高濃度アスコルビン酸投与による サケ科魚類の疾病予防法の開発
日本大学大学院 生物資源科学研究科
石 川 孝 典
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目次
頁
第1章 序論 1
第2章 高濃度アスコルビン酸（AsA）の長期投与がニジマスに及ぼす影響 6 第1節 緒言
第2節 材料および方法 第3節 結果
第4節 考察 図表
第3章 高濃度AsA投与に伴うサケ科魚類のAsA組織含有量の変化 19 第1節 緒言
第2節 材料および方法 第3節 結果
第4節 考察 図表
第4章 高濃度AsA投与に伴うサケ科魚類のストレス耐性向上効果の検討 30 第1節 緒言
第2節 材料および方法 第3節 結果
第4節 考察 図表
第5章 高濃度AsA投与に伴うサケ科魚類の抗病性向上効果の検討 40 第1節 緒言
第2節 材料および方法 第3節 結果
第4節 考察 図表
第6章 高濃度AsA投与がニジマスのIFNγ産生に及ぼす影響 68 第1節 緒言
第2節 材料および方法 第3節 結果
第4節 考察 図表
第7章 総合考察 94
要旨 謝辞 引用文献
第 1 章 序 論
国 内 の 漁 業・養 殖 業 生 産 量 は 、1984 年 の ピ ー ク 時 の 1,282 万 ト ン か ら 近 年 の 2011 年 に は 477 万 ト ン と 半 減 し た （ 水 産 庁, 2 0 12b）。 加 え て 、 国 内 の 食 用 魚 介 類 の 自 給 率 は 年 々 低 下 し 、 平 成 23 年 度 の 概 算 値 で 58％ ま で 減 少 し て い る （ 水 産 庁, 2012a）。
こ の よ う な 状 況 は 、 天 然 資 源 に 頼 ら な い 養 殖 産 業 に よ る 食 用 魚 介 類 の 国 内 供 給 の 重 要 性 が 今 後 よ り 増 し て い く こ と を 意 味 す る 。
サ ケ 科 （Salmon idae） 魚 類 は こ れ ま で 11 属 70 種 が 知 ら れ て お り 、 そ の う ち 国 内 に 生 息 す る の は サ ケ 属 （Oncorhynchus）、 イ ワ ナ 属 （Salve linus）、 イ ト ウ 属 （Hucho）
の 10 種 で あ る （ 石 黒 ・ 西 田, 2004）。 養 殖 対 象 種 と し て の 歴 史 も 古 く 、1877 年 に は ア メ リ カ か ら ニ ジ マ ス Oncorhynchus mykissの 卵 が 輸 入 さ れ て い る（ 桐 生, 2005）。ニ ジ マ ス の 国 内 生 産 量 は 減 少 傾 向 に あ る が 、20 02 年 で は 7,474ト ン に 至 り 、 国 内 内 水 面 養 殖 生 産 量 の 約 20％ を 占 め て い る（ 桐 生, 2005）。近 年 で は 大 型 サ ケ 科 魚 類 が 国 外 の ノ ル ウ ェ ー や チ リ を 中 心 に 盛 ん に 養 殖 生 産 さ れ 、 日 本 国 内 へ 安 定 的 に 輸 入 さ れ て い る（ 丹 波, 2007; 緑 書 房 編 集 部, 2007）。一 方 、国 内 で も 輸 入 さ れ る 養 殖 大 型 サ ケ 科 魚 類 に 対 抗 し 、主 に 内 水 面 養 殖 に お い て 、ヤ シ オ マ ス（ 栃 木 県 ）、信 州 サ ー モ ン（ 長 野 県 ）、 ギ ン ヒ カ リ （ 群 馬 県 ）、 絹 姫 サ ー モ ン （ 愛 知 県 ） な ど 各 地 で バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー 技 術 を 利 用 し た 高 品 質 な 大 型 サ ケ 科 魚 類 の ブ ラ ン ド 魚 生 産 が 振 興 さ れ て い る
（ 澤 田 ら, 20 07）。 し か し 、 養 殖 生 産 過 程 で は 感 染 症 を 中 心 と し た 魚 病 が 頻 発 し て お り 、 生 産 量 は 伸 び 悩 ん で い る 。 ま た 、 生 産 コ ス ト の 上 昇 お よ び 安 定 供 給 が で き な い と い っ た 問 題 も 浮 上 し て き て お り 、養 魚 経 営 を 圧 迫 し て い る（ 全 国 養 鱒 振 興 協 会, 私 信 ）。 国 内 に お け る 平 成 23 年 度 の 養 殖 サ ケ 科 魚 類 の 推 定 魚 病 被 害 量 お よ び 額 は そ れ ぞ れ 約 270t、 約 3 .2 億 円 に も 達 し て お り （(社)日 本 水 産 資 源 保 護 協 会, 私 信 ）、 そ の 生 産 性 を 安 定 さ せ る た め に は 、 魚 病 被 害 の 低 減 が 極 め て 重 要 で あ る 。
サ ケ 科 魚 類 養 殖 に お け る 魚 病 対 策 と し て は 、 侵 入 し て し ま っ た 感 染 症 に 対 し て の 抗 生 物 質 や 合 成 抗 菌 剤 の 使 用 す る ア ン チ バ イ オ テ ィ ク ス が 一 般 的 で あ る （Aoki, 1975）。し か し 、薬 剤 使 用 量 の 増 加 に よ る 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 や 、ブ リ 属 や ヒ ラ メ な ど
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に 比 べ 経 済 規 模 が 小 さ く 新 薬 の 開 発 が 進 ま な い こ と な ど 、 ア ン チ バ イ オ テ ィ ク ス に よ る 魚 病 対 策 に は 限 界 が あ る（Aoki e t a l., 19 74; Zhao e t a l., 1992 ; 森 井・吉 井, 2001）。
加 え て 、 近 年 、 安 全 ・ 安 心 な 養 殖 魚 づ く り が 消 費 者 か ら 求 め ら れ る よ う に な っ て き て お り 、 水 産 用 医 薬 品 の 使 用 に は 慎 重 に な ら ざ る 負 え な い 状 況 下 に あ る （ 水 谷, 2009）。
