学位論文の内容の要旨
論 文 提 出 者 氏 名 NASSAR Mohannad Issa Michael論 文 審 査 担 当 者 主 査 高久田 和夫
副 査 高橋 英和 砂川 光宏
論 文 題 目 Overcoming the Adverse Effects Related to the Use of Smear Layer Removal Agents: Phosphoric Acid as Etchant and EDTA as Chelating Agent
（論文の内容の要旨）
Introduction
Phosphoric acid (PA) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) are two agents that are still clinically
used to the remove smear layer created on dentin surfaces after various dental treatments. Despite the
development of resin adhesive systems and the advent of self-etch adhesives, PA is the etching agent of
choice in etch-and-rinse adhesives. It removes the inorganic part of the smear layer exposing a collagen
network that would be later infiltrated with resin to form the hybrid layer. EDTA is the most commonly
used chelating agent in root canal treatment that is used in a concentration of 17% and an application time
of 1-5 minutes. It is applied as a final rinse before obturation to remove the smear layer created on root
canal dentin surfaces during instrumentation as sodium hypochlorite (NaOCl), the main irrigant in root
canal treatment, is not effective to completely remove the smear layer. Regardless of the popularity of PA
and EDTA, they are not without their drawbacks. PA etching results in the formation of fragile dentinal
collagen network that are denuded of hydroxyapatite thus susceptible to collapse resulting in poor
infiltration of resin. PA etching also results in the activation of host-derived dentinal matrix
metalloproteinases (MMPs) which could degrade dentinal collagen. The two aforementioned effects
contribute to a compromised resin-dentin bonding. Moreover; PA application on dentin increases the
permeability of the latter thus allowing resin monomers especially 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA)
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to negatively affect the pulpal cells causing apoptotic cell death. EDTA, a synthetic and not readily
biodegradable material which is considered as a pollutant, can show some cytotoxic effect on osteoblast
cells if extruded beyond the apical foramen thereby hampering the healing of the periradicular area after
root canal treatment. Considering these facts the search for a more biocompatible material to replace
EDTA as a chelating agent is still going on. Non-protein thiols (NPSH), namely reduced glutathione
(GSH) and n-acetylcysteine (NAC), are a group of antioxidants that are crucial for detoxification of a
number of cytotoxic products especially resin monomers. Several mechanisms have been proposed for this
detoxification action; however, direct interaction between the cysteine residue and resin monomers was
speculated to be the main mechanism. They also have the ability to inhibit MMPs through binding with
MMPs active-site zinc. Phytic acid (IP6) is a naturally occurring substance in plants and mammalian cells.
It can be extracted with a low price from rice bran. This agent is highly negatively charged, therefore it has
the ability to chelate with multivalent cations such as calcium.
Aims
The purpose of these studies were to evaluate the detoxification effect of NPSH on HEMA cytotoxicity
on pulpal-like cells and their inhibitory effect on dentinal MMPs that are activated by the use of PA.
Furthermore; we evaluated the effect of IP6 used as etchant and chelating agent on the bond strength of
resin adhesives to dentin and smear layer removal from flat dentinal surfaces and instrumented root canals.
Finally, IP6 effect on the viability of pulpal-like cells and the viability and alkaline phosphatase activity
(ALP) of osteoblast-like cells were assessed. Methodology Flat dentin discs and dentin powder, used in
these studies, were obtained from the coronal part of sound human molar teeth while the roots were
obtained from sound human anterior teeth. Pulpal-like cells (RPC-C2A) established from dental pulp of rat
incisors and osteoblast-like cells (MC3T3-E1) established from mouse calvaria were used in the conducted
studies. The effect of different concentrations of GSH (2%, 5% or 10%) on the bond strength of
etch-and-rinse resin adhesive to flat dentin discs and the effect of GSH (1 mM, 5 mM or 10 mM) and NAC
performed. Dentin powder was used to study the effect of PA on the activation of MMPs and to assess the
ability of NPSH to deactivate these MMPs. The etching effect of 1% IP6 on smear-layered flat dentin discs
and instrumented root canals were evaluated and compared to 37% PA and 17% EDTA. The effect of IP6
on the adhesion of resin adhesive to dentin was performed and its effect on pulpal- and osteoblast-like cells
was also evaluated.
Results
The effect of GSH on the toxicity of 10 mM HEMA was dose dependent; 10 mM GSH abolished the
toxic effect of HEMA on pulpal-like cells for 24 hours and its effect was comparable to 10 mM NAC. GSH
of 5 mM concentration was only effective to protect the cells from HEMA toxicity at the 6-hour exposure
time; however, it lost its effectiveness at the 24-hour exposure time. On the other hand, 1 mM GSH
showed no ability to protect the pulpal cells at the two mentioned exposure times. PA activated dentinal
MMPs while the use of NPSH (2% NAC or 2% GSH) resulted in their inhibition which was comparable to
the effect of chlorhexidine (gold standard MMPs inhibitor). The use of GSH (2%, 5% or 10%) on etched
dentin had no immediate effect on resin-dentin bond strength. The use of 1% IP6 as etching resulted in
enhanced resin-dentin bond strength, clean dentinal surfaces and it showed minimal effect on pulpal-like
cells when compared to PA. IP6 used as a final rinse showed the effectiveness to remove the smear layer
from instrumented root canals. IP6 did not affect the viability or ALP activity of osteoblast-like cells when
compared to EDTA.
