新規 新規
新規 新規 Formosa 属細菌の分類学的検討 属細菌の分類学的検討 属細菌の分類学的検討 属細菌の分類学的検討
平成 平成 平成
平成24242424年度年度年度年度
三重大学大学院 三重大学大学院三重大学大学院
三重大学大学院 生物資源学研究科生物資源学研究科 生物資源学研究科生物資源学研究科 生物圏生命科学専攻生物圏生命科学専攻生物圏生命科学専攻生物圏生命科学専攻 博士前期課程
博士前期課程博士前期課程 博士前期課程
宮脇弘光 宮脇弘光宮脇弘光 宮脇弘光
1 目次 目次 目次 目次
1. 緒言
2. 目的
3. 材料および方法 3-1. 使用菌株
3-2. 生化学的性状の決定 3-2-1. 海藻分解性試験 3-2-2. 有機物利用性試験 3-2-3. コロニー色 3-2-4. 細菌の形態 3-2-5. 各種酵素活性試験 3-2-6. 各種物質分解性試験 3-2-7. 各種生育条件
3-3. 16S rRNA遺伝子系統解析
3-3-1. PCR法による16S rRNA遺伝子増幅
3-3-2. サイクルシークエンスによる塩基配列決定
3-3-3. 系統解析 3-4. 供試培地・試薬
4. 結果
4-1. 生化学的性状の決定
2 4-1-1. 海藻分解性試験
4-1-2. 有機物利用性試験 4-1-3. コロニー色 4-1-4. 細菌の形態 4-1-5. 各種酵素活性試験 4-1-6. 各種物質分解性試験 4-1-7. 各種生育条件
4-2. 16S rRNA遺伝子系統解析
5. 考察
6. 謝辞
7. 参考文献
3
1. 緒言
近年、環境負荷が少ないバイオマス燃料などの再生可能エネルギーや資源の増産が行わ れている。しかし現状ではトウモロコシやサトウキビなど食糧として利用される穀物が主 要な原料として用いられており、将来的な人口増加も加わると食糧生産との激しい競合が 起こる可能性がある。そのため、食糧生産とあまり競合しない生物資源の有効利用が重要 となっている。
その中で食糧生産との競合が小さいと考えられる海藻の有効利用が期待されている。海 藻の有効利用については各種海藻構成多糖類を微生物によって分解し、発酵・化学処理す ることで有機素材や化学薬品、バイオ燃料を生産する研究が有力視されている。これには 高い海藻構成多糖類の分解能を有する微生物が有益な役割を果たすと考えられ、その発見 が重要となっている。海藻構成多糖類の分解能を有する微生物は海水中のみならず海藻を 主食とする生物の消化管内においても存在が確認されている。
本研究室ではメガイアワビHaliotis gigantea消化管内より褐藻分解能をもつ分離株を4株 取得している。これらの分離株は海洋性の好気性従属栄養細菌に属する Formosa 属細菌で あることが示唆されていた。各種海藻構成多糖類に対して顕著な分解能を有する本菌は、
褐藻類のさらなる有効利用を探るうえで有益な要素になると考えられる。そこで本研究で はこれらの分離株を新規 Formosa 属細菌として登録することを目的として、本菌の諸性状 を詳細に調査し、分類学的検討を行った。
4
2．目的
本研究ではメガイアワビ消化管内より分離された 4 株をそれぞれ MA1, MA2, MA3, MA4 株として新規のFormosa属細菌として新たに分類し、登録することを目的として行っ た。
実験方法は既知のFormosa属細菌であるFormosa algae およびFormosa agariphila との比 較、検討を行うことを中心として決定された。旧来からの生化学的性状の比較に加えて、
遺伝子系統解析を行うことにより分類の確実性を高めた。生化学的性状を決定する実験で は海藻分解性試験とアルギン酸分解性試験も併せて行うことで 4 株の海藻分解能と海藻構 成多糖類分解能に関しても知見を得ることを試みた。
5
3. 材料および方法
3-1. 使用菌株
検討を行った菌株は、メガイアワビ消化管より分離され Formosa 属細菌であることが示 唆されていたMA1株、MA2株、MA3株、MA4株である。これら4株はZoBell 2216E斜 面培地で継代培養を行った。
3-2. 生化学的性状の決定 3-2-1. 海藻分解性試験