こ の よ う な 背 景 か ら 、 新 た な 魚 病 対 策 技 術 と し て 免 疫 賦 活 剤 の 活 用 が 注 目 さ れ て い る 。 免 疫 賦 活 剤 と は 、 非 特 異 的 な 免 疫 機 能 を 向 上 さ せ る 作 用 を も つ 物 質 の 総 称 で あ る （ 高 橋 ら, 2000）。 魚 類 の 養 殖 生 産 過 程 で は 、 飼 育 水 温 、 溶 存 酸 素 量 や ア ン モ ニ ア 量 、 溶 存 重 金 属 、 飼 育 密 度 、 ハ ン ド リ ン グ 操 作 お よ び 活 魚 輸 送 な ど 複 数 の ス ト レ ス 要 因（ ス ト レ ッ サ ― ）が 存 在 す る（Martin e t al. , 1998 ; Ortuño e t a l., 2001; Foss, 2003;
Iguchi e t a l., 2003 ; Sira j and Usha, 2003 ; Nikoskela inen e t al., 20 04; Zhang et a l., 2004 ; Dror e t a l., 2005）。 そ し て ス ト レ ス 環 境 下 に あ る 魚 体 は 、抗 体 産 生 （Thomp son et a l., 1993）や 補 体 活 性 が 低 下（Yin et al., 1 995）す る こ と が 報 告 さ れ て お り 、ス ト レ ス が 生 体 防 御 能 を 低 下 さ せ る こ と は 明 ら か で あ る 。 魚 類 の 感 染 症 の 多 く は 、 ス ト レ ス 等 に 伴 い 生 体 防 御 能 が 低 下 し た 個 体 に 感 染 能 を 有 す る 日 和 見 感 染 症 で あ る と 考 え ら れ て お り （ 飯 田, 2001）、 免 疫 賦 活 剤 は ス ト レ ス 耐 性 を 向 上 さ せ 生 体 防 御 能 を 低 下 さ せ な い 、 魚 病 の 発 生 を 未 然 に 防 ぐ ア イ テ ム と し て 期 待 で き る 。
免 疫 賦 活 剤 に は 様 々 な 種 類 が あ り 、 菌 体 ・ 菌 体 成 分 、 炭 水 化 物 複 合 体 、 合 成 化 合 物 、 栄 養 素 、 動 植 物 由 来 成 分 、 生 体 防 御 子 、 ホ ル モ ン 類 お よ び 核 酸 が 知 ら れ る （ 酒 井, 2001）。 既 に 、 ビ タ ミ ン 類 、 ラ ク ト フ ェ リ ン 、 お よ び ポ リ フ ェ ノ ー ル な ど は 、 養 魚 生 産 の 現 場 で 多 用 さ れ て い る（ 岡 村, 2008 ; 越 塩, 2008 a; 2008b ; 崎 浦, 2008）。し か し 、 多 く の 免 疫 賦 活 剤 の 作 用 機 序 は 未 だ 不 明 で あ り 、 水 産 用 医 薬 品 に 比 べ 投 与 効 果 も 安 定 し て い な い（ 栃 木 県 養 殖 魚 漁 協 同 組 合, 私 信 ）。ま た 、魚 価 が 低 迷 す る 養 殖 業 で は 魚 病 対 策 に 費 や せ る コ ス ト の 問 題 も あ り 、 免 疫 賦 活 剤 に つ い て も 安 価 で 安 定 的 に 入 手 の し 易 い も の が 求 め ら れ て い る 。 そ こ で 著 者 は 、 免 疫 賦 活 作 用 と し て 実 績 も
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あ り 、 飼 料 添 加 物 の 一 つ と し て も 利 用 さ れ て い る ア ス コ ル ビ ン 酸 （Ascorbic Acid：
AsA） に 着 目 し た 。
AsAは ビ タ ミ ン Cと も 呼 ば れ 、還 元 力 を 有 す る ラ ジ カ ル 捕 捉 型 の 抗 酸 化 物 質 で あ る （ 倉 田, 1994）。 そ の た め 、 体 内 に 取 り 込 ま れ る と 水 溶 性 酸 化 剤 と し て 活 性 酸 素 や ラ ジ カ ル 種 の 消 去 に 優 れ た 特 性 を 持 つ こ と が 知 ら れ て お り（N ish ikimi, 1975 ; Cabe lli and Bie lski, 1983 ; Bend ich et a l., 1986 ; Fre i e t al., 1989）、 最 近 で は 動 植 物 の 酸 化 ス ト レ ス に 対 す る 防 御 物 質 と し て も 広 く 認 識 さ れ て い る （ 倉 田, 1994 ; Sauberlich , 1994 ; Stocke r and Fre i, 199 6）。
AsAは 、 既 に 多 く の 魚 種 に お い て ス ト レ ス 耐 性 や 抗 病 性 の 向 上 効 果 が 確 認 さ れ て い る （Verlh ac a nd Gab audan, 200 5）。 ス ト レ ス 耐 性 に つ い て は 、 コ ト ヒ キ に お け る 水 温 変 動 （Chien e t al. , 2001）、 イ シ ダ イ Ople gnathus fasc ia tus お よ び ニ ジ マ ス に お け る 低 酸 素 （Ishiba sh i et al., 1992 ; Dabro wsk i e t al., 2004） な ど に 対 す る ス ト レ ス 向 上 効 果 が 確 認 さ れ て い る 。 