Conclusions
The used NPSH showed promising results to be used as HEMA detoxification agents and dentinal MMP
inhibitors, these two properties might contribute to decreased postoperative sensitivity and enhanced
resin-dentin bond durability; respectively. IP6 has the potential to replace PA in etch-and rinse adhesives as
the former resulted in better resin adhesion to dentin and showed minimal effect on the viability of
pulpal-like cells. IP6 can be an alternative root canal chelating agent due to its effectiveness in removing
- 4 - 【日本語要約】 リン酸（PA）とエチレンジアミン四酢酸（EDTA）は、歯科保存治療においてスメアー層除去 のために使われている。しかし、PA は象牙質に内在するマトリックスメタロプロテアーゼ （MMPs）を活性化させ、また PA 処理された象牙質では低分子のモノマーが浸透しやすくなるこ とから、接着界面および歯髄細胞への影響が懸念される。また EDTA は細胞毒性を有しており、 根尖周辺組織などへの影響が懸念されている。これに対し非タンパク質チオールのグルタチオン は、歯髄細胞に毒性を有するメタクリル酸 2-ヒドロキシエチル（HEMA）から細胞を保護する機 能を有するとともに MMPs の活性を抑制する作用があること、また動植物の組織に存在するフィ チン酸（IP6） は、ミネラル除去効果に優れるキレート剤であることが知られている。そこで本 研究ではグルタチオンによる HEMA の毒性からの細胞保護作用と MMPs の抑制作用を評価し、IP6 に関しては、そのスメアー層除去の効果と歯髄細胞様細胞と骨芽細胞様細胞への毒性を EDTA と 比較した。その結果、グルタチオンは HEMA の毒性から細胞を保護し、MMPs の活性化を抑制す ることが示された。また IP6 でスメアー層を除去した場合、PA と比較して象牙質に対するレジン の接着強さが向上し、歯髄細胞様細胞への毒性も見られなかった。これらより、グルタチオンは 接着修復で窩洞に使用した場合、歯髄保護および接着性向上に効果があること、また IP6 を根管 洗浄剤として使用した場合には、生体に安全かつ有効なスメアー層除去効果を持つことが示唆さ れた。
論文審査の要旨および担当者
報 告 番 号 甲第 4788 号 NASSAR Mohannad Issa Michael
論文審査担当者 主 査 高久田 和夫 副 査 高橋 英和 砂川 光宏 （論文審査の要旨） レジン接着での歯面処理において、リン酸は汎用されているエッチング剤であるが、スメア ー層を除去する際に象牙質内在性のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）を活性化させ、 またリン酸処理された象牙質では低分子モノマーが浸透しやすくなることが知られている。そ のために接着界面の劣化を引き起こしたり、毒性を有するモノマーが歯髄細胞に影響したりす る可能性が残されている。特に歯質への浸透性向上のために親水性のメタクリル酸2-ヒドロキ シエチル（HEMA）が接着剤に配合されていることから、リン酸処理がその歯髄組織への為害 性を助長することが懸念されている。 また根管治療においては根管内に感染源を残さないよう根管壁スメアー層を除去すること は 良 好 な 根 管 治 療 の 予 後 を 得 る た め に 重 要 で あ り 、 こ の た め に エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 （EDTA）が広く使われている。しかし EDTA は細胞毒性を有しており、根尖孔外へ溢出させ た場合の根尖周辺組織への影響が懸念されている。さらに殺菌作用と有機質溶解作用を期待し て次亜塩素酸ナトリウム溶液が根管洗浄に使用されているが、残留溶液とEDTA が反応すると 有害な塩素ガスの発生及び発熱が起こるために臨床応用では注意が必要である。 申請者はこれらの問題を解決するために、細胞を保護する機能や MMPs の活性を抑制する作 用を持つ非タンパク質チオールのグルタチオン、及び天然のキレート剤であるフィチン酸の応 用を検討したものであり、臨床的な問題を解決するための優れた着眼といえる。 本研究では、以下のように三つの成果が得られている。まずグルタチオンの HEMA の毒性 に対して細胞を保護する効果と、MMPs の活性化を抑制する効果の検討である。