菌体をBSL(Basal seawater liquid)培地で洗浄、懸濁した。懸濁液を海藻試料が投入さ れたBSL培地に接種し20℃、5日間の条件で培養を行った。培養液中の海藻試料の状態 観察を 1 日おきに行った。海藻試料にはマコンブ(Saccharina japonica)、ワカメ(Undaria pinnatifida)、アナアオサ(Ulva pertusa)を実験に供した。
3-2-2. 有機物利用性
グリセロール利用能試験
13mmφ培養試験管に1%グリセロール含BSL培地5mlとダーラム管を入れたものを 試験培地として用いた。各分離株をZoBell 2216E液体培地で培養後、15000 g, 1分間遠 心分離により菌体を採取した。そして、菌体をBSL培地で洗浄、懸濁した。懸濁液を上 記液体培地に接種し20℃、5日間静置培養を行い、懸濁の確認されたものを陽性とし、
また、ダーラム管内に気体を生じたものをガス産生能陽性とした。
3-2-3. コロニー色
コロニー色は上記継代培養中のコロニーを目視にて観察した。
6 3-2-4. 細菌の形態
(1) 形態観察および運動性試験
光学顕微鏡による観察にて行った。
(2) グラム染色
滅菌した1/3ASWで菌体を懸濁後に乾燥固定した。固定後、クリスタルバイオレ
ット液を滴下後1分、ルゴール液滴下後1分、サフラニン液滴下後30秒の順でグ ラム染色を行い、光学顕微鏡にて観察を行った。
(3) べん毛染色
滅菌した80mM MgSO4 に菌体を懸濁後に乾燥固定した。乾燥後、第一液を滴下 し、4分間染色した。次に第二液を滴下し弱火で加熱後、4分間染色を行い、蒸留 水で水洗後に光学顕微鏡にて観察を行った。
(4) 芽胞染色
滅菌した1/3ASWで菌体を懸濁後に乾燥固定した。固定後、5%マラカイトグリ ーン液で３分間染色し、水洗した。さらに 0.5%サフラニン溶液で３０秒染色後、
水洗し検鏡により芽胞の有無の確認を行った。
(5) OF試験
MOF培地に菌体を20℃、7日間の条件で穿刺培養した。培養後、MOF培地の 色の変化を観察した。
7 (6) 滑走による運動性確認試験
各分離株をZoBell 2216E液体培地で培養後、ZoBell2216E平板培養に滴下し、20℃、
2日間培養を行った。その後、顕微鏡を用いて滑走による運動性の有無を確認した。
3-2-5. 各種酵素活性
(1) オキシターゼ活性試験
菌体を 1% N,N,N’,N’-テトラメチル-ρ-フェニレンジアミン水溶液をしみ込ませ た濾紙に塗沫し、色の変化時間を観察することで行った。
(2) カタラーゼ活性試験
菌体への3% H2O2の滴下によるO2発生の有無によって行った。
(3) ウレアーゼ活性試験
菌体をUrea液体培地に接種後、20℃、２−１４日間培養を行った。培養後、 培 地の変色の確認を行った。深紅色に変化したものをウレアーゼ陽性とした。
3-2-6. 各種物質分解性試験
(1) 寒天分解性試験
菌体をZoBell 2216E平板培地に接種、培養し菌体周辺の培地の沈み込みの有無 を観察した。
(2) アルギン酸分解性試験
アルギン酸ナトリウムを0.5%含むZoBell 2216E平板培地(APY培地)で20℃、5 日間の条件で培養した。培養後に70%エタノールを平板上に満たし、室温で30分
8
間放置後、コロニー周囲のクリアゾーンの有無を観察した。
(3) スターチ分解性試験
Starch 平板培地に菌体を滴下し 20℃、5日間の条件で培養を行った。培養後に
平板上にヨウ素液を滴下し、クリアゾーンの有無を観察した。
(4) DNA分解性試験
市販の DNA 寒天培地()を用いて作製した平板培地に菌体を接種し、20℃、5 日 間の条件で培養した。培養後に平板上を1.5N HClで満たし、室温で15分間放置 後にコロニー周囲のクリアゾーンの有無を観察した。
(5) ゼラチン分解性試験
ゼラチンを0.5%含むZoBell 2216E平板培地に菌体を接種し20℃、5日間の条 件で培養した。培養後に平板上に塩酸昇こう水を満たし、クリアゾーンの有無を観 察した。
(6) カゼイン分解性試験
菌体をCasein平板培地に菌体を接種し20℃、5日間培養を行った。培養後,クリ アゾーンの有無を観察した。
(7) Tween80分解性試験