ま た 、 抗 病 性 の 向 上 効 果 に つ い て も 感 染 実 験 や 免 疫 指 標 を 基 に 検 討 が 行 わ れ て お り （Lim e t al. , 2000a; Gannam and Sch lock, 2 001; Verlhac and Gabaudan, 2005）、感 染 実 験 で は ブ リ Seriola q uinqueradia taに お け る 細 菌 性 溶 血 性 黄 疸 （ 伊 藤 ら, 2000）、 チ ャ ネ ル キ ャ ッ ト フ ィ ッ シ ュ Icta luru s punc tatusに お け る 腸 管 敗 血 症 （Durve a nd Lo ve ll, 1982 ; Li a nd Lo ve ll, 1985 ; Lim et al., 20 00b）、 タ イ セ イ ヨ ウ サ ケ Salmo sa lar に お け る せ っ そ う 病 （Waagbø et al. , 1993）、 ニ ジ マ ス に お け る Yersinia ruc keri（Wahli et a l.,1998） や Vibrio anguilla rum 感 染 症 （Nava rre and Halve r, 1989）、 ニ ジ マ ス に お け る 伝 染 性 造 血 器 壊 死 症 （IHN; 鈴 木 ・ 阿 井, 1989）、 ウ イ ル ス 性 出 血 性 敗 血 症 （VHS; Wah li e t a l.,199 8） な ど に お い て 生 残 性 の 向 上 効 果 が 報 告 さ れ て い る 。 主 な 免 疫 指 標 を み て も 、 チ ャ ネ ル キ ャ ッ ト フ ィ ッ シ ュ に お け る マ ク ロ フ ァ ー ジ の 走 化 性 の 増 加 （Lim e t a l., 2 000 b）、 補 体 （ 古 典 経 路 ） の 活 性 お よ び Edwardsie lla ic taluri に 対 す る 抗 体 産 生 量 の 増 加 （Li and Lo ve ll, 1 985）、 タ ー ボ ッ ト Scophtha lmus max imus に お け る 血 清 リ ゾ チ ー ム 活 性 の 上 昇（Robe rts e t a l., 1995）、タ
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イ セ イ ヨ ウ サ ケ に お け る リ ン パ 球 の マ イ ト ジ ェ ン 活 性 の 向 上（Ve rlh ac and Gabaudan , 1994）、頭 腎 の リ ゾ チ ー ム 活 性（Waagbø e t a l., 1993）、血 清 補 体 活 性 の 上 昇（Hardie e t al., 1991）、 ニ ジ マ ス に お け る リ ン パ 球 の マ イ ト ジ ェ ン 活 性 の 上 昇 （Ve rlh ac and Gabaudan, 1994）、補 体 活 性（alternative pa thwa y）の 活 性（Ve rlh ac e t al., 1996）、Yersinia ruckeri に 対 す る 抗 体 産 生 量 の 増 加 （Dunie r et a l., 1995） な ど が 確 認 さ れ て い る 。
興 味 深 い こ と に 、 上 述 し た 多 く の 研 究 報 告 に お い て 、AsA の 濃 度 と 有 効 性 に 相 関 関 係 が 認 め ら れ て お り 、ニ ジ マ ス に お け る 補 体（Alte rna tive pa thwa y）の 活 性 の 例 で み る と 、150 mg /kg d iet の AsA 添 加 量 で は 未 添 加 区 と 差 異 が み ら れ な か っ た の に 対 し 、 1,000 お よ び 4,000 mg /kg dietの 添 加 魚 で は 有 意 な 上 昇 が 認 め ら れ て い る （Verlhac e t al., 1996）。他 に も 、ニ ジ マ ス に お け る リ ン パ 球 の マ イ ト ジ ェ ン 活 性 の 上 昇（Verlha c and Gabaudan, 1994）、 特 異 抗 体 の 産 生 量 の 増 加 （Li and Lo vell, 1 985; Dunie r e t a l., 1995）、Y. rucke ri や V. angu illarum の 人 為 感 染 対 す る 生 残 性 向 上 （Wahli e t al. ,1998 ; Navarre and Halver, 19 89） な ど が 報 告 さ れ て お り 、 い ず れ も 概 ね 1 ,000 mg/kg diet 以 上 の 高 濃 度 投 与 時 に 効 果 が 認 め ら れ て い る（Verlhac and Gabaudan, 2005）。AsAは 必 須 栄 養 素 と し て 、 要 求 量 を 十 分 に 超 え る 量 が 市 販 配 合 飼 料 に 添 加 さ れ て い る が 、 同 餌 料 に 1000 mg/kg 餌 料 を 超 え る AsA を 更 に 添 加 す る こ と で 、サ ケ 科 魚 類 養 殖 に お い て 多 く の 感 染 症 を 予 防 で き る 手 法 と な る も の と 予 想 さ れ た 。 な お 、AsA の 市 販 価 格 は 1kg 当 た り 2,000 円 程 度 で あ り 、 高 濃 度 投 与 を 連 続 し て も 十 分 に 収 益 を 確 保 す る こ と が 可 能 で あ る 。
そ こ で 本 研 究 で は 、 国 内 の 内 水 面 養 殖 業 で 盛 ん に 生 産 さ れ て い る ニ ジ マ ス を 中 心 と し た サ ケ 科 魚 類 を 対 象 に 、高 濃 度 AsA投 与 に 伴 う サ ケ 科 魚 類 へ の 有 効 性 を 確 認 し 、 そ の 作 用 機 序 の 解 明 を 試 み た 。す な わ ち 、第 2 章 で は 高 濃 度 AsA 投 与 に 伴 う ニ ジ マ ス へ の 悪 影 響 の 有 無 を 確 認 す る た め 、100 日 間 の 長 期 投 与 に よ り そ の 影 響 を 検 証 し た 。 ま た 第 3 章 で は 、 最 低 必 要 と な る 投 与 期 間 や 投 与 終 了 後 の 効 果 持 続 期 間 を 推 測 す る た め 、高 濃 度 AsA 投 与 に よ る 体 内 蓄 積 量 の 変 化 つ い て 測 定 し た 。第 4 お よ び 第
