   2 0 0 2 ; 2 9 7 ( 5 5 8 4 ) :   1 1 7 6 ‑ 1 1 7 9 .  

2 0 .   M a t s u s h i t a   T ,   Meyer  D ,  S a d l e r   J E .   L o c a l i z a t i o n   of  von  w i l l e b r a n d   f a c t o r ‑ b i n d i n g  s i t e s   f o r  p l a t e l e t  g l y c o p r o t e i n  l b   and  bo

o c e t i nby  c h a r g e d ‑ t o ‑ a l a n i n e   s c a n n i n g  m u t a g e n e s i s .   J  B i o l  Chem. 2 0 0 0 ; 2 7 5 ( 1 5 ) :  1 1 0 4 4 ‑ 1 1 0 4 9 .  

2 1 .   Huang RH ,  Fremont DH, D i e n e r   J L ,   Schaub RG, S a d l e r  J E .   A  s t r u c t u r a l   e x p l a n a t i o n   f o r  t h e   a n t i t h r o m b o t i c  a c t i v i t y  of ARCl  1 7 2 ,  a  DNA  a p t a m e r  t h a t  b i n d s   von  W i l l e b r a n d  f a c t o r   domain  Al. S

UC

r

巴.

2 0 0 9 ; 1 7 ( 1 1 ) : 1 4 7 61 4 8 4 .  

22 .  F u r l a n  M, R o b l e s   R ,   G a l b u s e r a  M,  e t   a l .   von W i l l e b r a n d  f a c t o r ‑ c l e a v i n g   p r o t e a s e  i n  t h r o m b o t i c  t h r o m b o c y t o p e n i c   pu

u r a and  t h e  h e m o l y t i c ‑ uremic s

d r o m e . N  Eng l  J  Med.  1998 ; 3 3 9 ( 2 2 ) : 1 5 7 8 ‑ 1 5 8 4 .  

2 3 .   T s a i  HM,  L i a n   EC. A n t i b o d i

s t o  von W i l l e b r a n d  f a c t o r ‑ c l e a v i n g   p r o t e a s e  i n   a c u t e  t h r o m b o t i c  t h r o m b o c y t o p e n i c   pu

u r a .N Engl J  Med.  1 9 9 8 ; 3 3 9 ( 2 2 ) :  1 5 8 5

1 5 9 4 . 2 4 .   Gragoudas E S ,  Adamis  A P ,  Cunningham ET,  J r   . , F e i n s o d   M, Guyer  DR,  Gro up  VISiONCT. P e g a p t a n i b  f o r  n e o v a s c u l a r  a g e ‑ r e l a t e d  m a c u l a r  d e g e n e r a t i o n .  N E n g l  J  Med. 2 0 0 4 ; 3 5 1 ( 2 7 ) : 2805

2 8 1 6 .

25 .  Gomez‑Outes  A ,  S u a r e z ‑G e a   ML,  Le cum b e r r i  R ,  Rocha  E ,   Pozo‑Hernandez C , 

(20)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n   3 

V a r g a s ‑ C a s t 1 i l l o n   E .   New p a r e n t e r a l   a n t i c o a g u l a n t s   i n   d e v e l o p m e n t . τ ' h e r   Adv  C a r d i o v a s c   D i s .  2 0 1 1 ; 5 ( 1 ) : 3 3 ‑ 5 9 .  

2 6 .   V a v a l l e  J P ,   Cohen M G .  The REG  l  a n t i c o a g u l a t i o n  s y s t e m :  a  n o v e l  a c t i v e l y   c o n t r o l l e d  f a c t o r  IX  i n h i b i t o r  u s i n g  RNA a p t a m e r  t e c h n o l o g y  f o r  t r e a t m e n t  o f  a c u t e   c o r o n a r γ s y n d r o m e .  F u t u r e  C a r d i o l .   2 0 1 2 ; 8 ( 3 ) : 37 1 ‑ 3 8 2 . 