菌体を1% Tween80および0.001% CaCl2 2H2Oを添加したZoBell 2216E平板 培地に滴下後20℃、5日間培養を行った。培養後, CaCl2顆粒の有無を観察した。
9 3-2-7. 各種生育条件
(1) Na+要求性
菌体を塩類要求一次培地（1/10 ZoBell 2216E培地）で白濁する程度まで前培養 を行った。これから1白金耳ずつNaCl濃度を0-8%に調整した塩類要求性培地に 接種し、２０℃で７日間培養を行い、菌の発育の有無を確認した。
(2) pH耐性
菌体をpH4-12に調整したZoBell 2216E液体培地に接種し、２０℃で７日間培 養を行い、菌の発育の有無を確認した。
(3) 温度耐性
菌体を ZoBell 2216E液体培地に接種し、各温度（4, 20, 25, 30, 37℃)で７日間 培養を行い、菌の発育の有無を確認した。
3-3. 16S rRNA遺伝子系統解析
3-3-1. PCR法による16S rRNA遺伝子増幅
菌株をZoBell 2216E液体培地に接種し25℃で一晩振とう培養した。遠心分離を15,000 rpmで2分間行い、集菌した。次に100℃、5分間でDNAを熱水抽出法により抽出した。
抽出したDNA の16S rRNA 遺伝子領域をPCR 法によって増幅した。プライマーには E8f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、E1492r (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’) を使用した。温度条件は熱変性(95.0℃、240 秒)を 1 サイクル後に、熱変性(95.0℃、30 秒)、アニーリング(57.0℃、30秒)、伸長反応(72.0℃、90秒)を25サイクルとした。
3-3-2. サイクルシーケンスによる塩基配列決定
10
3-3-1で作製したPCR産物にBig Dye Terminator によるサイクルシークエンスを行 いラベリングした。プライマーにはE8fを用い、温度条件は熱変性(95.0℃、240秒)1サ イクル後、熱変性(95.0℃、10秒)、アニーリング(55.0℃、5秒)、伸長反応（60.0℃、240 秒）を 25 サイクルとした。DNA シークエンサーABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて塩基配列を得た。
3-3-3. 系統解析
3-3-2 で決定した塩基配列を遺伝子解析ソフト Chromas Lite を用いて編集後、
National Center for Biotechnology Information(NCBI) の ホ ー ム ペ ー ジ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上のBLASTを利用して塩基配列の相同性検索を行い、近 縁種を調べた。さらにMEGA version 4を用いてブートストラップ検定を行い、系統樹 を作製した。
3-4. 供試培地
3-4-1. 供試培地
(1) ZoBell 2216E agar medium
Polypeptone 5 g
Yeast extract 1 g
Agar 15 g
75 % Natural seawater(NSW) 1000 ml
pH 7.5
(2) BSL medium
NH4Cl 0.9 g
11
KH2PO4 0.0675 g
FeSO4・7H2O 0.0252 g
Artificial sea water (ASW) 390 mL
DW 390 mL
Tris 5.49 g
pH 7.5
(3) MOF medium
Bacto Casitone 1 g
Yeast extract 0.1 g
(NH4)2SO4 0.5 g
Tris 0.5 g
Phenol red 0.01 g
Agar 3 g
75% ASW 1000 mL
Glucose 5.0 g
pH 7.5
(4) Urea medium
Polypepton 2 g Urea 30 g Na2HPO4 1 g KH2PO4 1 g Phenol Red (0.2 %) 5 mL
12
75% NSW 1000 mL pH 6.8 (5) APY agar medium
Polypeptone 5 g