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5 章 で は 、 前 章 ま で に 確 定 し た 高 濃 度 AsA の 投 与 手 法 の 有 効 範 囲 を 明 ら か に す る た め 、 各 種 ス ト レ ス お よ び 感 染 症 に 対 す る 生 残 性 か ら そ の 効 果 を 検 証 し た 。 第 6 章 で は 、 第 5 章 で 認 め ら れ た IHN に 対 す る 高 濃 度 AsA 投 与 の 抗 病 性 向 上 機 序 の 一 端 の 解 明 を 目 指 し 、AsA が 抗 ウ イ ル ス 因 子 の 一 つ で あ る IFNγ の 発 現 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 解 析 を 行 っ た 。 そ し て 最 終 章 で は 、 本 研 究 で 得 ら れ た 知 見 を ま と め 、 内 水 面 サ ケ 科 魚 類 の 生 産 現 場 に お い て 、経 済 的 な メ リ ッ ト が 大 き い 高 濃 度 AsA投 与 の 用 途 用 法 を 提 案 し た 。
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第2章 高濃度アスコルビン酸（AsA）の長期投与がニジマスに及ぼす影響 第１節 緒言
AsA は栄養学的にはビタミン Cとも呼ばれ、新鮮な果物や野菜・緑茶に豊富に存在し、
動物体内では特に副腎組織に多く認められる水溶性ビタミンである（大塚, 1996）。同物質 はラジカル補足型の抗酸化作用を示し（倉田, 1994）、体内で生じたスーパーオキシド（O2-）、 ヒドロキシラジカル（-OH）、過酸化水素（H2O2）などの活性酸素の消去に優れる（Nishikimi, 1975; Cabelli and Bielski, 1983; Bendich et al., 1986; Frei et al., 1989）、生物の酸化ストレスに 対する防御物質として広く認識されている（倉田, 1994; Sauberlich, 1994; Stocker and Frei, 1996）。
AsAは、魚類でも必須ビタミンとして飼料に添加されているほか、多くの魚種において
1,000mg/kg diet以上の高濃度投与により免疫賦活作用やストレス耐性の向上機能が確認さ
れている（Verlhac and Gabaudan, 2005）。一方、同物質の高濃度投与に伴う副作用的な影響 について、魚類で検討された事例はない。水溶性ビタミンであるAsAは、過剰摂取した際 は速やかに体外へ排出されるため、毒性はきわめて低いとされる。しかし、ヒトでは１日 に6 gの割合で3ヶ月間投与した成人において下痢や嘔吐などが生じた事例があり（平野, 1994b）、骨からのカルシウム流失（Thornton and Omdahl, 1969）、尿酸尿（Stein et al., 1976）
および腸管障害（Barness, 1975）といった副作用と推察される事象も報告されている。よっ て、高濃度AsA投与を魚類の疾病予防対策として利用していくためには、まずその安全性 を評価しておくことが必要である。
そこで本章では、ニジマスを供試魚として、100日間にわたりAsAの高濃度投与を行い、
魚体の成長、生理代謝、および免疫・ストレス耐性能に及ぼす影響について検討を行った。
第2節 材料および方法 1. 供試魚
実験には、栃木県水産試験場で継代飼育されてきた黒磯系ニジマスの稚魚（平均体重1.85 ｇ）を用いた。
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2. 試験飼料
基本飼料には、オリエンタル酵母工業（現日清丸紅飼料）製のマス稚魚用市販飼料（ス ーパーシリーズ）を用いた。AsAは和光純薬工業製の特級を使用した。
AsAの飼料添加は、市販サラダオイル（キャノーラ油）にAsA粉末を混合した後、100、
1,000または5,000 mg/kg dietとなるよう市販飼料に外割 5%で展着することにより実施し
た（試験飼料）。また、サラダオイルのみ展着させたものを0 mg/kg dietとした（対照飼料）。
実験期間中における飼料の調整は毎日行い、使用時まで 4℃の冷蔵庫で保管した。なお、
AsAの添加状況を確認するため、本章 4．の手順で飼料中の AsA 含量を測定したところ、
対照飼料が579 mg/kg diet であったのに対し、100 mg/kg dietの試験飼料で772 mg/kg diet、
1,000 mg/kg dietで1,846 mg/kg diet、5,000 mg/kg dietで5,441mg/kg dietと、試験飼料にお けるAsAの添加量と飼料中のAsA含量が相関することを確認した（Table 1）。
3. 飼育試験
飼育試験には、100 mg/kg diet試験飼料（AsAⅠ）区、1,000 mg/kg diet（AsAⅡ）区、5,000
mg/kg diet（AsAⅢ）区、および対照飼料（Cont）区の計4区を設定した（Table 1）。すなわ
ち、試験区毎に13.0（±1.0）℃に調温したオゾン殺菌河川水を6.0 L/minの割合で注水し たヨーロピアンタイプFRP水槽（110×110×65 cm：水量約500L）に300尾/水槽の密度と なるように供試魚を収容し、各試験飼料を魚体重の3.0%の割合で100日間毎日にわたり給 餌した。
サンプリングは、試験開始直前、試験開始1、3、10、20、30、42日後、それ以降は10 日毎に100日後まで合計14回行い、各回ともに供試魚を約20尾取り上げて体重を測定し た。AsAの組織含有量は、試験開始直前および開始1、3、10および60日後に取り上げた 魚体を用いて測定を行った。また試験開始50および100日後においても各区より 5尾ず つ取り上げ、血漿成分、皮膚粘液細胞数、およびスーパーオキシドディスムターゼ（SOD）