2 7 .   Ponce A T ,  Hong  KL.  A  M i n i ‑ R e v i e w :  C l i n i c a l  D e v e l o p m e n t  and P o t e n t i a l  of  A p t a m e r s   f o r  T h r o m b o t i c  E v e n t s   T r e a t m e n t   a n d   M o n i t o r i n g .   B i o m e d i c i n e s .  2 0 1 9 ; 7 ( 3 ) .   2 8 .  G i l b e r t  J C ,  Defeo

F r a u l i n iT ,  H u t a b a r a t   RM,  e t  a l .   F i r s t ‑ i n ‑ h u m a n  e v a l u a t i o n   o f   a n t i  von W i l l e b r a n d  f a c t o r

e r a p e u t i ca p t a m e r  ARCI  779 i n   h e a l t h y  v o l u n t e e r s .   C i r c u l a t i o n .  2 0 0 7 ;   1 1 6 ( 2 3 )   : 2 6 7 8 ‑ 2 6 8 6 .  

2 9 .   Nimjee  SM, 

¥.弓

1 i t e RR,  B e c k e r  RC

S u l l e n g e rBA.  A p t a m e r s   a s

1 e r a p e u t i c s . Annu Rev P h a n n a c o l  T o x i c o l .   2017 ;  6  ( 5 7 ) : 6 1

7 9 .

3 0 .   Chen  Y ,  R o b e r t s  J R ,  0 り e J N ,   e t   a l .   I d e n t i f i c a t i o n  o f  a  VWFA  l  M u t a t i o n   A t t e n u a t i n g  Thrombus  Growth  b u t   Not  P l a t e l e t   A d h e s i o n .   Blood .  2 0 1 7 ; 1 3 0   ( S u p p l e m a n t  1 ) : 5 4 7 .  

3 1 .   Mazepa MA,  M a s i a s  C ,  C h a t u r v e d i   S .   How t a r g e t e d   t h e r a p y  d i s r u p t s   t h e  

t r e a t m e n t  p a r a d i g m   f o r  a c q u i r e d  T τ ?ー t h er i s k s ,  b e n e f i t s  a n d   u n k n o w n s .   B l o o d .  2 0 1 9 ;  

1 3 4 ( 5 ) : 4 1 5 ・ 4 2 0 .

(21)

l a e m a t o l o g i c a HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n  3 

F i g u r e   l e g e n d s  

F i g u r e  1  The  i n h i b i t o r y  e f f e c t s  o f  TAGX ・ 0 0 0 4 ,AR  C l  779

and c a p l a c

umabon  p l a t e l e t  a g g r e g a t i o n   under  s t a t i c   c o n d i t i o n s  

As  s h o wn  i n  t h

u p p e r l e f t  p a n e l ,  TAGX‑0004 c o m p l e t e l y  i n h i b i t e d  r i s t o c e t i n ‑ i n d u c e d   p l a t e l e t   a g g r e g a t i o n   ( R I P A )   a t  a  c o n c e n t r a t i o n  o f  5 0

1 1 . I n  c o n t r a s t ,  t h e  c o n c e n t r a t i o n   r e q u i r e d  f o r  ARCl  7 7 9   was  5 0 0  nM,  and t h a t  f o r  c a p l a c i z u m b   was  50  nM.  As s hown  i n   l o w e r  l e f t  p a n e l ,  TAGX‑0004 i n h i b i t e d   b o t r o c e t i n ‑ i n d u c e d   p l a t e l e t  a g g r e g a t i o n   ( B I P A )   a t  a  c o n c e n

a t i o no f  50 nM. The c o n c e n t r a t i o n  r e q u i r e d  f o r  ARCl  779  was  5 0 0  nM ,  a n d   t h a t  f o r  c a p l a c i z u m a b  was 5 0   nM. 

F i g u r e   2  The i n h i b i t o r y   e f f e c t s  o f   TAGX‑0004,  ARC1779, and c a p l a c i z u m a b   on  p l a t e l e t  thrombus f o r m a t i o n   under  h i g h   s h e a r  s t r e s s  

P r e s s u r e  c u r v e s  a t  v a r i o u s  c o n c e n t r a t i o n s  o f   e a c h  a g e n t  a r e  s h o w n ;  c u r v e s  e n d  a t  t h e  

p o i n t  o f   c o m p l e t e  m i c r o c a p i l l a i y   o c c l u s i o n .  As  shown i n  t h e   u p p e r   p a n e l ,  TAGX‑0004 

i n h i b i t e d  t h r o m b u s  f o r m a t i o n  u n d e r  h i g h   s h e a r   c o n d i t i o n s  a t  a  f i n a l  c o n c e n t r a t i o n   o f  5 0  

nM.  The  m i d d l e  p a n e l  s h o w s   t h a t   ARC  1 7 7 9   d i d   n o t  a c h i e v e  c o m p l e t e  i n h i b i t i o n   e v e n  a t  

a  c o n c e n

仕 組

ono f   1 0 0 0   nM.  Th e  low e r  p a n e l  s h o w s  t h a t   c a p l a c i z u m a b  c o m p l e t e l y  

i n h i b i t e d   t h r o m b u s  f o m 1 a t i o n  a t  a  c o n c e n t : t a t i o n   o f   50 nM. 