Yeast extract 1 g
Sodium alginate 5 g
Agar 15 g
75 % Natural seawater 1000 ml
pH 7.5
(6) Starch agar medium
Polypeptone 10 g
Yeast extract 3 g
NaCl 3 g
Sluble starch 2 g
Agar 15 g
75% NSW 1000 mL
pH 7.2-7.4
(7) DNA agar medium
(8) 0.5% Gelatin ZoBell 2216E medium
Polypeptone 5 g
Yeast extract 1 g
13
Gelatin 5 g
Agar 15 g
75 % Natural seawater (NSW) 1000 ml
pH 7.5 (9) Casein agar medium
Polypepton 5 g Yeast extract 3 g NaCl 3 g Skim milk powder 15 g Agar 15 g
75% NSW 1000 mL pH 7.0
14 4. 結果
4-1. 生化学的性状の決定
海藻分解性試験を除く生化学的性状の決定結果をtable 4-1, 4-2, に示した。
4-1-1. 海藻分解性試験
各海藻試料の1日目と5日目の状態をfig.4-1に示した。褐藻類であるコンブとワカメ は大部分が分解された。緑藻類であるアオサは分解されなかった。
4-1-2. 有機物利用性
(1) グリセロール利用能試験
グリセロール利用能は確認されなかった。
4-1-3. コロニー色
4株とも黄色のコロニー色を示した。
4-1-4. 細菌の形態
(7) 形態観察および運動性試験
4株とも桿菌の形態をしており、運動性は確認されなかった。
(8) グラム染色
ペプチドグリカン層の染色が見られず、4株ともにグラム陰性を示した。
(9) べん毛染色
べん毛は確認されなかった。
(10) 胞子染色
4株とも染色部位が確認されず、胞子形成を行っていなかった。
(11) OF試験
4株とも嫌気性条件下でのMOF培地の色変は確認されず、Oxidativeの判定
15 を示した。
(12)滑走による運動性確認試験
4株とも滑走による運動が確認された。
4-1-5. 各種酵素活性
(4) オキシターゼ活性試験
4株とも10秒以内に色変を示し、陽性であることが確認された。
(5) カタラーゼ活性試験
4株とも酸素を発生し、陽性であることが確認された。
(6) ウレアーゼ活性試験
ウレアーゼ活性は確認されなかった。
4-1-6. 各種物質分解性試験
(8) 寒天分解性試験
4株とも培地への沈み込みを示し、陽性であることが確認された。
(9) アルギン酸分解性試験
4株ともクリアゾーンが発現し、陽性であることが確認された。
(10) スターチ分解性試験
4株とも陽性であることが確認された。
(11) DNA分解性試験
4株ともクリアゾーンを発現せず、陰性であることが確認された。
(12) ゼラチン分解性試験
4株ともわずかながらクリアゾーンが発現し、擬陽性であることが確認された。
(13) カゼイン分解性試験
4株とも陰性であることが確認された。
16 (14) Tween80分解性試験
4株とも陰性であることが確認された。
4-1-7. 各種生育条件 (1) Na+要求性
4株ともNaCl濃度1%~4%の間で生育が確認された。
(2) pH耐性
4株ともpH6~9の間で生育が確認された。
(3) 温度耐性
4株とも20℃～30℃の間で生育が確認された。
4-2. 16S rRNA遺伝子系統解析
4株の近縁種との相同率をtable 4-3に示した。4株ともFormosa algaeとの間でもっと も高い相同性を示した。相同率はMA1 株98%、MA2 株97%、MA3株97%、MA4株 97%をそれぞれ示した。作製した系統樹をfig.4-2に示した。
17 Table
Table Table
Table 4444----1111. . . . Major phenotypic charateristics of MA1, 2, 3, 4.
O, oxidative. +, positive. -, negative. w, weakly positive.