活性を測定した。なお、腎臓貪食細胞のNBT反応については、試験開始60および100日 7
後の魚体を用いた。各試験の詳細は下記に示す。
4. AsA含量の測定
AsA含量の測定は、配合飼料およびニジマス肝臓組織を対象に、五訂増補日本食品標準 成分表分析マニュアル（文部科学省，2005）に従い測定した。なお、配合飼料は調整後、
4℃で一日保存したものを測定に用いた。また、肝臓組織は5尾ずつプールしたものを1ロ
ットとして測定を行った。
供試魚は氷上で解剖し、肝臓を採取して同臓器の重量を測定した。適量の 5％メタリン 酸溶液およびケイ砂を加えて磨砕した後、メスフラスコで50 mlに定容し、遠心（2,000g，
10 min，室温）した。得られた上清をろ紙によりろ過したものをアスコルビン酸測定用試 料として約10 μg/mLとなるように希釈し、栓付き小試験管へ1 mL分注した。各小試験
管に5％メタリン酸溶液を1 mL加え、インドフェノール溶液の数滴を滴下し、2％チオ尿
素－メタリン酸溶液2 mLを加え、よく混合した。小試験管に栓をして50℃の湯浴中で1.5 時間加熱した後、水冷して室温に戻した。酢酸エチル2 mLを加えて1時間の振とうを行 った後、適量の無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。再度遠心（2,000×g，10 min，室温）
後、その上清（酢酸エチル層）を試験溶液とした。
試験溶液はHPLC（本体：GULLIVER SRIES、JASCO; カラム：Silica-2150-N、6.0×150
mm、SSC; 検出器：model UV-970、JASCO）を用いて測定した。測定条件は、移動相を酢
酸-n-ヘキサン-酢酸エチル混液（1:45:5）とし、流速1.5 mL/min、カラム温度40℃、測定波 長495nmとした。
5. 血漿成分の測定
測定には、水槽から取り上げ、500 U/mLヘパリンナトリウム処理をした注射器を用いて 直ちに尾柄部から採血した血液を用いた。血液は、微量高速冷却遠心機（MX-150，トミー 精工）を用いて遠心（500×g，10 min，4℃）し、血漿を採取して使用時まで‐80℃で保存 した。測定には生化学自動分析装置（ドライケム5500、富士フイルム）を使用し、グルコ
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ース（GLU）、総コレステロール（TCHO）、Aspartate Aminotransferase（AST）量、γ-
glutamyltransferase（GGT）、尿素窒素量（BUN）および総カルシウム量（Ca）の6項目を測
定した。
6. 非特異的免疫機能測定 1) 腎臓貪食細胞のNBT反応
腎臓貪食細胞の貪食活性は、細胞が貪食時に発生する O2-がニトロブルーテトラゾリウ ム（NBT）と反応することで形成されるブルーホルマザンを測定するNBT法により実施し た。
すなわち、取り上げた魚体から直ちに無菌的に腎臓を切り出し、100 μg/mL硫酸ストレ プトマイシンおよび100 unit/mLペニシリンGを含むL-15培地（Gibco、以後L-15）を2
mL分注した60 mm Non-Treated Dish（IWAKI）に移し、滅菌したシリンジ棒の裏面で優し
く組織を破砕した。培養液ごと 70 μm セルストレーナー（BD FalconTM）を用いて組織 片等を取り除いたものを細胞液として、事前に分注・冷却しておいたHISTOPAQUE®-1077
（SIGMA-ARDRICH）2 mLにパスツールピペットを用いて重層した。遠心（400×ｇ，20
min，4℃）後、白血球層を採取して新たなスピッツ管に移し、L-15で数回遠心洗浄を行っ
た。L-15に白血球浮遊液を再浮遊させた後、0.1％トリパン・ブルーを用いた色素排除法に より血球算定盤上で生細胞数を計数し、生細胞数が2×106 cells/mLとなるように調整した。
得られた細胞浮遊液は96 wellマイクロプレートに100 μL/wellとなるように分注し、貪 食細胞がプラスチック面へ付着する性質を利用して、20℃で1時間インキュベートした。
非付着細胞を除くため軽くピペッティングして上清を除き、再び L-15 を加えることを数 回繰り返した後、L-15で調整した0.2% 1.1 μmラテックスビーズ（SIGMA）液 に1 mg/mL となるように NBT（SIGMA）を混合したものを刺激物として 100 μL/well 加え、さらに L-15を100 μL分注して20℃で20分間インキュベートした。その後、上清を除きL-15に より数回洗浄した後、70％メタノールで固定した。風乾後、2M水酸化ナトリウム120 μ
L、DMSO 140 μL の順に加え、軽くピペッティングを行い、マイクロプレートリーダー
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（Benchmark、Bio-Rad）を用いて吸光度630 nmで青色の呈色反応を測定した。なお、ブラ ンクには細胞の代わりにL-15のみで測定した値を使用した。
2) 皮膚粘液細胞数
皮膚粘液細胞数の測定には、パラフィン薄切標本を観察することにより行った。すなわ ち、ブアン液で固定した魚体から尾柄部を切り出し、常法に従いパラフィン薄切標本を作 製した。マイヤーヘマトキシリン溶液（Wako）を用いたヘマトキシリン・エオジン（HE）
染色、またはコールドシッフ試薬（Wako）を用いたアルシアンブルー・PAS（AB-PAS）染 色を行った後、表皮層100 μm当たりの粘液細胞数を1個体に着き10ヶ所計数し、その 平均値を粘液細胞数とした。
3) SOD活性
SOD活性の測定は、SOD Assay Kit-WST（DOJINDO）を用いた。供試魚から採取した肝 臓および腸管は直ちに9倍量（w/v）の10 mMリン酸塩緩衝液（PBS、pH7.4）を加え、氷
上の1.5mlマイクロチューブ内でペレットホモジナイザーを用いてホモジナイズした。遠