(22)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n   3 

F i g u r e  3  Bioph y s i c a l   i n t e r a c t i o n   a n a l y s i s   o f  TAGX‑0004 and  ARC1779  w i t h   e l e c

o p h o r e s i s m o b i l i t y  s h i f t  a s s a y  (EMSA) 

The  w h i t e   a I T o w h e a d  i n d i c a t e s   t h e   compl e x   o f   w i l d ‑ t y p e   r e c o m b i n a n t  VWF  Al  w i t h   a n   a p t a m e r  (TAGX‑0004  o r  ARCl  7 7 9 ) .  The  b l a c k   anowhead  i n d i c a t e s   unbound a p t a m e r .   I n c r e a s i n g   t h e  c o n c e n t r a t i o n  o f  w i l d ‑ t y p e  VWF  Al i n c r e a s e d  t h e  d e n s i t y  of  c o m p l e x   b a n d s   a n d   d e c r e a s e d   t h a t   o f  unbound  a p t a m e r   b a n d s .   T h e s e   e x p e r i m e n t s   were  p e r f o r m e d   f o u r   t i m e s   f o r  e a c h  a p t a m e r .

i e d i s s o c i a t i o n   r a t e s  ( K u )  o f  TAG X ‑ 0 0 0 4  a n d   ARCl  7 7 9   were 2 . 2

0 . 9nM  and  3 5 . 5   ±  1 . 5  nM, r e s p e c t i v e l y .  

F i g u r e  4  E l e c t r o p h o r e s i s  mob

t ys h i f t  a s s a y  (EMSA)  u s i n g   a l a n i n e ‑ s c a n n i n g   m u t a n t s  f o r   a n a l y z i n g   VWF  Al b i n d i n g   t o   TAGX

0004and AR  Cl  779 

The  w h i t e   a r τ o w h e a d   i n d i c a t e s  t h e   complex ofVWF Al  w i t h

a p t a m e r (TAGX‑0004 

o r  ARCI  7 7 9 ) .  The b l a c k  a r r o w h e a d   i n d i c a t e s  unbound  a p t a m e r .  The  l e

most l a n e   i n  

e a c h  g e l  ( ‑ ) r e p r e s e n t s  a p t a m e r  o n l y ,  w i t h o u t  a  VWF  Al  m u t a n t .   Using  b o t h   a p t a m e r s ,  

1 0   VWF Al m u t a n t s   (Kl312A ,  Rl334A ,  R1336A, Kl348A, K1371A ,  E1376A, 

Kl406A, K l 4 2 3 A ,  R l 4 2 6 ,  and Kl430A) f o n n e d  c o m p l e x e s  w i t h  a p t a m e r s ,   a s   d i d  

wi l d

t y p e (WT)  VWF  A l .  With TAGX‑0004, a s  shown i n  t h e   t o p   p a n e l s ,  t h r e e  m u t a n t s  

σ1366A, Rl395A ,  a n d  R1399A, i n d i c a t e d  i n   r e d   l e t t e r s )   d e m o n s t r a t e d  d e c r e a s e d  

d e n s i t i e s  o f  c o m p l e x   b a n d s   a nd  i n c r e a s e d  d e n s i t i e s  o f   unbound  ba n d s ,  i n d i c a t i n g  t h a t  

t h e s e  amino a c i d s  w e r e  im po r t a n t  f o r  t h e  b i n d i n g  o f   V

T F Al  t o  TAGX

0004

With

ARC l  7 7 9 ,  a s   shown i n  t h e  l o w e r  p a n e l s ,  f i v e  m u t a n t s  ( R l 2 8 7   A ,  Kl362A ,  RI 392A , 

(23)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/235549  V e r s i o n   3 

Rl395A,  a n d   Rl399A) d e m o n s t r a t e d   d e c r e a s e d   d e n s i t i e s   o f  c o m p l e x  b a n d s   and  m c r e a s e d   d e n s i t i e s  o f  unbound  b a n d s .  