グルタチオン は非タンパク質チオールのトリペプチドであり、水溶性の抗酸化物質として細胞レベルでの生 理的機能を有して解毒作用に関与している物質である。したがってグルタチオンを歯髄細胞保 護の観点から歯科修復治療に応用しようという試みは新規性に富み、高く評価できる。本研究 では HEMA モノマーの細胞毒性を軽減する効果を検討しているが、これはリン酸による歯面 処理後に象牙質の浸透性が高まり親水性低分子モノマーの HEMA が歯髄に浸透した場合を想 定したもので、適切な設定と評価できる。またリン酸によって活性化された MMPs の抑制に ついても検討を加え、さらにグルタチオンをリン酸エッチング処理後の歯面に塗布した場合の 象牙質接着強さへの影響も評価している。具体的には歯髄細胞様細胞を使い、HEMA とグル タチオンのMTT 細胞毒性アッセイテストを行った結果、HEMA 単独では毒性が認められたが、 グルタチオンを加えた場合は毒性が認められなかった。さらにゼラチンザイモグラフィー法で 象牙質に内在するMMP-2 の活性を調べた結果、リン酸処理では MMP-2 が活性化されたが、 グルタチオンの添加によりMMP-2 の活性化が抑制された。またエッチアンドリンス接着シス
( 2 ) コンポジットレジン試験片を微小引張試験にて評価した結果、グルタチオン塗布は接着強さに 影響しなかった。以上のようにグルタチオンの HEMA 毒性に対する細胞保護効果、および MMP-2 の活性化抑制効果が認められたことから、臨床応用の可能性が期待される。 次はフィチン酸を用いたスメアー層除去法の検討である。フィチン酸（イノシトール6 リン 酸）は植物や哺乳動物などの組織に存在しており、２価以上の金属イオンと強く結合するため、 キレート剤としての機能を持っている。pH 調整食品添加物としても使用され、近年では抗癌 作用、抗酸化作用、メタボリックシンドロームの改善効果などが注目され、医薬品や保健機能 食品の素材としての利用も進んでいる。このような生体へのリスクの小さいキレート剤を歯科 保存学に応用する試みは妥当であり、また申請者によって初めて行われる試みであって、その 新規性を高く評価できる。本研究ではフィチン酸のキレート効果に注目し、象牙質表面処理と しての効果を象牙質接着強試験で評価して従来の歯面エッチング剤のリン酸と比較し、また歯 髄組織への影響をみるため、in vitro でのリン酸とフィチン酸の細胞毒性を比較した。使用す るフィチン酸の濃度と作用時間については十分な予備実験の後で決定しており、実験に対する 周到な配慮が窺える。1%フィチン酸と従来の歯面エッチング剤である 37%リン酸を用い、電 子顕微鏡での処理面観察、およびエッチアンドリンス接着システムでの微小引張試験を行った 結果、1%フィチン酸は歯面への作用時間 15 秒でも十分なスメアー層除去効果を有しており、 リン酸処理と比較して有意的に高い接着強さが認められた。MTT テストではリン酸に比較し 有意的に高い細胞活性がみられ、毒性が低いことが示された。以上よりフィチン酸は 1%の低 濃度でも十分なスメアー層除去効果があり、37%リン酸より毒性も低いとの結果が得られたこ とから、歯面処理剤としての臨床応用が大いに期待できる。 第三は、スメアー層を除去する目的で利用される根管洗浄剤としてのフィチン酸の検討であ る。1%フィチン酸を従来の根管洗浄剤の 17%EDTA と比較して、根管内スメアー層除去剤と しての効果、およびin vitro での細胞毒性を評価した。根管スメアー層除去効果を処理面の電 子顕微鏡観察にて調べた結果、1%フィチン酸の 30 秒処理は 17%EDTA の 60 秒処理よりも有 効と認められた。MTT テストを行ってフィチン酸と EDTA の骨芽細胞様細胞への毒性を調べ た結果、EDTA では毒性が認められたが、フィチン酸では細胞毒性が認められなかった。アル カリホスファターゼ（ALP）活性テストでも、EDTA では ALP 値の低下が見られたが、フィ チン酸は見られなかった。次亜塩素酸ナトリウム溶液（5%）との反応については、EDTA で はガスの発生と温度上昇が認められたが、フィチン酸では両者とも認められなかった。このよ うに本研究では従来の EDTA 処理を再検討してより有効で安全な根管洗浄剤としてのフィチ ン酸を見出しており、その斬新性を高く評価できるとともに、臨床応用の可能性もあるものと 評価できる。
以上より本論文において、NASSAR Mohannad Issa Michael は、グルタチオンに関して歯髄細 胞への毒性が危惧される HEMA から細胞を保護する機能を有し、マトリックス分解酵素の活 性化抑制作用も併せ持つこと、またフィチン酸に関してスメアー層除去に有効であるとともに 歯髄細胞様細胞および骨芽細胞様細胞への毒性が低いことを見出しており、十分な実験データ とその分析によりこれらの臨床的応用の可能性を示したものと高く評価できる。
学の進歩発展に大きく貢献するものと考えられる。よって本論文は博士（歯学）の学位請求論 文として十分価値のあるものと認められた。