心（20,000×g，20min，4℃）後、得られた上清を測定用試料として使用時まで-80℃で保存 した。試料は測定直前に解凍し、PBSを用いて肝臓試料は100、200、500および1,000倍、
腸管試料は50、100、200および400倍となるようにそれぞれ希釈し、各希釈溶液を96 well マイクロプレート（Nunc）に 10μl/well 分注した。次に WST working solution 100 μl、
Enzyme working solution 10 μlの順に加え、37℃で20分間インキュベートした後、マイク ロプレートリーダー（Benchmark、Bio-Rad）を用いて吸光度450nmで測定した。得られた 値は下記の式に当てはめ、SOD阻害活性を求めた。なお、試料の代わりにUPWとしたも のをブランク1、Enzyme working solutionの代わりにDilution bufferとしたものをブランク 2、および試料の代わりにUPWかつEnzyme working solutionの代わりにDilution bufferと したものをブランク3とした。
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SOD阻害活性（阻害率50％）=｛（blank1-blank3）-(sample-blank2)｝/(blank1-blank3)×100
SOD阻害活性を標準SODの検量線からunit数に変換した後、Bio-Rad Protein Assay（Bio-
Rad）を用いて測定した各試料のタンパク質量を基に、タンパク質濃度1mg当たりのSOD
活性値を算出した。
7. 高水温ストレス試験
各区から100尾を無作為に取上げ、尾鰭に切れ込みを入れ各区毎に標識した。次に、23℃
に設定しエアレーションを施した濾過槽付循環式水槽（容量1000 L）に移し、24時間後ま での死亡状況を観察した。なお、供試魚の死亡は、遊泳運動をせず、鰓蓋の動きが止まっ たことで判定した。
6. 統計解析
測定値は、エクセル統計 2008（株式会社 社会情報サービス）を使用したダネット検定 により対照区との有意性を比較した（P<0.05）。高水温ストレス試験についてのみ、フィッ シャーの正確確率検定を行った後に、Holm法によるFamilywise error rateの調整を行い、
対照区との有意性を比較した（P<0.05）。
第3節 結果
飼育試験におけるAsAの摂取状況を確認するため、経時的に魚体を取り上げて肝臓組織 中のAsA含量を測定した結果、1,000および 5,000mg/kg dietとなるようAsA を添加した
AsAⅡおよびⅢ区では、実験期間を通して対照区と明瞭な差異が認められた（Table 1）。一
方、体重を基に飼育区間で成長を比較したところ、実験期間を通して対照区と各AsA試験 区の間に有意な差は認められなかった（Fig. 1）。また、血漿成分を測定した結果、全測定 項目において試験区間で有意な差は確認されなかった（Table 2）。
非特異的免疫反応を測定した結果、腎臓貪食細胞の NBT 反応は、飼育試験100 日後の 11
AsAⅡおよびⅢ区において、対照区との間で有意に高い値が認められた。また、皮膚粘液
細胞数も100日後のAsAⅢ区において有意に低く、SOD 活性も100日後のAsAⅢ区の腸
管においてのみ対照区と比べ有意に高い値がみられた（Table 3）。
高水温ストレス試験の結果、試験開始24時間後の累積死亡率は、対照区40%、AsAⅠ区
45%、AsAⅡ区30 %、およびAsAⅢ区10％となり、AsAⅢ区で有意な死亡低減効果が確認
された（Fig. 2）
第4節 考察
1,000 mg/kg dietを超える高濃度のAsA投与の有効性については、魚類でもこれまでに複
数の報告があるが（Verlhac and Gabaudan, 2005）、100日間にわたる飼育試験で評価を行っ たのは本研究が初めてである。肝臓におけるAsA含有量の推移をみると、1,000または5,000
mg/kg diet のAsAを投与した区では、実験期間を通して対照区と明瞭な差異がみられ、実
験期間を通してAsAを確実に魚体に摂取させることができたものと考えられた。
AsA の高濃度投与に伴う副作用には、ヒトにおいて骨からのカルシウム流失（Thornton and Omdahl, 1969）が報告されている。しかし、本研究において実験区間で成長（魚体重）
や血漿カルシウム濃度に差異は認められなかった。また、ヒトでは尿酸尿（Stein et al., 1976）
による障害が示されているが、腎機能を示すBUN（血中尿素窒素）を含む本研究で測定し たいずれの血漿成分においても異常値は認められず（Table 2）、少なくともニジマスなど淡 水養殖されるサケ科魚類においては、高濃度のAsAを長期間与えたとしても、ヒトで認め られているような副作用はないものと判断された。
本試験では、長期間のAsA投与がニジマスの非特異的免疫に及ぼす影響についても検証 を行ったが、貪食細胞などの白血球の機能を示すNBT反応は、飼育試験100日後の1,000
および5,000 mg/kg diet区ともに対照区と比べ有意な差で上昇がみられるなど、AsAの短期
間投与に関する既知の報告（Verlhac et al., 1996; Verlhac et al., 1998）と同様の結果が得られ た。また、魚類のSOD活性や粘液細胞数はストレス時にそれぞれ低下（Eo and Lee, 2008）
または増加（Buchmann et al., 2004; Vatos et al., 2010; Kalogianii et al., 2011）することが知ら 12
れているが、本研究において 5,000mg/kg diet を投与した魚体では、対照区に比べ有意な SOD活性の増加、粘液細胞数の減少が認められるなど、1,000mgと5,000mg/kg diet区の間 でも差異が認められた。更に、高水温耐性試験を行ったところ、5,000mg/kg diet区におい てのみ高い生残効果が確認されたことから、5,000mg/kg dietのAsA添加は、長期投与を行 った場合でも高いストレス耐性効果が維持されているものと考えられた。これらの結果は、