F i g u r e   5  A n a l y s i s  o f   c a p l a c i z u m a b  b i n d i n g  s i t e s   t o  t h e   VWF  Al domain u s i n g   a l a n i n e ‑ s c a n n i n g  m u t a n t s  w i t h  s u r f a c e  p i a s

onr e s o n a n c e  (SPR) 

We  p e r f o m 1 e d  SPR a n a l y s i s  t o  i n v e s t i g a t e  c a p l a c i z u m a b  b i n d i n g   s i t e s  t o  t h e  VWF  Al  d o m a i n .   A f t e r   i m m o b i l i z i n g   c a p l a c i z u m a b   on  t h e   s e n s o r   c h i p   CMS,  1 6   a l a n i n e ‑ s u b s t i t u t e d  VWF  Al m u t a n t s  w e r e   a n a l y z e d .  The  r e l a t i v e  b i n d i n g  volume  of  w i l d ‑ t y p e  VWF  Al was  d e f i n e d  a s   1 0 0 % .

i e b i n d i n g  amount o f  e a c h  m u t a n t  was  e x p r e s s e d  a s   a  r a t i o  r e l a t i v e  t o  w i l d  t y p e .  F i v e  m u t a n t s  w e r e  c o n s i d e r e d  t o  b i n d  t o   c a p l a c i z u m a b  b a s e d  on  h a v i n g   a  r e l a t i v e  r a t i o  a b o v e   t h e  c u t o f f  o f  80%. T h e s e  r e s u l t s   i n d i c a t e  t h a t  t h e s e  f i v e   amino a c i d s   匹 1 3 6 2

R l 3 9 2 ,R l 3 9 5 ,  R l 3 9 9 ,  a n d  Kl406)  i n  t h e   VWF  Al domain were  imp o r t a n t   i n  c a p l a c i z u m a b  b i n d i n g . 

g u r e 6  V

T F Al domain  b i n d i n g   s i t e s   t o   TAGX ・ 0 0 0 4 , ARC1779,  and  c a p l a c i z u

ab

Amin o  a c i d s  c o l o r e d  y e l l o w  d i d  n o t  c o n t r i b u t e  t o  VWF  Al b i n d i n g  t o  a p t a m e r s  o r   c a p l a c i z u m a b .  Amino  a c i d s   c o l o r e d  r e d  w e r e   n e c e s s m y  f o r  b i n d i n g  t o   a p t a mer s  o r  

C叩

l a c i z u m a b . T h r e e  a m i n o  a c i d s  ( F 1 3 6 6 ,   R 1 3 9 5 ,  and  R1399 )  i n  t h e  VWF  A l  dom a i n  

were  i d e n t i f i e d  a s  TAGX‑0004 b i n d i n g  s i t e s .  F o r  b i n d i n g  t o  ARCl  779 ,  f i v e  amino  a c i d s  

(24)

H a e m a t o l o g i c a  HAEMATOL/2019/2355 49  V e r s i o n   3 

( R l 2 8 7 ,   Kl362,  Rl392, Rl395

and R I  3 9 9 )   were i m p o r t a n t .   F i n a l l y ,  f i ve  amino  a c i d s   尽

く 1 3 6 2 , R1392,  R l 3 9 5 ,   R1399 ,  and  Kl 4 0 6 )   were  i m p o r t

1 t f o r   b i n d i n g   t o  

c a p   l a c i zum a b .  

参照

関連したドキュメント

Azenhas, The admissible interval for the invariant factors of a product of matrices, Linear and Multilinear Algebra 46 (1999), 51-99.

In the literature it is usually studied in one of several different contexts, for example in the game of Wythoff Nim, in connection with Beatty sequences and with so-called

S49119 Style Classic Flexor Grade 7.0 Fixation Manual Weight 215g Size range 35 - 52 TECHNOLOGY-HIGHLIGHTS. •

のようにすべきだと考えていますか。 やっと開通します。長野、太田地区方面  

At the end of the section, we will be in the position to present the main result of this work: a representation of the inverse of T under certain conditions on the H¨older

・大都市に近接する立地特性から、高い県外就業者の割合。(県内2 県内2 県内2/ 県内2 / / /3、県外 3、県外 3、県外 3、県外1/3 1/3

[r]

創業当時、日本では機械のオイル漏れを 防ぐために革製パッキンが使われていま