MA1 MA2 MA3 MA4
Source Gut of the abalone Gut of the abalone Gut of the abalone Gut of the abalone
Gram staining - - - -
Morphology Rod Rod Rod Rod
Colony color Yellow Ye llow Yellow Yellow
Motility - - - -
OF te st O O O O
Oxidase activity + + + +
Catalase activity + + + +
Flagellum - - - -
Forming spore - - - -
Motility of glinding + + + +
Degradation of
Agar + + + +
Arginate + + + +
Tween 80 - - - -
Ge ratine w w w w
Starch ＋ ＋ ＋ ＋
Caze in - - - -
DNA - - - -
Urease - - - -
Utilization of
Glyce rol - - - -
18
Table 4-2. Major phenotypic charateristics of MA1, 2, 3, 4.
+, growth. -, non-growth.
MA1 MA2 MA3 MA4
Require of Na+
0% - - - -
1% + + + +
2% + + + +
3% + + + +
4% + + + +
5% - - - -
6% - - - -
8% - - - -
pH
4 - - - -
5 - - - -
6 + + + +
7 + + + +
8 + + + +
9 + + + +
10 - - - -
11 - - - -
12 - - - -
Tempe rature (℃℃℃℃)
4 - - - -
20 + + + +
25 + + + +
30 + + + +
37 - - - -
19 Table
Table Table
Table 4444----3333.... Homology of MA1, 2, 3, 4 according to 16S rRNA gene
MA1 MA2 MA3 MA4
Homology 98%(98,05%) 97%(97,92%) 97%(97,64%) 97%(97,91%) Formosa algae Formosa algae Formosa algae Formosa algae
20
Day1. S. japonica Day2. U. pinnatifida
Day1. U. pertusa Day5. S. japonica
Day5. U. pinnatifida Day5. U. pertusa
Fig.4-1. Degradation of the brown alga(Saccharina japonica, Undaria pinnatifida) and green alga(Ulva pertusa)
21
Fig.4-2. Phylogenetic position of MA1, 2, 3, 4 according to 16S rRNA gene sequence analysis.
22 5. 考察
既存種を含めた生化学的性状をtable 5-1, 5-2に示した。本菌の分類学的検討のために既 知のForomosa属細菌であるF. algaeとF. agariphilaとの比較を行った。
F. algaeとF. agariphilaはそれぞれ褐藻表面、緑藻表面と海水中から分離されている。加
えて、本研究で対象となったMA1~4株はすべてメガイアワビ消化管内より分離された。こ のことからFormosa属細菌は様々な海洋環境中に普遍的に存在しているものと考えられる。
本菌は海藻分解性試験において 2 種類の褐藻を顕著に分解したことから強力な褐藻分解 能を有していることが確認された。特に褐藻の主要な構成多糖成分の一つであるアルギン 酸に対する高い分解能が大きく寄与していると考えられる。一方で緑藻に対しては顕著な 分解能が見られなかったため、F. algaeと同様に本菌の海藻分解能は褐藻類のみに限定され ると示唆された。
実験により判明した本菌の各生化学的性状はMA1~MA4株の間では違いが見られなかっ
た。F. algaeとの比較ではオキシダーゼ活性、寒天分解性、スターチ分解性、ウレアーゼ活
性、グリセロール利用能、塩分耐性、pH耐性の6項目で違いが見られた。F. agariphilaと の比較ではゼラチン分解性、塩分耐性の 2 項目で異なる結果となっていた。このことから 本菌の生化学的性状はF. algaeよりもF. agariphilaにより近いものであると考えられる。ま た、本菌は塩分耐性が1~4%、pH耐性が6~9と既存のFormosa属細菌よりも耐性の範囲が 狭くなっていることも特徴である。
16S rRNA 遺伝子系統解析で作製した系統樹をもとに系統学上での検討を行った。
MA1~4株は既存のFormosa属細菌とはクラスターを形成していない。さらに4株の中でも、
MA1株はMA2,3,4株と同クラスターではないことがわかった。MA1株はもっとも相同性
の高いF. algaeとの相同率でも他の3株が97%であるのに対し、98%と高かった。
以上の結果を総合すると、MA2,3,4,株については既存の Formosa属細菌との間で生化学
23
的性状に相違点が見られること、遺伝子系統解析で異なる系統群であると考えられること から新規のFormosa属細菌であることが強く示唆された。MA1株については生化学的性状
においてMA2,3,4 株と同一の性状であったものの、遺伝子系統解析での相同性が低いため
さらに詳しい検討が必要と考える。
24
Table 5-1. Comparing MA1, 2, 3, 4 with F. algae and F. agariphila.