費用面がクリアされれば、高濃度のAsAの長期投与を継続して実施することで、有効な魚 病の予防手法となることを示している。そこで次章では、最も高いストレス耐性効果が確
認された5,000mg/kg diet を最適濃度（投与量）として、効果をもたらす投与期間や効果が
持続する期間について検討を行った。
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0 day1 day3 days10 days60 days Cont05790.1010.1140.1240.189 AsAⅠ1007720.1140.1210.1370.172 AsAⅡ100018460.1250.2100.2760.281 AsAⅢ500054410.1560.2470.4860.320 Values are means from duplicate sample. *1 AsA content in each experimental diet were analyzed at one day after diet preparation． *2 Each value is the pool of 5 fishes．
Table 1 Ascorbic acid (AsA) content in experimental diet and liver tissue of rainbow trout fed experimental diets containing different concentrations of AsA 0.134 Analyzed AsA content*2 in liver tissue (mg/g tissue weight)during feeding trial
Analyzed AsA content*1 (mg/kg diet)
Added AsA content (mg/kg diet)Diets
Analyzed daysGGT (U/L)AST (U/L)BUN (mg/dL)TCHO (mg/dL)GLU (mg/dL)Ca (mg/dL) 50 daysCont1.6±0.5513±8001.6±0.9421±18100±2509.5±0.4 AsAⅠ2.0±1.2515±101.8±0.7422±34103±2109.8±0.3 AsAⅡ3.0±1.7608±5801.5±0.6430±22141±5509.4±0.6 AsAⅢ2.2±0.8687±130.9±0.3431±42087±1509.9±0.8 100 daysCont2.0±0.7399±612.7±0.6303±24088±1910.3±0.4 AsAⅠ2.0±0.0395±122.1±0.4302±35062±5009.5±0.2 AsAⅡ2.0±0.7407±393.6±0.3285±28100±2510.0±0.7 AsAⅢ2.2±0.8471±752.9±1.2279±28103±5910.3±0.4 Data were presented as mean±SD (n=5).
Diets
Table 2 Plasma components of rainbow trout fed experimental diets
50 or 60Cont1.28±0.29* 4.3±1.7a1.11±0.602.79±0.34 AsAⅠ1.44±0.28* 5.4±1.2a1.18±0.202.35±0.69 AsAⅡ1.51±0.44* 4.5±1.2a0.84±0.302.58±0.91 AsAⅢ1.33±0.28* 2.6±2.0a1.08±0.272.33±0.37 100Cont0.55±0.20a 6.6±1.2a0.77±0.211.81±0.32 AsAⅠ0.47±0.25a 6.4±1.3a0.95±0.092.20±0.82 AsAⅡ1.00±0.18a 4.8±1.9a0.88±0.202.12±0.48 AsAⅢ0.86±0.14a 3.3±1.9a0.91±0.262.67±0.70a Data were presented as mean±SD (n=5). a Significantly different from AsA0 (P<0.05)． * This value was measaured after 60 days of feeding trial．
Diets Liver
Table 3 Non-specific immune responses of rainbow trout fed experimental diets SOD activity (U/mg of protein)NBT reduction in kidney adherent cells (OD 630nm) Number of mucus cellsIntestine
Analyzed days
Body weight (g)
Days after feeding trial
Fig. 1 Growth curve of rainbow trout fed Cont (◆, 0mg/kg diet), AsAⅠ(□, 100 mg/kg), AsAⅡ(△, 1,000 mg/kg), and AsAⅢ(○, 5,000mg/kg) during 100 days 0
10 20 30 40
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 10 20 30 40 50 60
0 4 8 12 16 20 24
Cumulative mortality (%)
Days after thermal stress (hours)
Fig. 2 Changes in cumulative mortality of rainbow trout fed Cont (◆, 0mg/kg diet), AsAⅠ(□, 100 mg/kg), AsAⅡ(△, 1000 mg/kg), and AsAⅢ(○, 5000mg/kg) after 100 days of the feeding period. *Significantly different from controls (P< 0.05)