O, oxidative. +, positive. -, negative. w, weakly positive.
MA1 MA2 MA3 MA4 Formosa algae KMM3553 F. agariphila KMM3901 F. agariphila KMM3962
Gram staining - - - - - - -
Morphology Rod Rod Rod Rod Rod Rod Rod
Colony color Yellow Yellow Yellow Ye llow Yellow Yellow Ye llow
Motility - - - - - - -
OF test O O O O O O O
Oxidase activity + + + + - + +
Catalase activity + + + + + + +
Flage llum - - - - - - -
Forming spore - - - - - - -
Motility of glinding + + + + + + +
Degradation of
Agar + + + + - + +
Arginate + + + +
Twee n 80 - - - - - - -
Geratine w w w w w + +
Starch ＋ ＋ ＋ ＋ w - -
Cazein - - - - - -
DNA - - - - - - -
Ure ase - - - - + - -
Utilization of
Glycerol - - - - + ‐‐‐‐ ‐‐‐‐
25 Table 5
Table 5Table 5
Table 5----2222.... Comparing MA1, 2, 3, 4 with F. algae and F. agariphila.
+, growth. -, non-growth
MA1 MA2 MA3 MA4 Formosa algae KMM3553 F. agariphila KMM3901 F. agariphila KMM3962
Require of Na+
0% - - - - 0~6% 1~8% 1~7%
1% + + + +
2% + + + +
3% + + + +
4% + + + +
5% - - - -
6% - - - -
8% - - - -
pH
4 - - - - -
5 - - - - +
6 + + + + +
7 + + + + +
8 + + + + +
9 + + + + +
10 - - - - +
11 - - - - -
12 - - - - -
Te mpe rature (℃℃℃℃)
4 - - - - -
20 + + + + +
25 + + + + +
30 + + + + +
37 - - - - -
26 6. 謝辞
本論文に関する研究、執筆において終始適切な御指導、御鞭撻を頂いた三重大学生物資 源学部生物圏生命科学科海洋生物科学講座准教授田中礼士博士に心から感謝を申し上げる。
同じくご協力を頂いた家畠俊平博士をはじめ海洋微生物学研究室の方々にも深い感謝を 申し上げる。
27 7. 参考文献
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Natalia V. Zhukova, Natalia V. Zhukova,
Natalia V. Zhukova, Natalia M. Gorshkova,Valery V. Mikhailov, Dan V. Nicolau1 Natalia M. Gorshkova,Valery V. Mikhailov, Dan V. Nicolau1 Natalia M. Gorshkova,Valery V. Mikhailov, Dan V. Nicolau1 Natalia M. Gorshkova,Valery V. Mikhailov, Dan V. Nicolau1 and Richard Christen
and Richard Christen and Richard Christen
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Anatoly M. Lysenko, Manfred Rohde, Anatoly M. Lysenko, Manfred Rohde,
Anatoly M. Lysenko, Manfred Rohde, Galina M. Frolova, Natalia V. Zhukova,Galina M. Frolova, Natalia V. Zhukova,Galina M. Frolova, Natalia V. Zhukova,Galina M. Frolova, Natalia V. Zhukova, Valery V. Mikhailov,
Valery V. Mikhailov, Valery V. Mikhailov,
Valery V. Mikhailov, Kyung Sook Bae, Hyun Woo Oh and Jean SwingsKyung Sook Bae, Hyun Woo Oh and Jean SwingsKyung Sook Bae, Hyun Woo Oh and Jean SwingsKyung Sook Bae, Hyun Woo Oh and Jean Swings....(2006) Formosa agariphila sp. nov., a budding bacterium of the family Flavobacteriaceae
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