* * *
第3章 高濃度AsA投与に伴うサケ科魚類のAsA組織含有量の変化 第１節 緒言
前章の結果、100日間にわたる高濃度AsAの投与において、ニジマスでは副作用的現象 は確認されなかった。また、AsAを5,000 mg/kg dietの濃度で投与した魚体では、対照区と 比べ非特異的免疫能やストレス耐性向上効果が認められるなど、疾病予防法としての利用 が期待できる結果が得られた。しかし、長期間にわたる高濃度のアスコルビン酸の添加や 飼料への展着処理は、生産現場にとって価格的にも作業量的にも大きな負担となる。
そこで本章では、高濃度AsA 投与法の効率化を目的として、ニッコウイワナSalvelinus leucomaenis pluvius、ヒメマスO. nerka、およびニジマスの3魚種を供試魚として、AsAの 組織含有量を指標に、投与効果をもたらす最低投与期間および投与中止後の効果持続期間 について推定を試みた。またニジマスを供試魚として、AsA に比べ熱安定性などが高い AsA誘導体についても同様の解析を実施した。なお、AsA投与は前章において最も高い有 効性が確認された5,000 mg/kg diet の添加濃度のみで実施した。
第2節 材料および方法 1. 供試魚
AsA組織含有量の経時的変化に関する試験では、鬼怒川水系上流部で採捕された栃木県 内在来個体群を栃木県水産試験場（栃木水試）で継代飼育をしていた栗山系のニッコウイ ワナの稚魚（平均体重3.8ｇ）、中禅寺湖漁業協同組合で採卵・受精し発眼卵の状態で栃木 水試に運搬・育成されたヒメマス（平均体重2.2ｇ）、および前章と同一の黒磯系ニジマス の稚魚（平均体重6.2ｇ）、の3魚種を供試魚として用いた。なお、AsA誘導体を対象とし た試験は、黒磯系ニジマスを用いた（Table 4）。
1. 試験飼料 1）AsA
前章と同様の手順で、AsAが5,000mg/kg dietとなるように市販飼料に添加したものを試
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験飼料、非添加の飼料を対照飼料とした。なお、ニジマスの飼育試験に使用した飼料を対 象に前章と同様の手順で試験および対照飼料のAsA含有量を測定した結果、それぞれ4,942 および57 mg/kg dietであった（Table 4）。
2）AsA誘導体
AsA誘導体にはSodium, calcium ascorbyl-2-phosphate（APSC：STAY-CⓇ35，DSMニュー トリションジャパン）を用いた。APSCは、AsA量換算で5,000 mg/kg dietとなるよう添加 したものを試験飼料、サラダオイルのみ加えたものを対照飼料とした。なお前章と同様の 手順で試験および対照飼料のAsA含有量を測定したところ、それぞれ133および57 mg/kg 飼料であった（Table 4）。試験飼料のAsA濃度が低いのは、本研究手法ではAPSC量を求 めることができず、APSCから還元されたAsAのみを検出したためである。
3）飼育試験
飼育実験毎に、一定期間試験飼料を給餌するAsA投与区（AsA group）および試験期間 を通して対照飼料のみを与える対照区（Cont group）の2区を設け、実験を行った（Table 4）。 詳細な手順は下記に示す。
飼育実験Ⅰ（ニッコウイワナ）
飼育試験では、13.0（±1.0）℃に調温したオゾン殺菌河川水を5.0 L/minの割合で注水し
た250 LヨーロピアンタイプFRP水槽（110×110×65 cm）を使用した。1水槽当り178尾
収容したものを2槽用意し、１つの水槽はAsA投与区として魚体重3.0%の割合で毎日30 日間試験飼料の与えた後、対照飼料を12日間給餌した（AsAⅠ）。また、もう一水槽は対 照区として同一期間、対照飼料のみを与えた（ContⅠ）。そして両試験区ともに、試験開始 直前、試験飼料給餌3、7、14、30日後、および対照飼料に切り替えて3、6、9、12日後に 5 尾ずつ取り上げ、魚体重、体長、全長、および肝臓重量指数を求めた。次に解剖して肝 臓、腎臓、鰓、および腸管を採取し、魚体が小さかったため組織毎にプールしたものをAsA
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組織含有量測定試料として、使用時まで-80℃で保存した。
飼育実験Ⅱ（ヒメマス）
飼育試験には、飼育実験Ⅰと同様に調温・殺菌した河川水を3.0 L/minの割合で注水した 250L長方形FRP水槽（140×60×50 cm）を用いた。1水槽当り300尾を収容したものを2 槽用意し、一つの水槽は実験Ⅰと同様の手順で 28 日間試験飼料を与えた後、対照飼料を 21日間給餌した（AsA Ⅱ）。また、もう一水槽は対照区として同期間対照飼料のみを与え た（Cont Ⅱ）。そして両試験区ともに、試験開始直前、試験飼料給餌7および28日後、お よび対照飼料に切り替えて3、7、14、21日後に飼育実験Ⅰと同様の手順で魚体を取り上げ、
各種測定および組織の採取・保存を行った。なお、本実験では腸管の替わりに筋肉組織を 採取した。
飼育実験Ⅲ（ニジマス）
飼育実験Ⅰと同様の手順・期間で200尾収容した水槽を2槽用意し、それぞれAsA（AsA
Ⅲ）および対照区（ConⅢ）として、飼育実験および魚体の取り上げを行った。なお、AsA 区において市販飼料に切り替えた後は、両区ともに肝臓組織のみ採取した。また、飼育期 間を通して採取した組織はプールせず、個体毎に保存・測定に用いた。
飼育実験Ⅳ（ニジマス）
実験Ⅲと同様の手順・期間でAPSC添加飼料を給餌したAsA（AsA Ⅳ）および対照区（Cont
Ⅳ）を設け、実験を行った。
4）AsA含量の測定
組織中のAsA含量の測定は、前章と同様の手順で実施した。なお、ニッコウイワナおよ びヒメマスは等量の各組織を5尾ずつプールしたものを1ロットとして解析したのに対し、
ニジマスは個体毎に測定を行った。
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